紫草素抗婦科惡性腫瘤作用機制的研究進展

徐歡歡 柯麗娜 陳琴華 李 斌?

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)， 遼寧 錦州121000； 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院婦產(chǎn)科， 湖北 十堰442008；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院， 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室， 湖北 十堰442001）

近年來婦科惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，嚴重危害女性生命健康。婦科惡性腫瘤主要包括宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、絨癌，目前婦科惡性腫瘤的治療方法主要有手術(shù)、化療和放療，其中化療在婦科惡性腫瘤的治療中占有重要地位。臨床常用的化療藥物很多來源于植物提取物，如紫杉醇、黃連素、黃酮、長春新堿等。紫草是傳統(tǒng)中藥材，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》 記載它具有涼血、活血、解毒透疹等多種功效［1］，紫草素是從根莖中分離得到的一種萘醌類化合物，具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種功效，尤其是其抗腫瘤作用已被大量研究所證實［2?8］。近年來有大量關(guān)于紫草素抗婦科惡性腫瘤的研究，本文針對其抗癌機制研究進展予以綜述。

1 抑制腫瘤細胞增殖

1.1 雌激素?雌激素受體（ER）信號通路 雌激素可促進女性第二性征的發(fā)育，建立并維持生殖功能，除此之外還可以調(diào)控細胞的生長、分裂及分化等多種生理過程［9］。雌激素各種功能的發(fā)揮主要通過與細胞內(nèi)的ER 結(jié)合實現(xiàn)，ER 包括ERα、ERβ 和G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體（GPER），信號異常會導(dǎo)致各種疾病發(fā)生，如子宮內(nèi)膜癌（EC），占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，其中近80%為雌激素依賴型腺癌（I 型）［10］。黃彩梅等［11］研究發(fā)現(xiàn)，紫草素通過抑制雌激素信號通路中的ERα 的表達，從而抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞的增殖，作用呈時間濃度依賴性。

1.2 阻滯細胞周期進程 研究發(fā)現(xiàn)紫草素可以通過調(diào)控腫瘤細胞周期相關(guān)蛋白表達，阻滯周期進程，進而發(fā)揮抑制腫瘤增殖的作用。楊陽等［12］研究發(fā)現(xiàn)紫草素可使人宮頸癌SiHa 細胞阻滯于G0／G1期，其誘導(dǎo)G0／G1期阻滯的分子機制可能與細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）相關(guān)。馬海鷗等［13］研究發(fā)現(xiàn)紫草素可使人絨癌耐藥細胞株JAR／MTX 細胞G0／G1期細胞比例增高，S 期和G2／M 期細胞比例降低。有研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌Hela 細胞中，紫草素、β?羥基異戊酰紫草素（β?HIVS）可使Hela 細胞周期分布發(fā)生變化，使細胞阻滯于S 期［14?15］。尹雯［16］發(fā)現(xiàn)紫草素可將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞阻滯于G0／G1期，從而顯著抑制Ishikawa 細胞增殖。

1.3 誘導(dǎo)腫瘤細胞活性氧的生成 活性氧簇（reactive oxy?gen species，ROS）是需氧細胞在有氧代謝過程中生成的一類擁有較高活性、化學(xué)性質(zhì)非常活潑的含氧類物質(zhì)。ROS含有未成對電子，有很高的反應(yīng)活性，過度的氧化應(yīng)激ROS 堆積能夠產(chǎn)生細胞毒性，引起細胞內(nèi)脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的損傷，致使細胞功能障礙，導(dǎo)致細胞生長抑制甚至死亡［17］。有研究發(fā)現(xiàn)［18］紫草素呈劑量依賴性抑制人宮頸癌Hela 細胞增殖，線粒體膜電位的改變和內(nèi)源性活性氧的生成是紫草素抑制人宮頸癌Hela 細胞增殖的作用機制之一。

