利用電轉的方法對T 細胞TET2 基因敲除并探討TET2對T 細胞增殖的影響

楊雷 葉洲杰 李兆龍 沈陽坤 傅雅娟

（1. 福建師范大學南方生物醫學研究中心，福州 350117；2. 福建省兒童醫院中心實驗室，福州 350005；3. 福建省農業科學院畜牧獸醫

研究所，福州 350013）

DNA 甲基化修飾是基因表達調控的主要表觀遺傳 機 制之 一［1］，TET2是TET 家 族（TET1、TET2、TET3）的一員，TET 蛋白利用α-KG、Fe2+及O2將DNA 中5mC 氧化為5hmC，并繼續通過TET 蛋白酶催化5hmC 氧化化為5fc 和5caC，5mC 氧化衍生物，5caC 可由脫羧基或者堿基切除完成去甲基化［2-5］。越來越多的研究表明，TET2是血細胞形成的主要調控因子，與血液瘤密切相關。TET2突變和缺失發生在急性髓細胞白血病（AML）、慢性粒單核細胞白血病（CMML）、骨髓增生障礙綜合征（MDS）和骨髓增生性腫瘤（MPN）中［6-7］，TET2的突變導致Tet2蛋白功能缺失，至使5hmC 含量降低，無法抑制甲基化DNA 與相關蛋白結合產生沉默作用，導致骨髓造血干細胞加快增殖［8］。近期研究發現，TET2的缺失可改變細胞的表觀遺傳環境，改變了細胞的分化狀態和增殖能力，導致早期干細胞獲得克隆性生長優勢，促進了人類記憶CAR-T 細胞的發育，提高CAR-T 細胞的療效和持久性，使其能夠引發有效的抗腫瘤反應［9-11］。

CRISPR/Cas 系統是細菌和古細菌體內的獲得性免疫系統，被用來對抗侵略細菌的外源DNA，質粒和噬菌體。Cas9 蛋白是一種DNA 內切酶，擁有兩個核酸酶結構域，因此可以同時對雙鏈DNA 進行切割。其具體過程是Cas9 先和crRNA、tracrRNA 結合形成復合體，然后在PAM 序列的引導下侵入外源DNA，進而形成RNA-DNA 中間結構，再對靶DNA進行切割，使其雙鏈斷裂。此時機體通過同源末端修復或非同源末端修復來填補斷裂的缺口［12-14］。

目前，由于T 細胞用化學試劑轉染效率低，CAR-T 技術采用重組慢病毒載體對T 細胞進行基因編輯，然而重組病毒隨機整合基因組有著不可預估的風險［15-17］。細胞電轉染（Electroporation），是把外源大分子物質DNA、RNA、siRNA、蛋白質等以及一些小分子導入細胞膜內部的重要方法，電轉過程對細胞毒性很小。使用體外表達的Cas9 蛋白與轉錄的TET2gRNA 孵育形Cas9/gRNA 核糖核蛋白復合物通過電轉染的方式導入T 細胞內，能快速高效的對目的基因進行編輯，避免了隨機整合的問題，且敲除效率高，Cas9 蛋白半衰期短，因此也能大限度的減少脫靶和鑲嵌現象［18-20］。

本工作以人T 細胞為對象，優化T 細胞電轉條件，利用電轉Cas9 RNP 對TET2基因高效敲除，并探究了該基因對T 細胞增殖的影響，旨在為CAR-T細胞治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人新鮮外周血來自實驗室同學捐獻。X-VIVO15（LONZA）、Ficoll（GE Healthcare）、IL-2、CD3、CD28 均來自北京同立海源生物科技有限公司。

大 腸 桿 菌E.coliBL21 和DH5α 感 受 態 購 自于北京全式金生物科技有限公司，pSpCas9-2Apuro（pX459）V2.0 和pET28a+ 來 源 于Addgenes，pET28a-Cas9-NLS-6xHis 質粒由上述兩質粒構建而成（圖1-A）。TET2基因敲除sgRNA 序列相對應的寡核苷酸由擎科生物科技有限公司合成，Agarose 瓊脂糖、異丙基硫代半乳糖苷Isopropyl β-D-Thiogalactoside（IPTG）、蛋白酶抑制劑Phenylmethanesulfonyl fluoride（PMSF）、咪唑均購自美國Sigma 公司；質粒小提試劑盒、基因組提取試劑盒、片段純化試劑盒均購自TaKaRa 公司；T7 體外轉錄試劑盒購自唯尚立德生物科技有限公司；T7EⅠ酶切試劑盒購自NEB 公司；Ni-NTA 親和樹脂購自德國 QIAGEN 公司；BamH Ⅰ限制性內切酶購自Thermo Fisher 公司

