外泌體中miRNA 介導動脈粥樣硬化及中藥干預作用的研究進展

趙立鳳 俞 琦 于紅紅 田維毅

（貴州中醫藥大學， 貴州 貴陽550002）

動脈粥樣硬化（AS）是一種常見的慢性炎癥性疾病，其基本病變是在動脈內膜面形成斑塊，有脂質條紋、纖維斑塊和粥樣斑塊，繼續加重可出現鈣化、粥樣潰瘍形成、血栓形成和斑塊內出血等繼發性病變，尤其后2 種都是心腦血管事件的常見因素［1］。外泌體（exosome）廣泛存在于人體體液中，可通過細胞間通訊將信息傳遞給鄰近或遠距離的靶細胞，miRNA 是外泌體中的一種內容物，在調控細胞生物學行為反應以及基因靶標的表達方面發揮重要作用，可作為關鍵的信號傳導和分子調控途徑參與AS 的發生發展。近年來，外泌體對AS 的影響方面的研究日益增多，它可通過調節炎癥反應、內皮細胞凋亡、巨噬細胞極化、血管平滑肌細胞表型轉化及血小板活性等多個方面參與AS的發生發展過程，本文對此進行綜述。

1 外泌體的命名及功能

1986 年，Trams 和Johnstone 在綿羊網織紅細胞上清液中發現的物質命名為外泌體［2］，是由活細胞衍生的直徑為30～100 nm 的膜性囊泡［3］，不同來源的細胞類型在正常或病理狀態下均可分泌［4］。外泌體內含有微小 RNA（miRNA）、rRNA 和蛋白質等物質，能夠在細胞間進行信息傳遞，是腫瘤、心血管疾病的標志物。外泌體作為細胞外囊泡、細胞的重要信息載體，參與調控細胞的生理活動。

2 外泌體中的miRNA

miRNA 是外泌體中的一種內容物，是一組廣泛的非編碼單鏈小RNA 分子，截至目前，在動物、植物和病毒中已經發現有2 萬多個。miRNA 可減少mRNA 的轉錄，并在轉錄后的基因表達過程中及調控細胞分化、發育、增殖以及凋亡等多個細胞生物學行為反應方面發揮著重要作用［5］。miRNA 可調節基因靶標（例如癌基因和腫瘤抑制基因）的表達，并充當具有mRNA 結合和切割的基因抑制因子。在病理情況下，不同細胞來源的外泌體中miRNA 的表達水平有所差異［6］，因此，miRNA 是近年來探究AS 發病機制及治療靶點的一個研究熱點。

3 外泌體中miRNA 對動脈粥樣硬化的調節

大量研究表明，AS 是由多種內在因素相互作用所致的慢性炎癥性疾病，當前也有越來越多的研究認為其還與外泌體通過外來途徑的影響密切相關［7］。但在AS 發生發展進程中，不同來源細胞分泌的外泌體中miRNA 具有不同甚至相反的作用，其中一部分促進，一部分抑制。在后續的研究中探索清楚是哪些外泌體在AS 發生發展過程中起作用，這對診斷和治療具有重要意義。

3.1 外泌體中miRNA 對炎癥反應的影響 慢性炎癥貫穿AS 發生發展的整個過程，是一個關鍵因素，但是其具體機制尚未明確，有研究發現外泌體中miRNA 可能是炎癥反應過程中重要的一環。Wang 等［8］發現，THP?1 衍生的巨噬細胞中miR?9 的靶基因為JAK1 和MMP?13，miR?9 可通過JAK1／STAT1 信號通路抑制NLRP3 炎性體的激活并減輕AS炎癥。因此，miR?9 可以作為AS 的潛在治療靶標。另有研究表明，MiR?188?3p 可減少ApoE-／-小鼠的血管內脂質積聚，減輕巨噬細胞的炎癥反應，減少促炎因子的表達，同時增加ABCA1 和KLF2 水平，此實驗通過研究miR?188?3p對巨噬細胞炎癥反應和氧化的抑制作用，發現了一種新的AS 潛在療法［9］。

另一方面，有研究發現外泌體也具有促炎作用。THP?1 源性巨噬細胞中miR?134 通過ANGPTL4／LPL 途徑促進脂質積聚和促炎性細胞因子的分泌，從而加劇AS 的發生發展。因此，靶向miR?134 可能為預防和治療AS 性心血管疾病提供了新的策略［10］。

