污泥厭氧消化功能微生物群落結構的研究進展

唐濤濤，李江，2，楊釗，向福亮，王躍虎，李彥澄

（1貴州大學資源與環境工程學院，貴州貴陽550025；2貴州大學環境工程規劃設計研究所，貴州貴陽550025）

污泥作為污水處理廠的主要副產物，其產量在2017 年已達4.328×107t（含水率80%計）[1]。如何實現污泥的處理處置是當前污水處理廠面臨的一大難題。目前，有多種技術可對污泥進行資源化利用，如燃燒、熱解和厭氧消化[2]。但污泥在厭氧消化過程中僅有40%～50%的有機物質會轉化為甲烷，這不僅使污泥的厭氧消化效率較低，還會影響產氣量[3]。因為污泥中的胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）會把微生物細胞聚合成網狀物，使得EPS和微生物分別以物理、化學阻擋層的方式限制污泥的水解速率[4]。從而使得污泥厭氧消化反應器具有水力停留時間（hydraulic retention time，HRT）長（20～50 天）和占地面積大等缺點[4-5]。在厭氧消化過程中，營養物質、pH、溫度、C/N及微生物群落結構等因素均會對厭氧消化效率產生影響。其中，營養物質與微生物群落結構對提高消化效率起重要作用[6]。

近年來，隨著分子生物技術的不斷完善和發展，使得人們對厭氧體系中微生物的功能解析成為可能。本文綜述了污泥在厭氧消化過程中常見的微生物群落，以及它們在厭氧體系中發揮的作用；并分析溫度、營養物質、pH、氨氮（NH4+-N）等影響因素對厭氧微生物的影響，以期為提高厭氧消化效率提供參考借鑒。

1 常見的厭氧微生物群落分布

厭氧微生物目前尚無公認的準確定義，但通常認為厭氧微生物是只能在低氧分壓條件下生長，而不能在空氣中（18%氧氣）和（或）在10%二氧化碳下的固體培養基表面生長的一類微生物的總稱[7]。

1.1 細菌

污泥在厭氧消化過程中主要涉及水解酸化細菌和產甲烷古菌。其中，水解酸化細菌在污泥厭氧消化過程中發揮重要作用。因為水解細菌能將污泥中的碳水化合物、蛋白質和脂質轉化為簡單的溶解性單體物質，而酸化細菌能將水解產物進一步轉化為酸性產物（揮發性脂肪酸），從而為微生物的生長提供碳源。顯然，細菌不僅對污泥中有機物的水解和酸化起關鍵作用，而且還會影響厭氧消化的效率。以往的研究發現，古菌在厭氧體系中約占微生物總量的10%[8]。可見，細菌在微生物總量中所占比例高于古菌，所以細菌群落結構的變化會影響古菌群落[9-10]。根據Ahring[11]的報道，厭氧微生物至少涵蓋了20 個門的細菌， 包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、螺旋體門（Spirochaetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）等。在上述菌群中，Bacteroidetes和Firmicutes是水解過程中主要的菌群；Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes是酸化過程中主要的菌群[12]。 可 見 ，Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes群落的變化會對厭氧消化體系產生影響，這是因為它們是厭氧消化過程中的主要門分類[13-14]。

Bacteroidetes不僅是厭氧消化體系中的常見細菌類群，也是一種主要的產酸菌[15-16]。這是因為屬于Bacteroidetes的細菌在有機物降解過程中會產生各種裂解酶[13]，所以Bacteroidetes對復雜碳化合物具有降解作用[17]，如纖維素和半纖維素。而以往的研究發現，Bacteroidetes可將纖維素轉化為單糖(主要是葡萄糖)[18]及有機酸[19]，半纖維素轉化為D-木聚糖和葡萄糖[20]。且Bacteroidetes將半纖維素轉化為葡萄糖后會進一步對葡萄糖進行分解，這是因為Bacteroidetes是降解糖類的主要菌群[20]。因此，Bacteroidetes中大部分細菌能產生乙酸、丙酸、甲酸及丁二酸[21]，這也表明Bacteroidetes的分布與揮發性脂肪酸（VFAs）的濃度有關[21]。顯然，厭氧消化過程中Bacteroidetes豐度的變化會導致體系中的VFAs 濃度發生變化，從而對體系的pH 產生影響。

