耐低溫生物脫氮機制與對策研究進展

陸浩良，田晴，朱艷彬，張健，焦彭博，林歡

（東華大學環境科學與工程學院，上海201620）

水中的氮（N）、磷（P）等營養元素的累積會引起富營養化，因此脫氮除磷是污水處理的重要任務。目前城市污水處理廠大多采用A2/O、氧化溝（oxidation ditch）或序批式活性污泥法（SBR）等生物處理工藝，雖然上述工藝能夠有效去除污水中的氮磷等元素，但如需保持較高的脫氮除磷效率，需要控制曝氣量與投加額外碳源[1]。為了降低運行成本，研究者從這兩個角度出發，提出了厭氧氨氧化（anammox）、同步硝化反硝化（SND）等工藝。然而以上所提及的生物處理法中功能菌的生存都依賴于適宜的溫度，例如硝化菌的最佳生長溫度為20～30℃。由于地理位置和季節的變化，難免有低溫環境存在，相關研究表明，長期的低溫環境非常不利于微生物的生長代謝和水中污染物的去除，低溫會導致微生物群落結構發生改變、生長速率下降、生理特性惡化等，使得出水氨氮和總氮不達標。尤其是在我國的北方地區，以東北地區為例，年均氣溫約為5℃，低水溫使得污水處理廠的出水氨氮和總氮很難達到生物處理的要求。針對上述原因，研究低溫條件下高效脫氮、掌握低溫硝化菌的脫氮性能，有利于提高污水處理廠的出水效果，具有重要的理論與現實意義。

1 低溫微生物

1.1 低溫微生物的分類

圖1 溫度對微生物生長的影響

不同種類的微生物適合不同的生長溫度，溫度對微生物生長的影響如圖1 所示[2]，通常溫度低于15℃便是低溫[3]。近年來，各國研究者對地球上各種水生和陸地寒冷環境中的低溫微生物進行了多方位的研究，低溫微生物的概念也隨著研究的深入在不斷地完善。自從1887年Forster首次發現在0℃條件下生長的微生物以來，先后出現描述低溫微生物的名詞多達十幾種。目前學術界普遍認可的是Morita[4]于1975 年給出的定義，他將這類微生物主要分為兩類：一類是必須生活在低溫條件下且最高生長溫度不超過20℃、最適生長溫度在15℃以下、在0℃可生長繁殖的微生物稱嗜冷菌（psychrophiles）；另一類其最高生長溫度高于20℃、最適生長溫度高于15℃、在0～5℃可生長繁殖的微生物稱為耐冷菌（psychrotrophs），適合用于低溫污水的生物處理。在污水生物脫氮中，耐冷菌與中溫菌起著關鍵的作用。

1.2 低溫微生物的耐低溫機制

低溫對細胞完整性、水黏度、溶質擴散速率、膜流動性、酶動力學以及生物細胞內外生物大分子之間的相互作用均會產生負面影響，進而對細胞功能產生不利的物理化學約束[5]。為應對低溫帶來的不利生長條件，低溫微生物已經進化出一系列的響應機制，使其能成功地抵消伴隨低溫出現的各種不利生長因素，如干燥、輻射、過度紫外線、高滲透壓和低營養等惡劣環境[6-7]。目前已被廣泛研究的耐低溫機制包括耐冷菌在低溫環境中對膜流動性的保持、表達冷休克蛋白、調整酶結構、積累相容性溶質等[8-9]。此外，有研究表明微生物產生的胞外聚合物（EPS）和胞內多聚物聚羥基脂肪酸酯（PHA）也可以用來抵御寒冷[10-11]。圖2是作者綜合了各類文獻中低溫微生物應對低溫生長條件所表現出的各類響應機制的研究成果[12]繪制的低溫微生物假想的細胞結構。