1.4 FAK 信號通路 局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種多功能的非受體酪氨酸蛋白激酶。在大部分細胞中表達，既可作為細胞的骨架蛋白保護細胞，又可調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育和凋亡［19］。抑制FAK 的表達能夠?qū)⒓毎铚赟 期，干擾細胞向有絲分裂階段進展，從而起到抑制細胞增殖作用［20］。研究發(fā)現(xiàn)［21］紫草素能夠呈濃度依賴性地降低Hela 細胞中FAK 蛋白和mRNA 的表達，使FAK 磷酸化水平降低，從而抑制宮頸癌Hela 細胞的增殖。

2 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是一種由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制之一。紫草素誘導(dǎo)婦科惡性腫瘤細胞凋亡機制是當前的研究熱點。

2.1 Bax 和Bcl?2 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 Bcl?2 基因家族與調(diào)控細胞凋亡過程有關(guān)，其中Bcl?2 和Bax 分別有抑制凋亡作用和促進凋亡作用，二者共同調(diào)控細胞凋亡。紫草素通過誘導(dǎo)Bcl?2 家族中促凋亡蛋白Bax 和抑制Bcl?2 家族中抗凋亡蛋白（Bcl?2、Bcl?x 等）的表達，發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。胡煜等［22］通過HE 染色及免疫組化等方法研究發(fā)現(xiàn)紫草素能夠有效地誘導(dǎo)絨癌裸鼠移植腫瘤細胞凋亡和壞死，明顯抑制B?HCG 的分泌；Bcl?2 蛋白的表達下調(diào)是紫草素抗絨癌作用的重要機制。實驗研究發(fā)現(xiàn)紫草素可抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞［23］、人卵巢癌細胞SKOV?3［24］和子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞［16］的體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能為上調(diào)Bax 表達和下調(diào)Bcl?2 表達有關(guān)。

2.2 PI3K?Akt／PKB 信號通 路 Akt 又稱蛋 白激酶B（PKB），是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，為體內(nèi)重要的凋亡抑制蛋白。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）／蛋白激酶B（AKt／PKB）信號通路已經(jīng)被證實參與了抗細胞凋亡，促進細胞增殖、遷移、癌性轉(zhuǎn)化等過程［25］。有研究表明，Akt 在宮頸癌［26］中PI3K、AKt 的表達水平較宮頸正常組織及宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）組織高，且隨著CIN 級別的遞增而增大。余思云等［27］通過實驗證明紫草素可通過抑制PI3K／Akt 信號通路中Akt 的磷酸化，從而對Akt 下游靶蛋白Bax上調(diào)和Bcl?2 下調(diào)，來誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細胞凋亡。謝偉等［28］研究發(fā)現(xiàn)紫草素可通過調(diào)節(jié)凋亡信號通路PI3K／PKB，抑制離體子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC?1B 的增殖，促進其凋亡。盧丹［14］發(fā)現(xiàn)β?羥基異戊酰紫草素（β?HIVS）可誘導(dǎo)Hela 細胞發(fā)生凋亡，其機制可能為抑制PI3K／AKT／mTOR 信號通路以及降低該通路中相關(guān)下游基因蛋白表達水平，并認為針對該信號通路的中藥分子靶向治療有望成為宮頸癌治療的新途徑。

2.3 MAPKs／caspase／ROS 信號通路 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinases，MAPKs）是細胞內(nèi)的一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，主要包括ERKs、JNKs／SAPKs、p38、ERK5／BMK 這4 個亞家族，其介導(dǎo)的信號通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，與細胞的增殖、分化、及凋亡等密切相關(guān)［20］。Shilnikova 等［7］通過Hoechst 33342 染色、蛋白質(zhì)印跡等實驗方法發(fā)現(xiàn)紫草素可誘導(dǎo)對順鉑耐藥的人卵巢癌A2780 細胞的凋亡，以時間依賴性方式激活JNK、p38 和ERK，用三者特異性抑制劑降低了紫草素的細胞毒性，由此證實紫草素可通過MAPK 活化誘導(dǎo)細胞凋亡。

caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一組與程序性細胞死亡和炎癥密切相關(guān)的蛋白酶。有研究［29］發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫草素處理后的人絨毛膜癌JEG?3 細胞出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，蛋白印跡實驗結(jié)果顯示其JEG?3 細胞的caspase?3、ERK、JNK 蛋白被激活，推測紫草素誘導(dǎo)JEG?3 細胞凋亡可能與caspase?3 途徑及MAPK 通路有關(guān)。吳振［30］發(fā)現(xiàn)，紫草素可通過經(jīng)典的caspase 途徑誘導(dǎo)人宮頸癌Hela 細胞凋亡，并證實caspase?3 和caspase?8 參與了該細胞凋亡過程。于明欣等［15］發(fā)現(xiàn)紫草素可通過活化caspase?3、8、9 進而誘導(dǎo)Hela 細胞凋亡。

大量研究表明，ROS 與細胞凋亡有著緊密聯(lián)系［31］。張亞宏等［32］發(fā)現(xiàn)紫草素可誘導(dǎo)Hela 出現(xiàn)凋亡，使細胞產(chǎn)生大量ROS，并可明顯增加p38 活性形式p?p38 的表達，應(yīng)用ROS 清除劑NAC 和p38 抑制劑SB203580 可以明顯降低shikonin 誘導(dǎo)的HeLa 細胞的生長抑制和凋亡率，表明ROS／p38 信號通路參與了其凋亡的過程。

3 抑制細胞遷移和侵襲

3.1 上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）EMT 是侵襲性腫瘤的特征，其特征在于上皮（E?）鈣黏蛋白表達減少和神經(jīng)（N?）鈣粘蛋白表達增加，這有助于基質(zhì)細胞的黏附，增強癌細胞的運動性和侵入性［33］。Shilnikova 等［7］通過細胞遷移實驗和蛋白質(zhì)印跡分析表明，紫草素可通過減弱EMT，即上調(diào)上皮鈣黏蛋白和下調(diào)神經(jīng)鈣黏蛋白來降低A2780?CR 細胞的遷移能力。

3.2 STAT3 信號通路 STAT3 是人類惡性腫瘤中最常見且易被激活的STAT 家族成員，主要介導(dǎo)細胞間或細胞外信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)變中有重要作用。王慧智等［34］采用劃痕修復(fù)實驗、Transwell 小室體外侵襲實驗發(fā)現(xiàn)紫草素能明顯抑制人絨毛膜癌JEG?3 細胞遷移和侵襲能力，采用免疫組化、RT?PCR 發(fā)現(xiàn)紫草素可降低STAT3、p?STAT3 陽性細胞表達和STAT3mRNA、p?STATm?RNA 表達，由此推斷紫草素抑制JEG?3 細胞遷移和侵襲的機制可能與抑制STAT3 信號通路有關(guān)。

4 誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死性凋亡

壞死性凋亡屬于細胞程序性死亡，與壞死、凋亡這2 種細胞死亡方式之間關(guān)系交錯復(fù)雜，目前普遍認為壞死性凋亡可作為細胞凋亡的替補方式，當細胞凋亡失效時，壞死性凋亡就被激活成為了“自動防故障機制”，可為對經(jīng)典凋亡途徑抵抗的腫瘤治療提供新的研究方向。馮偉等［35］發(fā)現(xiàn)紫草素處理人卵巢癌SKOV3、A2780 細胞后，兩者出現(xiàn)明顯的增殖抑制；其凋亡率無明顯變化，但壞死比例明顯增加；Hoechst 33342、PI 染色未見明顯細胞凋亡特征，Western Blot 法發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡相關(guān)蛋白RIP1 和RIP3的表達顯著上調(diào)。

5 增加腫瘤細胞對放化療的敏感性

紫草素除了具有單獨的殺傷腫瘤細胞作用外，還能增加腫瘤細胞對放射治療和化學(xué)治療的敏感性。樊濤等［36］研究發(fā)現(xiàn)紫草素能夠增強人卵巢癌細胞株SKOV?3 放射敏感性，其機制可能與抑制PI3K／AKT 信號通路和改變細胞周期分布有關(guān)。