1.2 方法

1.2.1 Cas9 蛋白表達與純化 以pSpCas9-2A-puro（pX459）V2.0 為模板通過體外PCR 擴增方式獲得Cas9 蛋白CDS 區，所設計的上游引物為5′-CAGCA AATGGGTCGCGGATCCGACAAGAAGTACAGCATCG GC-3′；所設計的下游引物為5′-ACGGAGCTCGAATT CGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGC-3′。產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小是否正確以及單一，純化回收PCR 產物-20℃保存備用。Fast DigestBamHI Enzyme（Thermo Fisher）對大腸桿菌蛋白表達載體pET28a+進行酶切純化。不依賴于連接反應的高效克隆方法（Ligation-independent cloning，LIC）將Cas9 蛋白CDS 區與酶切后的pET28a+載體通過同源重組的方式進行構建連接。將重組載體轉化進行一代測序，BioEdit 軟件分析重組載體是否成功構建以及是否基因突變，成功構建pET28a-Cas9-NLS-6xHis 后-20℃保存待用。

在大腸桿菌蛋白表達系統中進行Cas9 蛋白表達純化，選擇Rosetta（DE3）大腸桿菌作為表達菌株。首先將pET28a-Cas9-NLS-6xHis 載體轉化至Rosetta（DE3）感受態細胞中，轉化后涂板挑取單克隆加入無抗性LB 培養基37℃震蕩培養。取部分菌液測序驗證轉化是否成功，繼續活化擴培菌液，將種子液按照1∶100 的比例加入至含卡那霉素抗性的LB 培養基中37℃震蕩培養，當大腸桿菌長至對數生長期既OD600為0.6-1.0 時將培養溫度調為18℃，加入1 mmol/L IPTG 進行Cas9 蛋白誘導表達12 h。誘導完畢后離心收集菌泥，以裂解液重懸菌泥進行超聲破碎菌體，離心收取菌液上清。Ni 填料能與HIS 標記蛋白螯和在一起，使用Ni 填料能夠將Cas9 蛋白從蛋白上清液中分離出來。Ni 填料與蛋白上清液4℃搖床孵育2 h 后，用分別含20、50 mmol/L 咪唑的清洗液洗去鎳填料中攜帶的雜蛋白，含300 mmol/L 咪唑的洗脫液洗脫鎳填料結合的Cas9 目的蛋白，收集洗脫樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳考馬斯亮藍染色和His 抗體蛋白印記檢測Cas9 蛋白純度。以不含咪唑的洗脫液為置換液使用蛋白超濾濃縮管置換出洗脫液中的咪唑，測定蛋白濃度保存至-80℃待用。

1.2.2 sgRNA 體外轉錄 設計人類TET2基因CRISPR/Cas9 基 因 敲 除sgRNA 序 列（ 表1）， 以pSpCas9-2A-puro（pX459）V2.0 為 敲 除 載 體 構 建pX459-h-TET2 重組載體，測序驗證載體是否構建成功。設計T7-gRNA 引物以pX459-h-TET2 模板進行體外擴增，得到1 個由crRNAs 和tracrRNAs 共同組成gRNA 長約110 bp 的片段。將獲得的PCR 產物純化回收，取1 μg 產物用T7 體外轉錄試劑盒轉錄，完成后加入DNase I 37℃反應40 min，純化回收后測RNA 濃度，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，-80℃保存待用。

表1 用于TET2 gRNA 體外轉錄引物

1.2.3 sgRNA 及Cas9 蛋白活性驗證 將表達純化的Cas9 蛋白取5 μg，sgRNA 0.5 μg，TET2片段模板1 μg（HEK-293 細胞基因組PCR 獲得，所設計的上游引物為5′- AGTAGATCAGGAGGAGGCACA-3′；下游引物 為5′- ATTCTGGCTTCCCTTCATACA-3′），在Fast digest buffer 中37℃反應1 h，酚氯仿異戊醇純化回收，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測Cas9 蛋白切割效率開。