1.2.1 胞外聚合物（EPS）

圖2 綜合文獻研究結果所描繪的低溫微生物細胞結構

生物廢水處理系統中，微生物大多以聚集體的形式存在，例如污泥絮體、生物膜和顆粒污泥[13]。微生物生長繁殖過程中會分泌EPS[10]，分布于細胞表面，有利于微生物細胞的凝聚。EPS的主要成分為蛋白質、多糖、核酸、磷脂及腐殖質。韓曉云[14]發現，EPS 可以在外界碳源和能量不足的情況下，為微生物的生長提供能量與碳源；此外，EPS也可以幫助微生物抵御外界環境的變化，如抗滲透壓，協助微生物抵抗低溫等。Ma 等[15]在研究膜污染時發現膜的污染程度隨著溫度的降低而逐漸加劇，這個現象從側面反映出EPS 的含量與溫度成負相關。Nichols 等[16]研究了ACM025細菌在-2℃、10℃和20℃下的EPS 產生量，發現-2℃和10℃產生的EPS量約為20℃時的30倍，ACM025具有的耐低溫特性與其產生的大量EPS有一定相關性。He等[17]認為在一定溫度范圍內，高溫或低溫都將促使更多的EPS產生，因為高溫能加速酶促反應，從而導致更多的EPS產生，而較低的溫度則會刺激微生物分泌更多的EPS，這有利于微生物的聚集。有人在南極和北極采用宏基因組學研究發現了許多EPS生物合成基因[18]。此外，研究者還發現EPS的凝膠基質可以充當溶質的擴散屏障，通過減少溶質擴散來減小冷凍誘導的滲透壓和干燥損傷[19]。迄今為止，與其他耐冷機制相比，溫度對EPS影響的研究還比較少，在應對低溫方面的重要作用才剛剛開始被揭開，需要進一步研究以更好地了解EPS對微生物的作用機理及其生理生態功能與組成結構的關系。

1.2.2 聚羥基脂肪酸酯

聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate, PHA）是一類胞內多聚物，當碳源充足而營養元素（N、P、S、O）不足以保證細胞的正常繁殖時，細胞就會合成能量貯存顆粒[20]，可以把PHA看作是一個動態能量庫，當外界營養不足時，PHA 可以賦予微生物一定的生存能力和對外界各種環境變化的抵抗力。本文作者課題組研究發現，周期性地往反應器中投加高濃度的碳源能夠使很多具有脫氮、除磷功能的微生物富集PHA，從而增強脫氮除磷效果[21]。Inoue 等[22]認為PHA 作為一種能量貯存物質，能夠很好地抵御外界環境的變化。Ting等[23]通過蛋白質組學分析顯示S. alaskensis菌株在低溫條件下，與PHA 合成相關的酶的豐度會增加，以確保其在低溫下保持正常的生理功能。在各種各樣的PHA中，聚羥基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）是研究最廣泛的，Raiger-Iustman 等[24]分離并研究了南極菌株Pseudomonas extremaustralis，發現它能產生PHB，而PHB 正是其對抗包括寒冷在內的各種脅迫的碳源與能源功能性多聚物。目前為止，研究者已經從南極淡水和土壤中分離出了許多產PHA 的細菌菌株，這表明積累PHA 是許多細菌用來應對寒冷環境的策略之一。Sedlacek 等[25]發現細菌細胞中PHA 的存在顯著增強了它們在滲透壓不平衡時維持細胞完整性的能力，非嗜鹽細菌Cupriavidus necator由于PHA 的存在減少了滲透壓上升期間質壁分離誘導的細胞質膜損傷；在嗜鹽細菌Halomonas halophila中也觀察到了PHA 對低滲裂解的保護作用。以上實驗結果均表明了富含PHA 的細胞能夠比PHA 貧乏的細胞更有效地保持細胞完整性，PHA 能夠在極端環境（低溫、高滲透壓和高鹽度等）下保障微生物進行正常的生長代謝[26]。