Proteobacteria和Chloroflexi作為厭氧消化體系中主要的細菌類群，在厭氧消化中也發揮著重要的代謝功能作用。由于Proteobacteria的類型比較復雜，因此Proteobacteria在環境中可作為不同角色參與物質代謝，并作為微生物群落的重要組成部分參與群落演替過程[22]。 以往的研究發現，Proteobacteria中的許多菌群不僅能利用葡萄糖、丙酸鹽、丁酸鹽等小分子化合物[23]；而且Proteobacteria在酸化過程中會產生乙酸作為主要的酸化產物[14]。同時，近年的研究也發現，當環境中存在有毒有害物質時會促進Proteobacteria的生長，如Luo 等[24]研究發現，當體系中存在菲時，Proteobacteria的豐度會從9.3%增加到13.0%。可見，當環境中存在有毒有害物質時，Proteobacteria仍具有較高的生存能力。Chloroflexi作為一種在污泥厭氧消化過程中常見的菌群不僅豐度較高，而且對單糖和多糖均具有降解能力，并產生乙酸[13]。同時，Chloroflexi對有機負荷具有較高的承受能力[25]。

在厭氧環境下，Firmicutes分布較廣，包含眾多重要的功能微生物，如梭菌綱、芽孢桿菌綱等[26]。在厭氧消化過程中，Firmicutes對有機物的水解和酸化具有重要作用[27]，這是因為Firmicutes能產生胞外酶，如纖維素酶、脂酶、蛋白酶及其他胞外酶，而這些酶在纖維素、蛋白質、半纖維素、脂質、糖類及氨基酸等有機物的分解代謝中扮演重要作用[28]，從而實現有機物的降解；且Firmicutes還能利用乙酸[29]。Lim 等[30]研究也發現，在厭氧消化過程中，細菌群落會由Proteobacteria轉變為Firmicutes。在眾多Firmicutes中的菌落中，梭菌屬（Clostridium）是一類嚴格的厭氧菌，在降解碳水化合物的同時會產生乙酸、丁酸等產物[31]。可見，Clostridium豐度的變化會對厭氧消化系統的pH 產生影響。而以往的研究也發現，Clostridium豐度的增加與pH的增加有關[32]。此外，Clostridium也能與氫型產甲烷菌互相作用以實現有機酸的降解[33]。與Clostridium相似，芽孢桿菌（Clostridia）在厭氧條件下也能利用溶解性有機物產生VFAs[34]。但Clostridia不僅能有效降解結構復雜的有機物，而且還能使乳酸或乙酸發酵為氫氣（H2）和二氧化碳（CO2）[8,14,35]，為氫型產甲烷菌的生長提供能源。

除Chloroflexi、Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes外，厭氧消化體系中還存在部分豐度較低的門，如Cloacimonetes、Spirochaetes、酸桿菌門（Acidobacteria） 和 放 線 菌 門（Actinobacteria）、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Ignavibacterium等菌群。其中，Cloacimonetes對有機物具有水解和酸化能力[36]；Acidobacteria在厭氧條件下可將纖維素降解并產生乙酸[37]；Actinobacteria中的部分菌屬會產生丙酸[14]；而Spirochaetes能將碳水化合物或氨基酸轉化為乙酸、氫氣（H2）和二氧化碳（CO2）等[38]。此外，有研究也指出Spirochaetes、Planctomycetes、Lentisphaerae、Deferribacteres和Verrucomicrobia等菌落對有毒有害物質具有一定的促進作用，如多環芳烴（PAHs）、二氯甲烷、原油中污染物和含氯乙烯[39-40]。同時，嗜溫化學異養的細菌Ignavibacteriumsp.可以提高厭氧污泥的降解性能，是推動厭氧降解的主要參與者[41-42]。