1.2.4 PBMC 細胞中分離T 細胞培養 使用Ficoll-Paque 在人新鮮全血中分離獲得外周血單核細胞（PBMC），X-VIVO15（LONZA）培養基對分離后的PBMC 進行培養。Human T cell Isolation Kit 試劑盒（Miltenyi）分離純化PBMC 細胞中的T 細胞，分離得到的T 細胞在體外使用X-VIVO 15 培養基培養。人類T 細胞進行電轉染后培養基中需加入抗人CD3單克隆抗體與抗人CD28 當克隆抗體200 ng/mL、白細胞介素2（IL2）40 ng/mL 刺激T 細胞活化生長，電轉染48 h 后培養基中只需加入IL2 刺激生長即可。

1.2.5 T 細胞電轉Cas9-TET2gRNA 核糖核蛋白 按照3∶1 的比例將Cas9 蛋白與TET2gRNA 進行體外孵育形成Cas9-gRNA 核糖核蛋白復合物（RNP），將3×106T 細胞使用20 μL 電轉緩沖液重懸，加入Cas9-TET2 gRNA 復合物（Cas9 3 μg，TET2gRNA 1 μg）進行電轉染，電轉條件為850 V、20 ms，以電轉綠色熒光蛋白GFP 作為陽性對照，電轉后加入X-VIVO15（LOZA）培養基培養。

1.2.6TET2基因敲除驗證 T 細胞電轉染48 h 后，提取細胞基因組，在sgRNA 對應基因組位置設計驗證引物進行體外片段擴增，將目的片段進行測序驗證是否造成基因突變，并且使用T7EⅠ核酸內切酶進行敲除效率驗證。

1.2.7TET2基因缺失對T 細胞增殖的影響 在T 細胞中對TET2基因敲除之后，驗證TET2的缺失是否會對T 細胞的生長增殖產生影響。使用臺盼藍細胞計數法檢測T 細胞存活率以及細胞數量。通過流式細胞分析儀檢測不同時間點CD4、CD8 陽性T 細胞的比例。

2 結果

2.1 Cas9蛋白表達

通過原核表達系統在Rosetta（DE3）大腸桿菌中誘導表達Cas9 蛋白，成功的獲得帶有核定位信號的重組Cas9 蛋白，其分子量大小為160 kD。Ni 填料與His 標簽特異性親和層析純化，50 mmol/L 咪唑的洗液能夠去除Ni 填料上雜蛋白，含300 mmol/L咪唑洗脫液將Cas9 蛋白從Ni 填料上洗脫下來。純化后的蛋白通過考馬斯亮藍染色與蛋白印記孵育His標簽抗體檢測表達純化后的蛋白條帶單一無雜帶，得到純度較高的Cas9 蛋白（圖1）。

2.2 Cas9蛋白活性及TET2 gRNA靶點切割效率鑒定

表達純化的Cas9 蛋白以陽性gRNA 與基因片段為模版進行體外酶切實驗，表達純化的Cas9 蛋白能夠將基因片段在sgRNA 位置處對目的基因片段進行切割，瓊脂糖凝膠電泳觀察目的基因片段被切割成兩條小片段，大腸桿菌誘導表達Cas9 蛋白具有酶切活性。表達的Cas9 蛋白與TET2gRNA 形成核糖核蛋白復合物后能夠可以高效的切割TET2基因片段（746 bp），Cas9 蛋白酶切后產生大小為490 bp 和256 bp 的片段（圖2），設計的TET2gRNA 在體外能夠識別靶標基因并引導Cas9 蛋白對靶標序列進行切割。

2.3 T細胞電轉染效率及TET2基因敲除效率檢測

將Cas9TET2gRNA 核糖核蛋白復合物通過電轉染的方式導入T 細胞中，綠色熒光蛋白GFP 作為陽性對照。通過流式細胞儀分析結果顯示44.1%的T 細胞通過電轉染導入綠色熒光蛋白細胞發出綠色熒光，使用Lipofectamine2000 轉染效率較低，只有1%的T 細胞通過脂質體轉染發光，常規化學轉染方式不能有效的將外源蛋白和質粒轉染進入T 細胞內，電轉染的方式能夠高效率的將外源蛋白或質粒帶入T 細胞內（圖3）。T7 核酸內切酶（T7EⅠ）能夠識別不完全配對的雙鏈DNA，T7EⅠ能夠在非配對處對DNA 鏈進行切割。通過T7EⅠ酶切能夠檢測基因敲除效果，T7EⅠ能夠在TET2基因靶位點處將基因片段切割成兩條片段，表明在sgRNA 對應的基因組位置堿基序列發生了基因突變。將TET2基因組上sgRNA 序列特異性體外擴增測序發現，在sgRNA位置后TET2基因發生移碼突變，表明T 細胞中的TET2基因被成功敲除（圖4）。