2 生物脫氮工藝中功能菌的耐低溫機制

溫度是微生物生長最重要的因素之一，由于水溫的降低，污水處理廠中微生物的生化反應速率會下降，嚴重影響微生物的生長代謝，進而也會影響微生物對基質的利用效率[14]。例如硝化菌在20～30℃的常溫條件下，硝化速率為4.0～6.0 mgNO3ˉ-N/(gVSS·h)，而在10～16℃的低溫條件下，硝化速率則降至2.0～3.0 mgNO3ˉ-N/(gVSS·h)[27]。近年來，低溫脫氮研究方向的相關論文數量及分類如圖3 所示，其中生物膜工藝基礎上衍生的各種新技術是研究的重點。相比于生物脫氮來說，低溫對除磷的效果基本沒有什么影響[28]。甚至有報道稱，低溫下的除磷效果比高溫時還要好，有可能是因為低溫下某些微生物的活性受到了抑制，例如聚糖菌（GAO）不能在低溫下與聚磷菌（PAO）競爭碳源[29]。但也有研究表明低溫對生物除磷效果有一定的影響，主要有以下兩個原因，首先是在低溫條件下，微生物的生長代謝速率減緩，傳質速率下降；其次是低溫限制了反硝化菌的活性，導致系統內硝態氮積累，使得反硝化菌與聚磷菌競爭碳源[30]。

圖3 2010—2018年低溫生物脫氮研究方向的論文數量（Web of Science?2019 Clarivate）

2.1 AOA與AOB在廢水脫氮中的作用

水中的氨態氮轉化為硝酸鹽的過程稱為硝化反應。人們普遍認為硝化反應分為兩步，氨態氮首先被氨氧化古菌（AOA）和氨氧化菌（AOB）氧化成亞硝酸鹽，然后再被亞硝酸鹽氧化菌（NOB）進一步氧化成硝酸鹽，然而Daims 等[31]發現的全程硝化菌（comammox）推翻了100 多年來人們對硝化過程的認識，該菌直接可以將氨態氮轉化為硝酸鹽。有研究者對冬季污水處理廠中的AOA 與AOB 進行了檢測，發現它們可以在污水處理系統中共存[32]，但目前污水處理廠中comammox 的分布仍不清楚，若能清楚掌握comammox 的低溫生長特性，將是低溫污水生物脫氮研究的重大進展。目前已知的大多數AOA 的細胞體積普遍比AOB 的細胞小10～100倍，AOA 的氨氧化速率要比AOB 低10 倍[33]。AOA細胞特殊的四醚脂質膜比AOB 細胞膜的滲透性更低，相對于AOB，AOA 的無效離子循環量及其耗費的能量會更低，從而提供其適應極端環境的優勢。此外，根據冷凍電鏡中對細胞切片的斷層掃描數據分析，AOA 的核糖體數量眾多，使其能夠對環境條件的變化（如氨濃度波動）做出快速反應。與AOB 相比，大多數AOA 能高度適應低能量的環境。因此，若能在低溫或低溶解氧的廢水處理系統中有效地培養和富集AOA，則可能緩解寒冷地區污水處理廠頻發的硝化不良問題。

2.2 微生物群落結構的演變

溫度變化對微生物群落結構和物種豐富度有著顯著的影響[15]。由于溫度脅迫下微生物的敏感性和抗性會有差異，低溫可以改變生物廢水處理系統中的微生物群落結構，甚至會降低微生物群落的多樣性和物種豐富度，從而導致工藝性能惡化[34]。Zhou等[35-36]研究了三種溫度（25℃、15℃、10℃）下混合A/O反應器中的微生物群落變化與脫氮效率之間的關系，結果在門水平上共觀察到10 種目前已知的菌門，其中主要是變形桿菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋桿菌門（Nitrospirae）和厚壁菌門（Firmicutes）。盡管它們之間的差異比較顯著，但微生物群落結構在不同溫度下大體還是相似的。當溫度逐漸降低時，反應器中厚壁菌門的豐度一直穩定在2%以上，由于厚壁菌門在缺氧條件下可以利用硝酸鹽進行反硝化，因此該混合反應器的總氮效率仍維持在一個較高的水平。Wang 等[37]分別在冬季（約7℃）和秋季（約22℃）在安徽巢湖沿岸采集沉積物樣品，克隆和測序分析表明，微生物受不同環境因素的影響會呈現出不同的分布模式。大量的AOA 和厭氧氨氧化菌（anammox）表現出空間異質性，反硝化菌和異化硝酸鹽還原菌（DNRA）的數量比例也會隨著溫度的變化而改變。以上研究結果均表明了低溫對微生物結構有著顯著的影響。