1.2 古菌

在厭氧消化過程中，水解和酸化階段均有細菌參與，而產甲烷階段完全由古菌參與。產甲烷代謝途徑的本質是產甲烷菌利用細胞內一系列特殊的酶和輔酶將CO2或甲基化合物中的甲基通過一系列的生物化學反應還原成甲烷[43]。產甲烷菌根據產甲烷途徑主要分為三種類型，即乙酸型、氫型和甲基型產甲烷菌。其中，大多數的甲烷主要是通過乙酸型和氫型產甲烷菌作用所產生[44]。以往的研究發現，甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷絲菌屬（Methanosaeta）和Methanomicrobium是主要的產甲烷微生物[45-47]。除上述菌屬外，在厭氧反應器中還會檢出Methanobacteriaceae、Methanospirillaceae、Methanomicrobiaceae、甲 烷 嗜熱桿菌屬（Methanothermobacter）、甲烷螺菌屬（Methanospirllum）、Methanoculleus和Methanomassilliicoccus。其中，Methanosarcina和Methanosaeta均屬于乙酸型產甲烷菌。Methanosarcina屬于多功能的產甲烷菌，即具有乙酸型產甲烷菌的能力，又具有氫型和甲基型產甲烷菌的能力；故Methanosarcina能利用乙酸、甲醇、甲胺、二甲胺和H2/CO2產生甲烷[48]；且Methanosarcina也是唯一一種能通過上述三種途徑產生甲烷的菌種[49]。同時，Methanosarcina對揮發性脂肪酸（VFAs）和有機承載率（OLR）具有較高的承受能力[50]。在厭氧環境下，隨著乙酸濃度的變化會使得Methanosarcina和Methanosaeta豐度發生變化。以往的研究表明，高濃度的乙酸環境適于Methanosarcina生長， 而低濃度乙酸適于Methanosaeta生長[51-52]。近年的研究也發現，當乙酸濃度在250～500mg COD/L 時，Methanosarcina為主要菌種[48]。

除Methanosarcina和Methanosaeta屬于乙酸型產甲烷菌外， 在已檢出的產甲烷菌中，Methanothermobacter、Methanoculleus、Methanospirllum、Methanobacterium、Methanobacteriaceae、Methanospirillaceae、Methanomicrobiaceae和Methanobrevibacter為 氫 型 產甲烷菌，主要利用H2/CO2或甲酸生成CH4氣體[53-58]。而Methanomassiliicoccus為甲基型產甲烷菌，主要利用甲醇（或甲胺）與氫作為電子供體產生CH4氣體[59-60]。可見，厭氧消化反應器中的優勢古菌主要集中在乙酸型和氫型產甲烷菌，它們的共同特點是能夠利用細菌的分解產物（乙酸、氫氣等）產生甲烷。

2 微生物群落結構變化的影響因素

在不同條件下，微生物的群落結構存在較大的差異。其中，溫度、營養物質、pH、氨氮(-N)及物質中含有的有毒有害物質等因素均會對厭氧消化過程中的微生物群落產生影響。

2.1 溫度

目前，對厭氧消化的研究主要集中在中溫（30～40℃）和高溫（50～60℃）條件。與中溫厭氧消化相比，高溫厭氧消化具有一些優勢，如具有較高的代謝速率、使病原體失去活性以及更高的產氣量[61]。但在高溫條件下進行厭氧消化會使得體系中的揮發性脂肪酸（VFAs）（尤其是丙酸）濃度較高，而中溫厭氧消化則能夠維持較高的有機負荷率（OLR）[62]。同時，由于VFAs的逐漸積累又會導致發酵細菌和產甲烷古菌的群落結構發生變化[63]，從而影響厭氧消化的進行。Guo 等[64]研究發現，溫度對微生物群落多樣性的影響明顯強于OLR。當溫度為35℃時，厭氧體系中的微生物多樣性高于45℃和55℃時。Wu等[65]研究了餐廚垃圾在高溫（55℃）厭氧消化啟動階段微生物群落的適應性，發現Firmicutes的相對豐度逐漸增加，而Proteobacteria和Thermotogae的相對豐度則降低，Methanosarcina菌群增加。同時，有研究也發現，溫度的變化也會對產甲烷菌的生長產生影響。如Methanobrevibacter和Methanosarcina最適溫度范圍分別為37～39℃和35～40℃，而Methanothermobacter thermoautotrophicum（嗜熱自養甲烷桿菌）為65～70℃。Methanobacterium和Methanosaeta種屬在中溫和高溫條件下都能生長[66]。