2.4 TET2敲除對T細胞增殖的影響

PBMC 中分離純化的T 細胞在電轉染2 d 內，細胞由于電穿孔損傷會使部分細胞死亡，活細胞數量統計顯示死亡率為42.1%，在培養基中加入IL-2、CD28 等細胞因子的刺激下T 細胞培養2 d 后開始增殖。之前研究表明T 細胞在體外生長一段時間，隨著時間的延長T 細胞會逐漸死亡。在T 細胞中敲除去甲基化酶TET2后，T 細胞的生存時間及增殖速率發生變化。野生型T 細胞在體外培養至20 d 左右時細胞活率逐漸下降細胞數減少且狀態變差。T 細胞缺失TET2基因后細胞在體外培養20 d 依然表現出良好的生長狀態，細胞活率與數量明顯高于野生型細胞。臺盼藍作為一種細胞染料能夠特異性的將死細胞染成藍色，通過臺盼藍計數的方式能夠檢測細胞增殖數量。在T 細胞中敲除TET2基因后，敲除型T 細胞比野生型T 細胞細胞數量增殖顯著加快（圖5）。CCK 能夠與活細胞線粒體內的脫氫酶形成還原性可溶物甲臜，甲臜的檢測數與活細胞細胞數成正比，從而間接檢測出隨著培養時間的延長細胞增殖情況（圖6）。CCK 結果顯示當T 細胞缺失TET2后細胞的增殖速率以及體外培養時間長于野生型T 細胞，野生型T 細胞體外培養活力逐漸降低的同時缺失TET2的T 細胞還保持著良好的生長狀態。實驗結果顯示在T 細胞中缺失TET2基因后能夠延長T 細胞在體外培養時間，同時在電轉16 d 后流式細胞術檢測T 細胞表面CD4 和CD8 分子，結果（圖7）顯示野生型與敲除型無明顯差異，表明TET2的敲除使T 細胞的功能并未受到影響。但是TET2基因是如何調節T 細胞在體外培養時間的還并未詳知，也許TET2作為去甲基化酶調節細胞周期活動具有相關性。

圖1 Cas9 蛋白表達與純化

3 討論

T 淋巴細胞作為人體細胞免疫的重要成分，T細胞在淋巴細胞中數量最多，其由胸腺內的淋巴干細胞分化而成，為功能最復雜的一類細胞。T 細胞行使正常功能對人類抵御疾病非常重要，2012 年美國科學家以HIV 病毒為載體將T 細胞進行改造使其可以殺傷人體內白血病細胞。CAR-T 免疫細胞治療主要以慢病毒載體對T 細胞進行基因改造，由于常規的化學轉染試劑對于T 細胞轉染效率較低，在T 細胞中基因編輯的研究相對較少且具有一定難度，且還未有在T 細胞基因組原位插入嵌合抗原受體（CAR）的CAR-T 細胞出現。CRISPR/Cas9 基因編輯技術發現與古細菌天然免疫防疫機制，是繼鋅指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）與類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）之后的流行性較廣使用方便的基因編輯技術。CRISPR/Cas9 基因編輯技術以sgRNA 作為向導對靶基因進行特異性的指向，然后在Cas9 蛋白作用下將DNA 雙鏈切割導致斷裂，然后在非同源末端修復時產生堿基的插入或者缺失形成錯配而將目的基因敲除，造成基因功能的缺失。

通過向宿主細胞輸運CRISPR Cas9/gRNA 核糖核蛋白復合物（Cas9 ribonucleoprotein complexes，Cas9 RNP）是進行各種基因編輯、基因表達調控、是進行基因編輯的重要方法。由于快速高效、脫靶率低、不需要優化密碼子和啟動子等，該方法易應用于進一步的基因治療和臨床研究中。電轉染（Electroporation）是一種簡單高效的蛋白轉染方式。應用該技術，不僅能將Cas9 RNP 直接導入細胞質，而且能夠使其穿過核膜進入細胞核，從而快速高效地目標基因進行編輯。因此，在基于電轉技術的Cas9 RNP 基因編輯研究中，通過電轉染對該復合物基因編輯效率的影響具有十分重要的意義。

