五味子乙素改善糖酵解反應大鼠心肌缺血再灌注損傷實驗研究*

武衛黨，郭繼文，張丹鳳，耿蓬勃，路 艷，石 磊

西電集團醫院(西安 710077)

心肌缺血再灌注損傷是臨床常見疾病，多發與急性心肌梗死的冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)等，往往導致心肌梗死患者的術后治療及恢復，是目前臨床亟待解決的問題[1]。缺血再灌注損傷的作用機制復雜，目前主要的作用機制包括，中性粒細胞浸潤、鈣超載、能量代謝障礙等多種學說。線粒體是細胞能量供應的關鍵，心肌細胞線粒體損傷可以導致心肌能量代謝障礙的發生，導致ATP功能減少，而能量代謝可以進一步加劇細胞損傷的發生[2-3]。

五味子乙素是五味子果實中含量最豐富、生物活性最高的一種二芐基環辛二烯衍生物。是治療病毒性和化學性肝炎的常用中藥[4]。現代藥理研究已證明其具有抗氧化、抗炎、心臟保護、肝保護、神經保護和腎保護作用[5]。近年的研究發現五味子乙素在心臟相關疾病中具有一定的保護作用，目前研究發現包括其在心肌梗死、阿霉素誘導的心肌細胞凋亡具有顯著的改善作用，同時對糖尿病血流變也具有改善作用[6-7]。糖酵解是機體在無氧條件下，維持細胞能量代謝的補充手段之一，研究發現促進糖酵解反應可以顯著改善缺血再灌注導致的心肌損傷的發生[8]。而目前圍繞五味子乙素在缺血再灌注損傷中能量代謝障礙的調節作用及其對糖酵解反應的影響作用，尚未見報道。因此本研究將采用離體心臟缺血再灌注模型，考察五味子乙素對離體心臟血液流變學，氧化應激及能量代謝的影響作用。

材料與方法

1 材 料 健康雄性SD大鼠30只，體重180～220 g，10～15周齡，購自于西安醫學院實驗動物中心提供。正常條件下，自由飲食，飲水適應性飼養7 d用于實驗。

2 試劑及設備 五味子乙素(sigma， A4589)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(建成生物醫學工程研究所，中國)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)，Caspsase-9(碧云天生物技術公司，中國)；ATP含量，乳酸(Bivision公司，美國)；離體工作心灌流裝置(美國RADONTI公司)，生物機能檢測系統(Powerlab system，AD Instrument Ltd.澳大利亞)，酶標儀(BioTek公司，美國)。

3 模型制備 采用Langendorff離體心臟灌流技術建立大鼠離體心肌缺血再灌注模型，模型建立方法，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠。大鼠心臟置于4 ℃的生理鹽水中，Langendorff灌流裝置上安裝大鼠心臟，逆行恒壓灌注，剪開右心房，使冠脈流出液自然流出。采用95% O2+5%CO2混合氣飽和的K-H 緩沖液(pH 值7.35～7.40) 在恒溫(37 ℃) 、恒壓(100 cm H2O) 條件下灌注。將連接有測壓導管的心室球囊送入左心室，采用多導生理記錄儀檢測相關指標。灌注液及心臟周圍溫度用恒溫循環水浴維持在37 ℃。平衡灌注30 min，待心臟各項功能穩定，關閉灌流液停止灌流，造成全心缺血，31 min 后打開灌流液再復灌30 min[10]。

4 血流動力學監測 采用生物機能檢測系統，檢測離體心肌左室發展壓(LVDP)、左室內壓上升/ 下降速率(±dp/dt)和心率(HR)，考察五味子乙素對其的影響。

5 心肌組織中SOD、GSH-Px活性、MDA含量檢測 采用SOD、GSH-Px、MDA試劑盒，檢測心肌組織中SOD、GSH-Px活性、MDA 含量，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。

6 心肌組織中Caspase-3、Caspase-9活性含量檢測 采用Caspase-3、Caspase-9試劑盒，檢測心肌組織中Caspase-3、Caspase-9活性，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。

7 心肌組織中ATP、乳酸含量檢測 采用ATP、乳酸試劑盒，檢測心肌組織中ATP、乳酸含量，實驗步驟按照試劑盒說明書進行。

8 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計學軟件分析，實驗數據采用均值±標準差表示，組間多組數據比較采用單因素方差分析，組內數據比較采用LSD-t 檢驗。

結 果

1 五味子乙素對心肌血流動力學左室發展壓(LVDP)、心率(HR)、左室內壓上升/ 下降速率(±dp/dt)max的影響 考察五味子乙素在缺血再灌注大鼠模型中的影響，實驗結果模型大鼠心臟LVDP、HR、(±dp/dt)max與空白組比較差異具有統計學意義(P<0.05)。給予五味子乙素干預后，給藥組大鼠心肌組織相關血流變指標LVDP、HR、(±dp/dt)max與模型組比較均有顯著差異，給予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制劑后，心肌相關LVDP、HR、 (±dp/dt)max與空白組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，但繼續給予五味子乙素干預后，對心肌血流變沒有顯著改善作用，與抑制劑組比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 五味子乙素對心肌血流動力學LVDP、HR、(±dp/dt)max的影響