2.3 低溫脫氮功能菌的發現

自從20世紀80年代初，Robertson和Kuenen首次從硫氧化水處理體系中分離出具有異養硝化功能的菌株以來，各國研究者相繼報道了各種低溫下具有脫氮功能的菌株與菌群。Zhang 等[38]在研究低溫脫氮時報道過Microbacteriumsp.SFA13這種菌能在5～8℃下進行異養硝化作用。秦必達[39]在此基礎上篩選出了假單胞菌屬（Pseudomonassp.） 中的Pseudomonas mohnii. M-8，其在2℃下仍具有良好的脫氮性能。Huang 等[40]在實驗室中分離出了Acinetobactersp. Y16，該菌株在低C/N 比和低溫條件下能有效去除氨氮，但沒有考察其在實際水處理工程中的穩定性。Yao 等[41]通過逐步增加溶解氧濃度成功富集和馴化了一種具有異養硝化-好氧反硝化功能的混合菌群，在10℃條件下，該菌群對氨氮和硝態氮的去除能力很高，在其富集過程中混合菌群的生物多樣性和群落結構也發生了改變。系統發育分析表明，Pseudomonaspp. 和Rhodoferax ferrireducens逐漸成為富集菌群中的優勢物種，其中前者在硝化-反硝化過程起主要作用，而后者則利用硝態氮作為其電子受體和氮源。路俊玲等[42]通過微生物連續富集分離，篩選得到了1株低溫下具有反硝化功能的菌株，將其命名為N3，并研究了其在低溫條件下的脫氮性能。結果表明，N3在C/N為8、4℃條件下，36h內即可將15mg/L硝酸鹽完全去除；反硝化基因narG 和nirS 的表達與30℃下的表達量處于同一個數量級；此外，固定化N3 菌株在連續運行54 天后仍保持良好的穩定性和脫氮效果。菌株N3 在低溫下具有的高效反硝化脫氮能力表明其在冬季硝酸鹽水體脫氮方面具有良好的應用潛力。

3 加強低溫脫氮效果的策略

調整工藝參數是保證低溫脫氮工藝運行效果的首選策略。當溫度降低時，通過增加水力停留時間（HRT）、污泥齡（SRT）和溶解氧（DO）等方法可以適當減輕低溫帶來的不利影響。此外，生物強化技術也是提高低溫污水處理效果的有效方法，將特定的耐冷菌株投入到污水處理系統中，可以顯著提高處理效果。近年來，生物強化技術已普遍應用于生活污水處理，來滿足寒冷地區對出水排放的要求。需要注意的是，有些功能菌株需采取包埋固定措施，以確保其保持正常的生物活性[43]。有報道稱，當AOB 和NOB 附著在載體生長時的活性要比懸浮生長培養的高[44]，因此生物膜技術通常被用來提高低溫污水處理效果，其中最常用的技術為移動床生物膜反應器（MBBR） 和曝氣生物濾池（BAF）。為了進一步提高低溫污水的處理效率，研究者們一直在尋找新的污水處理工藝/技術，如使用新型填料、改變碳源投加方式、投加特定的重金屬等。

3.1 新型填料富集脫氮功能菌

由于生物膜法在低溫時的脫氮能力較高，可根據特定的條件來選擇不同的填料促進工藝的耐低溫特性。生物炭具有微生物附著比表面積大、生物附著能力強和生物降解協同作用的優點。這些特點有利于提高微生物對底物的降解性能，緩解水力剪切作用，有助于維持高濃度的微生物[45]。微生物以生物炭作為載體，不僅提高了低溫下的脫氮效率，還增強了復雜可溶性有機物（多糖、蛋白質、核酸等）的水解和氨化作用，促進了溶解性有機物的去除[46]。艾勝書等[47]分別通過對海綿、鮑爾環、內置海綿與鮑爾環的懸浮球生物填料序批式生物膜反應器（SBBR）處理低溫污水進行了實驗研究。結果表明，在10℃條件下，內置海綿與鮑爾環的懸浮球生物填料處理效果最佳，COD、-N、TN、TP的平均去除率分別為87%、69%、60%、53%，且系統穩定，啟動速度快。但上述方法目前還處于實驗室小試階段，能否投入實際應用還有待證實。