2.2 營養物質

營養物質的差異對厭氧微生物群落結構的形成具有重要的影響。由于部分廢棄物的碳氮比(C/N)較低不利于厭氧消化的進行，因此會向體系中添加營養物質提高消化性能。Tang等[67]研究發現，向污泥中添加不同類型秸稈會對污泥厭氧消化體系中的微生物產生影響。 其中，Bacteroidetes、Proteobacteria、Firmicutes、Chloroflexi、Cloacimonetes（細菌）和Bathyarchaeota（古菌）菌群的變化最為顯著。無論何種類型秸稈的添加均會促進Bacteroidetes、Cloacimonetes和Bathyarchaeota的 生長，但秸稈類型的變化會對不同菌群產生不同的促進作用，如小麥秸稈對Bacteroidetes的促進能力較強，玉米秸稈對Cloacimonetes的促進能力較強，水稻秸稈對Bathyarchaeota的促進能力較強。與此同時，小麥秸稈對Proteobacteria的抑制作用較強，水稻秸稈對Firmicutes的抑制作用較強，玉米秸稈對Chloroflexi的抑制作用較強。李新[68]的研究也發現，向污泥中添加纖維素也會對微生物群落產生影響。其中，Aminicenantes的變化最為顯著，并隨著纖維素添加量的增加而減少。由此可見，營養物質類型的不同會對厭氧體系中的微生物群落結構產生影響。Mata-Alvarez等[69]通過對共消化的分析也發現，細菌群落結構容易受到原料比例的影響，而甲烷菌更易受到環境條件（如VFAs和氨氮濃度）的影響。

2.3 pH

厭氧微生物的生長、物質代謝與pH 有密切的聯系，因此pH 的變化直接影響著厭氧消化的進程和產物，不同微生物對pH 的要求不同，過高或過低的pH 均會導致水解菌和產甲烷菌的活性產生變化，從而影響厭氧消化的穩定運行。在pH 迅速調至5.5 的酸化厭氧消化反應器中，細菌和古菌群落發生了顯著演替。在開始的13 天內，產甲烷菌的數量從34%降至8%，71 天時降至2%～5%[70]。在酸化的反應器中，細菌的數量也會明顯減少[71]。酸堿的急劇變化能引起厭氧消化反應器運行效率的顯著下降，其內在原因是對酸堿耐受性差的微生物種群數量和活性受到抑制，相關的代謝功能出現衰退。Romsaiyud等[72]研究表明，水解菌的最適pH范圍在5.3～8.3 之間，過低pH 會對水解菌產生離子毒性，從而影響水解酶的活性[73]。此外，產甲烷菌對pH 也極其敏感；以往的研究發現，產甲烷菌的最佳生長pH 應在6.5～8.2 之間[74]；若pH 低于該范圍，會抑制產甲烷菌活性，當pH低于6.2時會對產甲烷菌產生毒害作用[75]。

2.4 氨氮（ - N）

2.5 有毒有害物質

2.6 攪拌

攪拌技術作為一種改善傳質效果、解決物化及生化反應過程中物料混合效果不均勻等問題的手段，攪拌在厭氧消化過程中發揮著重要的作用[86]。李志華和張亞婷[87]研究發現，攪拌系統中RNA/DNA（以熒光的相對面積表征）和脫氫酶活性均高于無攪拌系統，實驗結果表明適度攪拌可以提高污泥厭氧消化系統中微生物活性。段小睿等[88]研究發現，當攪拌速率為60～80r/min 時有利于污泥的水解酸化；可見，在該攪拌速率下有利于水解酸化細菌的生長。而Cubas 等[89]研究結果表明，當攪拌速率為800r/min 時可達到最佳的厭氧消化效果。顯然，攪拌技術有利于促進厭氧體系中微生物的活性，從而提高厭氧消化效率。但也有研究發現，在攪拌過程中會導致反應器中物料濃度存在分布不均的現象，使得反應器中局部地區物料濃度過高，最終抑制細菌的活性[90]。

3 分子生物技術在微生物研究中的運用

隨著分子生物學的快速發展，使分子生物學技術廣泛地應用于分析活性污泥中的微生物群落結構。其中，使用非傳統培養的方法進行直接分析活性污泥微生物的多樣性，可以較為真實地反映環境樣品中微生物群落結構。當前，常用的分子生物技術主要包括：末端限制性酶切片段長度多態性分析技術、克隆文庫技術、高通量測序技術等。

3.1 末端限制性酶切片段長度多態性分析技術(T-RFLP)