圖2 Cas9 和gRNA 體外酶切活性鑒定

圖3 電轉染GFP 蛋白效率檢測

本研究構建了攜帶有核定位信號的Cas9 蛋白表達載體，在大腸桿菌蛋白表達系統中誘導Cas9蛋白表達。由于大腸桿菌蛋白表達系統均有操作方便快捷、時間周期短、獲得蛋白量大等特點，能夠在短時間內獲得大量的Cas9 蛋白。人為在Cas9 蛋白C 端融合表達了6 個組氨酸，His 標簽能夠特異性的與Ni 填料結合，含不同濃度梯度咪唑的洗脫液將雜蛋白和目的蛋白洗脫下來，從而特異性的分離純化Cas9 蛋白。考馬斯亮藍染色與anti-His 蛋白印記結果顯示得到純度較高且條帶單一的目的Cas9蛋白。在pX459 敲除載體上構建pX459-H-TET2 重組敲除載體，體外擴增的方式獲得靶標目的基因的tracrRNA/crRNA DNA 片段，在T7 轉錄酶的作用下將片段轉錄為RNA。通過體外酶切實驗，誘導表達的Cas9 蛋白能夠在以TET2sgRNA 序列指引下對靶標基因片段特異性的切割，驗證了Cas9 蛋白以及TET2gRNA 的有效性，這也有助于體外基因診斷試劑的開發。

圖4 T 細胞TET2 基因敲除驗證

圖5 臺盼藍計數檢測細胞增殖

圖6 CCK-8 細胞計數檢測細胞活力

之前的研究表明TET2缺失對造血系統發育有影響，TET2缺失的小鼠表型出現骨髓增生，包括脾腫大、單核細胞增多和髓外造血，造血干細胞增多，干細胞自我更新加快和髓外造血功能增強，這提示TET2功能不全可能有助于體內造血轉化［21］。在TET2缺失小鼠模型上對T 細胞的研究表明TET2促能進CD4+Th 細胞分化［21］。TET2與TET3能協同穩定調節性T 細胞中Foxp3 的表達，且在急性病毒感染期間，體內缺乏TET2的CD8+T 細胞中細胞因子的產生和效應分子的表達增加。缺乏TET2的記憶細胞具有完整的擴張和效應反應，并具有更強的病原體清除能力［22-23］。2018 年5 月，Carl H.June 團隊［24］報道了一名慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者在2013 年接受CAR-T 治療，第一次接受CAR-T 治療發生了細胞因子風暴（CRS），給予IL-6 阻斷劑后得到緩解。隨后又接受第二次CART 治療，第二年骨髓內慢性淋巴細胞白血病（CLL）為陰性。第三年骨髓中仍可檢出CAR-T 細胞，到第五年CLL 并未復發。檢測發現患者的TET2基因有一個拷貝發生突變并將Anti-CD19 CAR 序列插入到TET2基因上。正常情形下，TET2基因調節血細胞的形成，并限制這些細胞的生長。一旦TET2基因被破壞，單個CAR-T 細胞大量增殖并消滅這名患者所患的白血病細胞。因此，CAR-T 細胞中TET2缺失足以在晚期白血病中介導強大的抗腫瘤作用。目前對于T 淋巴細胞基因編輯主要還是以慢病毒載體與“睡美人”轉座子載體為主，上述載體的作用原理均是通過不同作用方式隨機整合在細胞基因組內，可能會造成宿主基因突變導致腫瘤的形成，或者是整合致死等風險。CRISPR/Cas9 技術在靶標基因位點進行基因編輯能夠有效避免慢病毒載體造成的不利影響。然而常規的化學轉染試劑對于T 淋巴細胞轉染效率很低，采用電轉染的方式將外源DNA 或者蛋白質導入到T 淋巴細胞內是主要的研究方法。由于RNP 具有較高的基因編輯效率，在體外將Cas9 蛋白與TET2gRNA 形成Cas9 RNP 復合物電轉染進入T 淋巴細胞內，通過T7EⅠ體外酶切與靶基因組測序結果顯示，將Cas9 蛋白與TET2gRNA 電轉進入T 細胞內能夠實現對宿主細胞TET2基因高效率的敲除，T 淋巴細胞在缺失TET2基因后，T 細胞能夠表現出無限增殖的能力，細胞數量隨著培養時間延長而逐漸增多。這些結果與上述TET2基因的功能相一致，有可能加強CAR-T 的免疫治療效果。

圖7 電轉第16 dCD4+、CD8+T 細胞比例分布情況

4 結論

本研究中使用核糖核蛋白復合物通過電轉染方式在T 細胞中成功敲除TET2基因，T 細胞缺失正常TET2蛋白表達后，細胞增殖速率加快且在體外培養時間延長。