3.2 投加碳源改善功能菌耐低溫特性

相容性溶質（CSs）是一種低分子量的有機化合物，其在細胞內發揮作用不需要酶進行特殊適應[48]。CSs 不僅可以調節高滲透壓，還可以緩解低溫、冷凍等環境壓力[49]。甘氨酸是CSs 的其中一種，Li等[50]通過在SBR中投加甘氨酸的研究，發現在15℃下投加了0.8mmol/L 甘氨酸的Candidatus Brocadia sinica具有良好的脫氮能力。苑宏英等[51]研究了不同碳源（丙酸鈉、甲醇、乙醇及乙酸鈉）對低溫投加氧化還原介體1,2-萘醌-4-磺酸鹽（NQS）污水生物反硝化脫氮過程的影響，發現把丙酸鈉作為碳源時的反硝化速率最高，達到了7mgNOxˉ-N/(gVSS·h)，分別是甲醇、乙醇和乙酸鈉為碳源時的8 倍、2.6 倍和3.6 倍；硝態氮的最大去除率為61.5%，分別是甲醇、乙醇和乙酸鈉為碳源時的6.9倍、9.3倍和4倍；總氮去除率為47.4%，分別是甲醇、乙醇和乙酸鈉為碳源時的5.2 倍、4.6 倍和4.6倍。以上研究均表明適合的碳源投加方式有助于解決低溫污水脫氮效率低的問題。

3.3 特定重金屬增強功能菌活性

銅(Ⅱ)、鋅(Ⅱ)和鐵(Ⅱ)是富氮廢水中最常見的金屬元素[52]，也是微生物生存所必需的微量營養素[53]。Zhang 等[54]研究了以上三種重金屬對厭氧氨氧化細菌（AAOB）脫氮、生物活性及群落結構的影響，結果發現在15℃左右往氨氮和亞硝態氮濃度都為50mg/L的進水中投加1mg/L重金屬后，短期暴露在1mg/L 的銅(Ⅱ)和鋅(Ⅱ)中對AAOB 是有益的，這是由于以上三種金屬元素是微生物生長活動所必需的；而長期暴露在1mg/L的銅(Ⅱ)和鋅(Ⅱ)中會使AAOB的活性受到抑制，降低其脫氮效率，這是由于EPS雖然能夠吸附金屬離子，阻礙金屬離子進入細胞內部[55-56]，但當EPS 承受的金屬離子達到飽和時，金屬離子會進入細胞，破壞蛋白質結構并引起酶的代謝紊亂。鐵(Ⅱ)在短期實驗中對AAOB 有輕微的抑制作用，但在長期接觸后會顯著增強氮的去除效果，因為EPS 對鐵(Ⅱ)的吸附能力高于銅(Ⅱ)和鋅(Ⅱ)，因此不像銅(Ⅱ)和鋅(Ⅱ)那樣會限制AAOB 的活性。銅(Ⅱ)和鋅(Ⅱ)使具有脫氮功能的Candidatus Kuenenia的豐度從7.99%降低至3.32%和3.80%，而鐵(Ⅱ)則將其豐度提高至11.30%。如何通過投加一定量的重金屬來提高低溫下的污水處理效果還處于起步階段，有待更多實驗數據的支持。

4 結語與展望

雖然低溫脫氮研究已經取得了一定的進展，但還存在以下幾個問題：①目前大多數研究成果主要還是停留在實驗室小試階段，缺乏實際工程運行的數據積累；②研究的水體主要是城市生活污水這方面，很少對工業廢水或垃圾滲濾液等高濃度氨氮廢水的研究；③菌種的研究大多集中在單個菌株，單一菌種很難滿足各種極端環境，若能將各功能菌混合在一起研究，效果應該會更好。

任何一種新工藝/技術都有其獨特的優勢，若能充分利用兩種或兩種以上的工藝/技術，這將大大提高污水處理性能，如A2/O 與曝氣生物濾池（BAF）的結合已被證實能在低溫下達到高效脫氮除磷的目的[57]。在低溫條件下高效處理污水還有很長一段路要走。在未來的研究工作中，可以從生物選擇、特異性功能菌的固定與使用、生物倍增技術與工程實際的結合來實現在較低成本下優化各種運行參數以提高低溫污水的處理效果。