T-RFLP 技術是由RFLP 發展而來的方法，又稱16S rRNA 基因的末端限制性片段，它是將聚合酶鏈反應（PCR）引物中的一條加以熒光標記，對擴增產物用限制性內切酶進行切割并電泳，根據片斷的大小不同以及標記片斷種類和數量的不同來分析群落的結構及組成[91]。T-RFLP 技術不僅具有快速、高度的可重復性、良好的可操作性等優點，而且還能與適當的數據庫建立直接聯系，快速準確地得到有關微生物的重要信息和評估菌株間微妙的基因差別，便于揭示微生物群落的結構和功能[92]。雖然T-RFLP 技術具有許多優點，但仍存在部分缺點。如對短片斷分析能力較弱、步驟較多和酶切條件難以控制[93]，因此使整個種群的多樣性被大大低估，從而影響計算結果和分析指數的準確度[94]。同時，由于數據庫中功能基因庫的不完善，使得某些出現在T-RFLP中的RTF可能找不到匹配的對象[95]。

3.2 克隆文庫技術

克隆文庫技術不僅能用于分析樣品中微生物的種類及所占比例，而且還能檢測實驗室內無法培養的微生物，再對文庫中的基因序列進行測定，最終獲得樣品中所含基因的種類和相對數量[96]。目前克隆文庫技術已經廣泛應用于環境中微生物的研究，常用的是核糖體RNA 基因克隆文庫的構建，主要包括16S rDNA基因克隆文庫、真菌18S rDNA基因克隆文庫及真菌ITS 基因克隆文庫。其中，16S rDNA 克隆建庫技術較成熟；但該技術具有成本較高、操作復雜、耗時較長的缺點，而且克隆數目對于環境中的微生物多樣性有較大影響[96]。

3.3 高通量測序技術

高通量測序技術被稱為下一代測序技術（next generation sequencing，NGS）[97]，不僅能一次并行測定幾十萬到幾百萬條DNA 分子的序列，而且還能深入、細致分析一個物種的基因組。雖然高通量測序技術已發展到第三代，但由于第二代測序技術具有重復性好、精確性高、不需構建文庫、無克隆誤差等優點，因此第二代測序技術仍然被廣泛應用于環境中微生物多樣性的檢測。此外，二代測序的測序廣度和深度也較克隆文庫技術大大提高，尤其是提高了數量上占少數的微生物群落的覆蓋，這不僅能揭示微生物群落的組成變化，還能從更細的微生物分類水平上顯示微生物群落的具體變化[98-101]。當前，第二代測序技術主要是應用羅氏454公司的GSFLX測序平臺[102]、ABI公司的SOLID測序平臺[103]和Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer 測序平臺[104]。與第二代測序技術相比，雖然第三代測序技術能縮短運行時間和提高數據讀取速度，而且在測序過程也無需進行PCR 擴增[105]。但該技術尚未成熟，因此在國內外測序公司中運用較少。

4 展望

通過了解厭氧消化體系中微生物群落結構的演替，不僅有助于保證厭氧消化體系的穩定和高效運行，而且還對進一步提高厭氧消化體系的性能具有重要的理論意義。同時，對厭氧體系中功能微生物特性的挖掘，還能夠發現具有降解有毒有害物質功能的新型微生物；從而促進微生物修復技術的應用。近年來，隨著蛋白質組學、宏基因技術和穩定同位素探針技術等分子生物學技術的不斷發展，對部分有毒有害物質具有降解能力的厭氧功能微生物逐漸被發掘。雖然厭氧消化體系中功能微生物的研究取得了不同程度的進展，但仍有大量菌群尚未確定，尤其是細菌中含有大量尚未分類的菌種；這極大地限制了關于功能微生物的研究。目前研究熱點主要集中在重要功能微生物種群隨環境條件的變化趨勢、群落結構和功能之間的關聯、營養物質對厭氧微生物種群結構影響以及主要門類微生物的功能等方面。就未來發展趨勢而言，今后的研究主要集中在以下幾個方面：①采用蛋白質組學、宏基因技術和穩定同位素探針技術來深入了解厭氧體系中對有毒有害物質具有降解效能的功能微生物，并完善功能微生物的培養技術，以便于揭示微生物的生理生化特性；②可通過篩選和培養厭氧體系中出現的新型微生物，并將其進行分離培養以分析該菌屬在厭氧體系中的功能；③深入分析現有厭氧消化體系中已檢出豐度較低的菌屬，揭示該菌屬在體系中的功能。