模擬氮沉降下施石灰對休耕紅壤優勢植物根際土壤微生物群落的影響*

鄧玉峰 田善義 成艷紅 胡正錕 劉滿強 胡 鋒 陳小云?

（1 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095）

（2 江西省紅壤研究所，南昌 331717）

不合理的人為活動導致全球大氣氮沉降量逐漸增加，氮沉降成為全世界關注的重要環境問題之一[1]。近年來我國氮沉降量急劇增加，總氮沉降量每年已超過1500 萬噸，成為繼歐洲和北美之后的世界第三大氮沉降區[2]。過量的氮輸入導致的土壤酸化、速效養分流失、生物多樣性降低、微生物群落改變等問題已得到深入研究[2-4]。紅壤作為我國重要的土壤資源，由于其自身發育以及氣候等因素作用已經面臨嚴重的酸化、生物退化等生態問題，同時嚴重的氮沉降勢必會加劇紅壤地區的生態退化，每年氮沉降輸入紅壤旱地的氮含量約為 94.50 ～185.99 kg·hm-2，農田氮沉降普遍盈余，對紅壤生態系統造成威脅[5-6]，阻礙紅壤地區的經濟社會可持續發展。

為維護我國生態安全，有必要采取有效措施遏制氮沉降下土壤生態環境的繼續惡化，促進土壤生態功能的恢復和可持續性發展。近年來，人們意識到依靠植被的自然恢復能力等調控措施恢復土壤生態健康的重要性，通過農田休耕，停止人為干擾后植被自行修復能夠恢復生物多樣性和生態系統功能[7-8]。休耕演替初期，占據生境的優勢植物對土壤環境的改變起到了至關重要的作用，且植物根際性質是其利用土壤養分和適應脆弱環境的最直接表征之一[9]。同時，針對氮沉降下紅壤恢復過程中存在的關鍵限制因子—土壤酸化，采取施用石灰可以有效克服這一限制因子。石灰作為土壤酸度改良劑，能夠提高土壤肥力[10]，加速紅壤生態恢復進程。土壤生態恢復過程伴隨著土壤生物群落和生物功能的改變。根際微生物存在于植物根系與土壤物質交換最為活躍的界面——根際中，是根際土壤的重要組成部分，對環境因子較為敏感，生境的改變（如：土壤酸度、養分含量等）會引起根際微生物群落結構和多樣性發生改變[11]，同時土壤微生物作為生態系統中物質循環和能量流動的重要參與者，在維持和反映生態系統健康方面起著重要作用，是評價自然或人為干擾引起土壤質量變化的重要指標[12]。

本研究通過氮添加模擬大氣氮沉降，并通過石灰調控土壤酸度，選取休耕地演替初期先鋒優勢植物狗尾草（Setaria viridis（L.）Beauv）的根際土壤微生物群落為研究對象，結合全球變化因素和人為管理措施的綜合影響因子，研究模擬氮沉降背景下施石灰對休耕紅壤根際微生物群落的影響。基于已有的研究提出以下假說：模擬氮沉降能夠增加土壤肥力而促進初級生產力，施石灰能夠提高根際土壤pH 改善根際微生物群落生境，因而氮沉降與石灰共同作用可增加土壤微生物生物量；但是由于減少了環境限制因子的維度和生態位，氮沉降與石灰的共同作用會降低微生物多樣性。預期結果有助于深入了解氮沉降下改良劑施用對休耕紅壤微生物群落的影響，還將為熱帶和亞熱帶生態系統恢復措施完善提供指導。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗點位于江西省紅壤研究所（116°20′24″E，28.3°15′30″N），屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫17.7～18.5℃，年均降雨量1 537 mm，年蒸發量1 100～ 1 200 mm。土壤質地為粉砂質黏土，初始土壤pH 5.27，土壤有機碳10.37 g·kg-1，全氮0.99 g·kg-1，全磷0.62 g·kg-1，速效鉀179.07 mg·kg-1。休耕前連續多年種植制度為花生—紅薯輪作，休耕后對耕層土壤進行混勻處理以減少土壤異質性對試驗結果的影響。休耕前兩年禾本科植物狗尾草為優勢物種，生物量約占每個小區總生物量的80%。

1.2 試驗設計

定位試驗始于2015年1月，休耕后植被自然生長，試驗采用3 氮×2 石灰的二因素完全交互設計。當地氮沉降量為每公頃每年40 kg N，在此基礎上模擬低量（N0）、中量（N1）、高量（N2）三個氮（N）沉降水平，分別施N 0、45、90 kg·hm-2·a-1，以NH4NO3形式于每年3月份和7月份分兩次施入。石灰需要量通過理論計算，以提升耕層土壤（20 cm）pH 1個單位確定石灰用量，石灰處理（L）設置L0 、L1兩個水平，施用量0、110 kg·hm-2·a-1，以Ca（OH）2形式直接施入土壤，每年3月份一次性施入。小區面積為6.3 m× 4 m，每個處理設置5 個重復，隨機區組排列。