注：與空白組比較，*P< 0.01 ；與模型組比較，△P<0.05

2 五味子乙素對心肌組織中SOD、MDA、 GSH-Px含量的影響 考察五味子乙素在缺血再灌注大鼠模型中的對心肌組織氧化應激反應的影響，實驗結果模型大鼠心臟SOD、MDA、 GSH-Px含量與空白組比較具有顯著差異，SOD及 GSH-Px顯著降低，而 MDA含量顯著升高(P<0.05)。給予五味子乙素干預后，給藥組大鼠心肌組織相關SOD、MDA、 GSH-Px含量與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，可顯著恢復抗氧化酶SOD及 GSH-Px，抑制MDA的升高。給予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制劑后，心肌相關氧化應激反應指標與空白組比較具有顯著差異，聯合給予五味子乙素干預后，五味子乙素對心肌氧化應激指標沒有顯著改善作用，與單一抑制劑組比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 五味子乙素對心肌組織中SOD、MDA、 GSH-Px含量的影響

注：與空白組比較，*P<0.01 ；與模型組比較，△P<0.05

3 五味子乙素對心肌組織中Caspase-3活性、ATP、乳酸含量的影響 實驗結果模型大鼠心臟ATP，與空白組比較顯著降低，乳酸含量顯著升高且均具有顯著差異，此外線粒體相關指標Caspase-3活性顯著升高(P<0.05)。給予五味子乙素干預后，給藥組大鼠心肌組織相關ATP含量顯著恢復，乳酸含量進一步升高且與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，同時可明顯抑制線粒體損傷相關指標Caspase-3的活性。給予模型大鼠心肌灌流糖酵解抑制劑后，心肌相關線粒體損傷指標及能量代謝指標與空白組比較均具有統計學差異，而聯合給予五味子乙素干預后，五味子乙素對心肌Caspase-3活性，ATP，乳酸含量均沒有顯著改善作用，與單一抑制劑組比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 五味子乙素對心肌組織中Caspase-3，Caspase-9活性、ATP、乳酸含量的影響(μg/mg)

注：與空白組比較，*P<0.01 ；與模型組比較，△P<0.05

討 論

缺血再灌注損傷(I/R)是心臟手術和器官移植的重要組成部分，是發病率和病死率的主要決定因素。I/R后的心臟保護仍然亟待解決的問題。在生理條件下，充足的氧氣供應是維持心臟活力和功能必不可少的。在缺血相關缺氧期間，由于缺氧和營養供應不足，心肌內發生了一系列突然的生化和代謝變化。低氧停止氧化磷酸化，導致線粒體功能障礙、ATP消耗和心肌收縮功能抑制，導致心肌血流變發現顯著改變。糖酵解是在厭氧或有氧條件下將葡萄糖轉化為乳酸或丙酮酸鹽的生化過程，其凈產量為2摩爾的ATP。在缺血期間，糖酵解因其產生ATP的能力而成為一種非常重要的能量來源[9-10]。

五味子乙素是從五味子果實中分離出的活性單體，其在臨床上被應用于治療肝炎和缺血性疾病，如心肌缺血和腦缺血。近年來的研究進一步表明，五味子乙素可通過下調炎癥細胞因子、激活eNOS通路、抑制細胞凋亡、抑制心肌缺血再灌注等途徑，改善心肌功能，減輕心肌重塑[11-12]。此外研究表明五味子乙素對心肌缺血/再灌注(I/R)損傷具有一定保護作用，并且在體內和體外模型中具有很強的抗炎性能。研究還表明，在體外模型中，五味子乙素可以通過ATR抑制特異性地抑制p53的磷酸化[13-14]。但五味子乙素對缺血再灌注心肌損傷的能量代謝調節作用尚未見報道，因此在本研究中我們采用離體心肌缺血再灌注模型考察五味子乙素對其的影響，研究結果表明，五味子乙素可以顯著改善心肌血流變相關指標，顯著升高左室發展壓、左室內壓上升/ 下降速率和恢復心肌心率。同時通過檢測氧化應激指標及線粒體線粒體相關指標，結果表明五味子乙素可以顯著抑制心肌氧化應激反應的發生，同時減少心肌線粒體損傷的發生，通過檢測心肌ATP及乳酸生成含量表明，五味子乙素可以顯著升高心肌ATP及乳酸含量，恢復心肌能量代謝。當將五味子乙素與糖酵解抑制劑Lonidamine聯合使用后，五味子乙素對心肌的改善作用顯著降低，且對心肌能量代謝的調節作用顯著降低。心肌缺血再灌注損傷發生機制復雜，糖酵解是在機體無氧環境下是機體功能的關鍵環節[15]，五味子乙素可通過調節心肌糖酵解反應，改善缺血再灌注損傷是發生，但其調節心肌糖酵解反應的機制還有待探究。