綜上所述，外泌體中的miRNA 部分能夠抑制炎癥反應的發生，部分能夠誘導炎癥反應的發生，通過增強或抑制炎癥反應，從而相應的加劇或延緩AS 的發生發展。

3.2 外泌體中miRNA 調節血管內皮細胞凋亡 miRNA 作為一種小分子調節物質，可表達于血管內皮細胞，在調節血管的生理病理過程中發揮重要作用。Burger 等［11］研究發現，內皮集落形成細胞衍生的外泌體中富含miR?486?5p，能夠靶向抑制腎臟組織在I／R 條件下張力蛋白同源物的表達水平，阻止其通過AKT 通路誘導內皮細胞的凋亡。另有研究發現，平滑肌細胞衍生的外泌體可以通過介導miR?150 轉移來控制內皮細胞的遷移［12］，從而保護血管內皮細胞。此外，在ApoE-／-小鼠的As 模型中還發現血管內皮細胞中的miR?126 可以減少斑塊面積［13］。

與之相反，也有研究表明外泌體中的miRNA 可導致血管內皮細胞凋亡，引起內皮功能障礙。Goodwin 等［14］對外泌體中膿毒血癥相關miRNA 進行分析，結果顯示膿毒血癥患者的miR?34a 表達較健康人顯著升高，而miR?15a 和miR?27a 有所下降，說明外泌體誘導了內皮細胞的衰老與凋亡。

綜上所述，外泌體對內皮細胞凋亡具有雙向調節作用，其功能的體現可能與所來源的細胞種類、細胞內部攜帶的具體成分和不同類型及強度的外界刺激有密切關系。

3.3 外泌體中miRNA 調節巨噬細胞極化 巨噬細胞在不同刺激因素的作用下，為滿足機體的不同需求可轉化成具有不同功能表型的巨噬細胞，這個過程稱為極化。Yang等［15］研究表明，miR?216a 通過激活端粒酶Smad3／NF?κB促進M1 型巨噬細胞極化和AS 進展。Zhuang 等［16］發現，巨噬細胞中miR?223 能夠促進小鼠巨噬細胞炎癥因子的表達，通過抑制Pknox1 促進M1 型巨噬細胞極化，是關鍵調節劑。研究發現，巨噬細胞中miR?378a 通過直接或間接方式調節信號調節蛋白α（SIRPα）介導巨噬細胞的吞噬和極化作用，這可能為促進巨噬細胞的膽固醇逆向轉運和抑制AS 的進展提供了新的途徑［17］。

3.4 外泌體中miRNA 調節血管平滑肌細胞表型轉化 血管平滑肌細胞（VSMC）在生理情況下的表型為收縮型，在一定的內外因素刺激下，VSMC 表型由收縮型轉化為合成型，是AS 發生發展的一個重要因素。miRNA 是VSMC轉化的分子開關，可以通過影響轉錄因子調節VSMC 表型轉化。Cheng 等［18］通過研究體外培養的大鼠VSMC 和體內球囊損傷的大鼠頸動脈，證實miR?145 可上調鈣調蛋白及平滑肌肌動蛋白等VSMC 分化標志物基因的表達，是一種新的表型標記和VSMC 的新的表型調節劑。Torella［19］等發現，miR?133 在體外和體內VSMC 實驗中均表達增強，是VSMC 表型轉化的一個重要調節因子，能有效抑制VSMC表型轉化。

3.5 外泌體中miRNA 調節血小板活性 血小板活化、黏附和聚集亦是AS 發病機制的重要環節。通過對As 患者服用抗血小板藥物阿司匹林的研究中發現，血小板外泌體中的miR?126 和miR?223 的表達水平均降低［20?21］。有研究選取了血小板中miR?200b、miR?495、miR?107 這3 種miRNA與其相應的靶基因相結合，發現三者均可通過調節相關蛋白的表達影響血小板活性［22］。這些研究表明，部分miRNA能夠調節血小板活性，有望成為AS 治療的潛在標志物。

4 外泌體負載中藥對動脈粥樣硬化的防治及對其他疾病的影響

中藥可通過多途徑、多位點對靶器官進行調控，從而達到預防、治療疾病的目的。外泌體有膜包裹，所運載的物質不會輕易被蛋白降解，這對中藥發揮更好的療效具有重大意義。

4.1 姜黃素 姜黃素是來自植物姜黃（姜科）的根莖中的一種天然多酚，長期以來被用于治療炎癥相關的疾病。研究發現，負載有姜黃素的外泌體能夠通過載脂蛋白A1與ATP 結合盒蛋白A1 介導途徑使細胞內的低密度脂蛋白流出量增加，可降低細胞內膽固醇水平，并且還發現由外泌體搭載的姜黃素的藥物療效增加［23］。Ma 等［24］發現，姜黃素不僅能有效抑制LPS 誘導的細胞因子TNF?α、IL?6 的表達，還可抑制RAW264.7 巨噬細胞與THP?1 源性巨噬細胞中miR?155 的表達；通過阻斷PI3K／AKT 信號通路，可導致miR?155 水平降低，說明姜黃素抑制LPS 誘導的炎癥反應的作用可能與抑制miR?155 的表達有關。