杜春雙等［37］發(fā)現(xiàn)紫草素聯(lián)合順鉑組對宮頸癌Hela 細胞的抑制作用明顯高于單用順鉑組。張潔等［38］發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)，β?羥基異戊酰紫草素（β?HIVS）對順鉑具有協(xié)同增敏作用，且其濃度越高，協(xié)同作用表現(xiàn)得越顯著。

6 逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性

化療作為癌癥的三大治療手段之一，能有效地控制腫瘤的生長、擴散和轉(zhuǎn)移，對一些手術(shù)后的高度敏感的婦科惡性腫瘤，它可以達到治愈效果。化療耐藥是目前腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗的最主要原因之一，它涉及P?糖蛋白（P?gp）、耐藥相關(guān)蛋白MRP、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GSTs）的過表達等多種機制、P?糖蛋（P?gp）是由多藥耐藥基因mdr1 編碼的跨膜糖蛋白，是ATP 依賴性的藥物外排泵；P?gP 可在ATP 供能的情況下將細胞內(nèi)藥物泵出細胞外，降低了細胞內(nèi)的藥物濃度使細胞產(chǎn)生耐藥性；GSTs 是體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細胞抗損傷、抗癌變的主要解毒系統(tǒng)，其表達水平的改變可能與腫瘤化療耐藥有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)［39?41］紫草素可促進絨癌細胞JAR 及絨癌耐藥細胞JAR／MTX 凋亡，致使絨癌耐藥細胞JAR／MTX 細胞周期阻滯，逆轉(zhuǎn)絨癌細胞JAR／MTX 細胞對MTX 耐藥，其機制是通過下調(diào)凋亡抑制基因bcl?2、survivin 表達，下調(diào)GST，使JAR／MTX 細胞中P?gp 活性下降來實現(xiàn)。

7 刺激機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫

李紅英等［42］發(fā)現(xiàn)經(jīng)紫草素誘導(dǎo)凋亡的卵巢癌HO?8910細胞能促進樹突狀細胞（DC）的成熟，后者作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原提呈細胞，在成熟過程中可誘發(fā)特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。由此可知，紫草素不僅可通過誘導(dǎo)細胞凋亡抗腫瘤，還可通過刺激機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫來達到抗腫瘤目的。

8 展望

盡管有大量研究證明紫草素有抗婦科惡性腫瘤作用，但距成熟的抗腫瘤藥物仍有一定距離。目前可主要從以下方面進行研究：（1）紫草素抗腫瘤的研究多停留在分子生物學(xué)水平，需建立更多的動物模型及進行全面的臨床實驗，才能進一步評估其作用；（2）紫草素對正常細胞有一定的毒性作用［43］，這也是其目前無法應(yīng)用于臨床的部分原因，目前有百余種相關(guān)萘醌類化合物已經(jīng)被人工合成，因此篩選或合成高效低毒的衍生物是加速其應(yīng)用于臨床抗腫瘤的有效措施之一；（3）惡性腫瘤多數(shù)需藥物聯(lián)用治療，目前已有實驗研究表明紫草素或其衍生物對惡性腫瘤相關(guān)化療藥物有協(xié)同增敏作用，但此類研究相對較少，今后可從這方面來進一步研究；（4）紫草素性質(zhì)不穩(wěn)定，易與周圍的物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致失活［44］，因此研究性質(zhì)穩(wěn)定的藥物載體有助于相關(guān)深入研究，如其納米乳［45］和脂質(zhì)體凝膠劑的制備［46］均有一定的應(yīng)用前景；（5）紫草素的靶向抗腫瘤作用較差［43］，因此可考慮對其進行特異性的修飾或靶向載體的制備，黃念［47］制備的溫敏納米膠束、王潔等［48］用CD133抗體修飾的微乳對乳腺癌細胞起到了靶向殺傷作用，可給研究該成分靶向抗腫瘤作用帶來一定的啟示。