1.3 樣品采集

于2016年10月5日，此時為狗尾草生物量最大期。每個小區內隨機采集30 cm×30 cm 面積大小的狗尾草生長區域，將植物樣品地上部和根系分離后分開保存，烘干稱重后粉碎用于養分含量分析。采用抖根法收集根際土壤樣品并立即帶回實驗室，室內過2 mm 篩混勻。部分土樣保存于4℃條件下用于土壤速效養分分析并迅速測定；部分土樣冷凍干燥后用于微生物磷脂脂肪酸（PLFA）的測定；部分土樣風干后用于土壤pH、交換性鈣（Ca2+）與交換性鋁（Al3+）的測定。

1.4 土壤基礎性質測定

采用常規方法測定土壤pH 用1∶2.5（土∶水，w∶v）浸提，pH 計（METTLER-S220-K）測定；交換性鈣（Ca2+）含量用1 mol·L-1NH4COOH 交換，原子吸收分光光度法測定；交換性鋁（Al3+）含量采用1 mol·L-1KCl 交換，中和滴定法測定；礦質氮（NH+4-N 和 NO-3-N 之和）采用2 mol·L-1KCl 浸提，流動分析儀（Auto Analyer AA3，德國）測定；有效磷采用0.03 mol·L-1NH4F-0.025 mol·L-1HCl 溶液浸提，鉬藍比色法測定；可溶性有機碳（DOC）采用超純水浸提TOC 分析儀（Elementar，德國）測定。

1.5 磷脂脂肪酸（PLFA）的提取、分離、鑒定

采用修正的Bligh-Dyer 方法進行提取[13]：稱取8 g 冷凍干燥土樣于特氟龍試管中，用檸檬酸緩沖溶液（pH 4.0）∶氯仿∶甲醇（體積比為 0.8∶1∶2）振蕩提取總脂類，經過SPE 硅膠柱分離去除中性脂、糖脂，從而得到磷脂，堿性甲酯化后，用Agilent GC-6850 氣相色譜儀分析PLFA 的成分，內標為正十九烷酸甲酯（19∶0），各成分脂肪酸通過 MIDI Sherlock 軟件進行微生物的鑒定。根據磷脂脂肪酸的分子結構將其劃分不同的微生物類群[14-16]，細菌以i14:0，i15:0，a15:0，i16:0，i17:0，a17:0，16:1ω7c，cy17:0，18:1ω7c，cy19:0 來表征；真菌以16:1ω5c，18:1ω9c，18:2ω6,9c 來表征；放線菌以10Me16:0，10Me17:0，10Me18:0 來表征。其中i14:0，i15:0，a15:0，i16:0，i17:0，a17:0 代表革蘭氏陽性菌（G+），16:1ω7c，cy17:0，18:1ω7c，cy19:0 代表革蘭氏陰性菌（G-），16:1ω5c 代表叢枝菌根真菌（AMF），18:1ω9c，18:2ω6,9c 代表腐生真菌。

1.6 數據處理

采用Statistica 7 軟件進行數據相關性分析，用Origin 8.5 軟件作柱狀圖，R 3.3.1 軟件作結構方程模型（SEM）。采用多因素方差分析氮和石灰添加對土壤化學性質、植物生物量和微生物群落的影響，采用單因素方差分析評價處理間的差異顯著性，平均值多重比較統計學檢驗采用最小顯著極差法（LSD）。利用結構方程模型（SEM）探明模擬氮沉降和施石灰對微生物群落直接及通過根際土壤pH、速效養分、植物生物量間接產生的影響，其中速效養分用包含DOC、礦質氮、有效磷和交換性Ca2+的PCA 一軸（PC1）數據表征，植物生物量由包含莖葉和根系生物量的PCA 一軸（PC1）數據表征。

2 結 果

2.1 根際土壤化學性質

方差分析顯示，模擬氮沉降對除交換性Ca2+以外其他土壤化學指標均有顯著影響（P＜ 0.05），石灰對所有測定土壤化學指標的影響均達到顯著水平，而二者交互作用僅對DOC、交換性Al3+含量有顯著影響（表1）。與對照相比，模擬氮沉降導致根際土壤pH、有效磷含量降低，礦質氮、交換性Al3+含量升高，DOC 含量則隨模擬氮沉降量增加呈先下降后上升的趨勢（表2）。模擬氮沉降下施石灰，pH和交換性Ca2+含量升高，DOC、有效磷、交換性Al3+含量降低，礦質氮含量則無顯著變化（表2）。