4.2 補陽還五湯 補陽還五湯在臨床上用于治療偏癱和中風，最近研究發現，該方干預骨髓間充質干細胞（MSCs）衍生的外泌體時，能激活血管內皮生長因子的表達，誘導miR?126 的表達，抑制miR?221 和miR?222 的表達。另外，在大鼠雙側頸動脈結扎后，補陽還五湯干預的MSCs 的外泌體可以促進大鼠Ki?67 和腦內血管內皮生長因子的表達，使血管密度增加，可促進缺血區腦血管的生成，改善缺血癥狀［25］。

4.3 丹皮酚 丹皮酚是一種從中藥牡丹皮中分離出來的活性化合物，可調節血細胞功能和保護血管細胞的損傷，已被證明具有抗AS 的作用［26］。Liu 等［27］在體內實驗中證實，丹皮酚抑制了ApoE?／?小鼠AS 的發展，增加了miR?223 的表達，抑制了STAT3 通路；在體外實驗中，丹皮酚抑制了HUVECs 中的炎癥分泌、黏附和STAT3 的表達，可在miR?223 抑制劑轉染入THP?1 細胞后逆轉，說明丹皮酚可以通過增加HUVECs 中miR?223 的表達，降低HUVECs 中IL?1β、IL?6、ICAM?1、VCAM?1 的表達，并減輕THP?1 細胞與HUVEC 的黏附，從而抑制AS 的發生發展。

4.4 紫草素 紫草素是從中藥紫草中分離出的萘醌，可通過減弱氧化應激抑制炎癥反應、抑制DNA 拓撲異構酶的活性等機制抑制腫瘤細胞生長［28］。Wei 等［29］分析了乳腺癌細胞MCF?7 衍生的外泌體中的miRNA 譜，發現一些miRNA在外泌體中被特異性分選和豐富。通過敲除外泌體中最豐富的miRNA 和MCF?7 增殖試驗發現，外泌體中miR?128 負調節MCF?7 受體細胞Bax 水平，并抑制細胞增殖。這些結果表明，紫草素通過減少腫瘤細胞來源的外泌體miR?128的表達抑制MCF?7 的增殖。

4.5 三七總皂苷 三七是屬于五加科的一種中藥，臨床上常用于心腦血管疾病方面的治療，三七總皂苷（PNS）已被證實是藥材發揮心臟保護作用的主要有效成分。PNS 可顯著減弱異丙腎上腺素（ISO）誘導的心肌損傷和纖維化，在ISO 處理的小鼠心臟中miR?29c 表達顯著降低，而PNS處理后其表達增加，表明PNS 的心臟保護作用可能是由于升高miR?29c 表達所致，這可有助于加強對PNS 治療心血管疾病活性的理解［30］。

4.6 甘草 Xiang 等［31］從甘草煎劑中提取miRNA 和合成的miRNA 模擬物，用于干預從健康志愿者分離的外周血單核細胞，通過RT?PCR 分析Toll 樣受體、轉錄因子、信號分子和細胞因子的基因表達，結果顯示甘草miRNA 通過抑制參與T 淋巴細胞分化、炎癥和凋亡基因的表達，可以顯著調節外周血單核細胞。

5 總結與展望

外泌體可通過調節炎癥反應、內皮細胞凋亡、巨噬細胞極化、血管平滑肌細胞表型轉化及血小板活性等多個方面參與AS 發生發展過程，其中miRNA 在AS 病理過程中扮演著重要角色，已引起越來越多研究者的關注。研究表明，外泌體中的miRNA 的表達水平既可以調控AS 發生發展進程，也可以反映其療效。中醫藥以整體觀念及辨證論治為指導，通過多位點、多途徑整合起效，對于復雜性疾病的治療具有獨特優勢。然而，目前國內外對外泌體負載中藥治療AS 的研究幾乎處于空白狀態，故更深入地研究外泌體中miRNA 在AS 過程中的作用機制，并將其作為中藥有效成分的載體，可能是相關診斷和治療的新型生物標記物，以及相關研究新的著力點和新靶標，還可能使miRNA 成為藥靶，或模擬miRNA 進行新藥開發，具有很大的探索潛力和應用價值。