2.2 植物生物量

方差分析表明，模擬氮沉降對植物莖葉和根系生物量均有顯著影響，而石灰僅對根系生物量有顯著影響，而二者交互作用對莖葉和根系生物量均沒有顯著影響（表1）。無論石灰施用與否，植物莖葉生物量、根系生物量均隨模擬氮沉降量增加呈上升趨勢，且石灰處理下上升更為明顯（圖1）。

2.3 根際土壤微生物群落

方差分析顯示，模擬氮沉降對微生物總量、細菌總量、革蘭氏陰性菌生物量（PLFA 含量表征）以及革蘭氏陰/陽性細菌比有顯著影響，施石灰對真菌總量、叢枝菌根真菌生物量、革蘭氏陰性菌生物量、革蘭氏陰/陽性細菌比、真菌/細菌比及香農多樣性指數均有顯著影響，氮和石灰交互作用對幾乎所有的微生物群落指標均有影響（表3）。除革蘭氏陽性菌外，模擬氮沉降導致各類群微生物生物量及真菌/細菌比、革蘭氏陰/陽性細菌比、香農多樣性指數降低（圖2，圖3）；在沒有額外施氮條件時施石灰也導致各微生物群落生物量下降，而革蘭氏陰/陽性細菌比則顯著升高；模擬氮沉降下施石灰，所測各類群微生物生物量均隨氮沉降量增加呈上升趨勢；而香農多樣性指數并未受交互作用的影響。

表1 模擬氮沉降和施石灰對根際土壤化學性質和植物生物量的影響方差分析 Table1 ANOVAs of effects of simulated nitrogen deposition and liming on rhizosphere soil chemical properties and plant biomass

表2 模擬氮沉降和施石灰對根際土壤化學性質的影響 Table2 Effects of simulated nitrogen deposition and liming on rhizosphere soil chemical properties

圖1 模擬氮沉降和施石灰對植物莖葉和根系生物量的影響 Fig.1 Effects of simulated nitrogen deposition and liming on plant aboveground and root biomass

表3 模擬氮沉降和施石灰對根際土壤微生物群落影響的方差分析 Table3 ANOVAs results of effects of simulated nitrogen deposition and liming on rhizosphere soil microbial community

圖2 模擬氮沉降和施石灰對各類群微生物PLFA 含量的影響 Fig.2 Effects of simulated nitrogen deposition and liming on microbial PLFAs

圖3 模擬氮沉降和施石灰對根際土壤真菌/細菌比、革蘭氏陰/陽性細菌比、香農多樣性指數的影響 Fig.3 Effects of simulated nitrogen deposition and liming on the F/B ratio，G-/G+ ratio and Shannon diversity in rhizosphere soil

2.4 模擬氮沉降和施石灰下環境因子對微生物群落的影響

結構方程模型闡明了模擬氮沉降和施石灰情況下根際土壤pH、土壤養分、植物生物量和微生物群落間的關系。最終模型擬合結果為：卡方值χ2= 0.11，自由度df= 1.00，顯著性概率值P= 0.74，漸進殘差均方和平方根RMSEA = 0.00，χ2/df ＜2，P ＞0.05，RMSEA ＜ 0.05，說明模型適配良好。石灰對微生物群落的影響最大（λ= 0.93），氮和石灰綜合影響下，土壤pH 對微生物群落的影響最大（λ= -0.78）（圖4）。

3 討 論

3.1 模擬氮沉降和施石灰對優勢植物根際土壤性質和生長的影響

已有文獻表明，休耕植物演替恢復過程中禾本科植物逐漸占據生態優勢地位[17]。本研究中，禾本科狗尾草能夠利用有限資源快速繁殖，符合r型生殖策略，成為休耕初期的優勢種植物[18]。氮沉降下狗尾草根際土壤pH 降低，且伴隨著交換性Al3+含量的升高。大量研究證實，氮沉降增加導致土壤酸化[19-20]。對于本身pH 較低且緩沖能力較弱的紅壤 而言，土壤酸化伴隨著Ca2+等鹽基離子的流失。同時，土壤化學反應導致土壤中磷被固定[21]。而植物生物量表現出對氮沉降的積極響應，說明氮素缺失是抑制生產力增加的主要因素。石灰作為常用堿性改良劑還能夠顯著增加土壤交換性Ca2+含量[22]，這為植物生長創造了有利條件。

圖4 模擬氮沉降和施石灰作用下根際土壤pH、養分、植物生物量及微生物群落間關系概念模型 Fig.4 A structural equation model（SEM）showing the causal relationships of plant biomass，rhizosphere soil pH and soil nutrients with soil microbial community as affected by nitrogen deposition and liming

值得注意的是，施入石灰導致根際土壤可溶性有機碳含量降低，且同一氮沉降水平下，施石灰礦質氮含量低于不施石灰，這與土壤pH 升高促進微生物對土壤活性有機質的降解能力有關[23]。施石灰也會降低土壤有效磷含量，有研究表明施石灰，酸性土壤pH 上升，活性鋁產生的沉淀聚合體和土壤中增加的Ca2+能夠吸附土壤中的磷，從而降低土壤有效磷含量[24]。生物對磷的吸收也是有效磷含量降低的主要原因，尤其是在磷養分貧乏的紅壤地區，在礦質氮含量增加條件下，植物和微生物之間對磷的爭奪更為激烈。已有研究表明在養分受限的生態系統中，微生物與植物存在對土壤養分的爭奪[25]，因此土壤養分水平以及植物-微生物間養分競爭是影響微生物群落的重要因素。

3.2 模擬氮沉降和施石灰對優勢植物根際土壤微生物的影響

模擬氮沉降顯著抑制根際土壤各微生物類群，結構方程模型進一步表明，對于酸性較強、緩沖性較弱的紅壤，模擬氮沉降引起的根際土壤pH 降低是造成該結果的主要原因。酸化導致土壤的交換性Al3+含量升高，對微生物產生抑制作用[26]。模擬氮沉降促進植物生長的同時導致土壤磷有效性降低，植物和微生物對磷素的競爭加劇，限制了微生物群落的發展。除此之外，本研究發現模擬氮沉降使真菌/細菌比以及革蘭氏陰/陽性細菌比均顯著降低，這可能是由于氮素增加降低了植物對菌根真菌的依賴，導致植物向根系分配的碳含量減少[27]。革蘭氏陽性菌更偏好利用難降解有機物，而革蘭氏陰性菌偏好利用易分解有機物[28]，模擬氮沉降影響植物凋落物質量，增加了難降解有機碳比例，降低了革蘭氏陰/陽性細菌比[29]。僅施石灰也會降低微生物生物量。施石灰促進了植物對土壤養分的吸收，加劇了微生物和植物的養分競爭。盡管很多研究認為微生物相較于植物具備較大的比表面積，繁殖速率快等屬性使其在養分競爭上具有優勢[30-31]，但也有相反的觀點，如植物可通過調節自身生理等來提高養分利用[32]。本研究中，植物在與微生物的養分競爭中占據了主導地位，尤其是受氮、磷水平變化較為敏感的叢枝菌根真菌[33]。僅施石灰顯著增加革蘭氏陰/陽性細菌比，說明偏中性環境下微生物群落向革蘭氏陰性菌方向轉變。

模擬氮沉降和僅施石灰均導致根際微生物生物量降低，而氮和石灰交互作用能夠有效遏制氮沉降和單施石灰對微生物造成的不利影響。模擬氮沉降下施石灰，一方面中和土壤pH，緩解了Al3+對微生物毒害，另一方面植物地上和地下生物量的增加表明凋落物和根系輸入資源的增加（圖1），促進微生物生長。DOC 作為土壤微生物的能量來源之一[34]，交互處理下DOC 含量降低，從另一個角度表明微生物對DOC 消耗增加。此外，氮和石灰交互作用對微生物生物量的影響受氮水平的調控。施石灰時，高氮處理下微生物生物量增長效果優于低氮處理，表明石灰影響下的土壤環境中微生物生長受土壤氮水平的限制。氮和石灰交互處理下真菌/細菌比、香農多樣性指數與對照相比無顯著變化，這一結果說明交互作用能夠維持氮沉降下總體微生物群落結構和多樣性穩定且石灰在其中起主導作用（表3）。本結果部分支持之前假說，即模擬氮沉降能夠增加土壤肥力而促進初級生產力，施石灰能夠提高土壤pH改善根際土壤微生物群落生境，因而石灰與氮沉降共同作用可增加土壤微生物生物量，但微生物多樣性并未受影響。

本研究也暗示，鑒于土壤環境和生物群落在支持生態系統結構和功能中的重要地位，今后應加強研究石灰對土壤有機碳積累、土壤團聚化、植物群落功能及養分循環等關鍵生態功能的影響，尤其是加強結合根系和根際動態揭示驅動生態系統多功能服務恢復的影響機制研究。

4 結 論

模擬氮沉降下施石灰有效提高根際土壤pH，降低交換性Al3+含量，提高植物生物量和各類群微生物生物量（以PLFA 含量表征），同時，維持真菌/細菌比和香農多樣性指數不變。氮和石灰交互作用能夠改善休耕紅壤根際土壤環境，緩解土壤酸化，提高土壤生產力，促進微生物生長同時維持微生物群落結構和多樣性穩定。pH 對根際土壤微生物群落影響最為強烈，且植物與微生物間對土壤資源的競爭也可能是影響微生物群落的關鍵因素。