基于L5178Y 細胞體外Pig-a 基因突變試驗方法的建立與初步探索

王亞楠 文海若 王雪

（中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價監測中心 藥物非臨床安全性評價研究北京市重點實驗室，北京 100176）

基因突變通常指基因在堿基對上發生的組成或排列順序的改變，主要的突變類型分為堿基置換突變（點突變），移碼突變，缺失突變，插入突變等。外顯子編碼基因發生突變后通過轉錄、翻譯使多肽（鏈）中氨基酸組成或順序發生改變，進而影響蛋白質或酶的生物功能，使機體的表型出現異常。堿基突變是癌癥發生與發展的重要物質基礎，也是遺傳毒性評價的重要的檢測終點之一。Pig-a基因編碼形成糖磷脂酰肌醇（GPI）錨定生物合成所需的N-乙酰葡糖胺基轉移酶的催化亞基，在不同種屬之間具有結構、功能的高度保守性［1］。Pig-a基因位于X染色體，其片段中單一突變即可影響GPI 錨的合成并導致細胞表面GPI 錨鏈蛋白的缺失，從而可通過檢測細胞膜表面錨鏈蛋白表達水平評價受試物的潛在遺傳毒性風險。Araten 等［2］最初于1999 年建立以Pig-a基因為報告基因的體內基因突變試驗方法。基于流式細胞術測定GPI 錨鏈蛋白缺失的體內Pig-a基因突變試驗近年來得到迅速的發展，可使用小鼠、大鼠、非人靈長類、人類的造血細胞檢測受試物的體內致突變性，且基于大鼠的檢測方法已通過聯合驗證證明其重復性及可轉移性［3-6］。

基于Pig-a基因在不同種屬之間高度的結構、功能保守性，以人類B 淋巴細胞樣細胞系TK6、MCL-5 以及L5178Y 等哺乳動物細胞系開展的體外Pig-a基因突變試驗也獲得一些進展。McKinzie 等［7］對L5178Y 進行全基因組測序研究，參與GPI 錨鏈蛋白合成的基因測序研究結果顯示發現所有編碼基因均存在于L5178Y 中，且沒有任何一個基因表現出明顯的有害突變，在所有編碼GPI 錨鏈蛋白基因中只有Pig-a基因存在純和突變，其他基因均為雜合突變，預測L5178Y 細胞適用于體外Pig-a基因突變研究。Wang 等［8］首次報道采用L5178Y 細胞進行體外Pig-a突變研究，隨后David 等［9］對該方法進行了驗證研究，采用不同作用機制的8 種化合物研究結果表明，體外Pig-a基因突變試驗不但可以進行基因突變突變誘導檢測，更重要的是可以區分不同作用機制遺傳毒性物質，此外還證明了GPI 錨鏈蛋白CD90 的缺失不是通過環乙亞胺處理抑制蛋白合成。以TK6 細胞為試驗體系的研究中，2015 年Kruger 等［10］建立了基于TK6 細胞的體外Pig-a基因突變檢測方法。在前期實驗基礎上，Kruger［11］又進行了相關基因型與TK6 細胞表型的關系。國內李若婉等［12］建立基于TK6 細胞的體外Pig-a基因突變方法。就上述各種報道研究采用不同的細胞系而言，全基因組測序證實L5178Y 細胞中不攜帶Pig-l基因突變［7，10-11］，故試驗前期無需進行自發突變清除，但TK6 細胞中Pig-l基因的缺失造成自發突變清除前TK6 細胞中觀察到的高水平Pig-a背景突變，在進行正式實驗之前需要預清除自發突變細胞。此外L5178Y 細胞還開展tk/hprt基因突變研究，對同一物質可進行不同基因水平致突變聯合研究。

本研究在國內首次使用小鼠淋巴瘤（L5178Y）細胞建立和驗證體外Pig-a基因突變實驗，以期在體內Pig-a試驗之前進行體外Pig-a基因突變遺傳毒性評價，提供可能的體外結果指示。本方法的建立對Ames 試驗弱陽性結果以及在藥物代謝產物、雜質的遺傳毒性研究上具有很大的實用價值，為化合物體外遺傳毒性評價，藥物研發早期遺傳毒性篩選提供新選擇［13-14］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 二甲基亞砜（DMSO）（批號：#BCBW5664），G-6-P（ 批 號：#WXBC7942V），NADP（批號：18E2156560），青鏈霉素混合液（批號：2019313），N-乙基-N-亞硝基脲（N-nitroso-Nethylure，ENU）（批號：MKCD2123），甲基磺酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS）（批 號：126K0758），4- 硝 基 喹 啉-N- 氧 化 物（4-nitroquinoline N-oxide，4-NQO）（批號：89C-0710），苯并芘（BenzoaPyrene，B（a）P）（批號：SLBF45532）購自Sigma。葡萄糖（glucose，Glc）（批號：20181019），氯化鈉（Sodium chloride，NaCl）（批號：20190121），多聚甲醛（批號：20141218），丙酮酸鈉（批號：20160612）購自國藥集團化學試劑有限公司。RPMI1640 培養基（批號：2025394）購自Gibco。馬血清（批號：AC10235369），PBS（ 批 號：AD19942268） 購 自Hyclone。APC-Anti-CD45（ 批 號：7166674），PEAnti-CD90.2（批號：7110569）購自BD biosciences。Anti-PE MicroBeads（ 批 號：51810917330），LS Columns（批號：5180614049）購自Miltenyi。肝勻漿S9（批號：20181105）購自北京安保迪科技有限公司。山羊血清（批號：428E051）購自索萊寶科技有限公司。Rat mAb to CD90（批號：GR3226793-2），RbPAb to CD4（GR3240865-1），山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 568）（ 批 號：GR3230171-3），山 羊 抗 大 鼠IgG H&L（Alexa Fluor? 488）（批 號：GR3240085-1），DAPI Staining Solution（ 批 號：GR3253253-2） 購 自Abcam。TRNzol 總RNA 提 取試劑（批號：DP405-02）購自天根生化科技（北京） 有 限 公 司。PrimeScriPtTMRT reagent Kit with gDNAEraser（ 批 號：RR047B），2xEs TaqMasterMix（批號：CW0718）購自TaKaRa（寶生物）。引物由Invitrogen 合成。

1.1.2 細胞 小鼠淋巴瘤細胞L5178Ytk+/--3.7.2C，引自日本國立醫藥品食品衛生研究所，支原體檢查后于液氮長期保存，研究所用細胞為復蘇傳代后10代以內。

1.1.3 儀器 流式細胞儀（FACSCalibur，BD bioscience），高速冷凍離心機（Centrifuge 5810R，Eppendorf），倒置熒光顯微鏡（IX71，Olympus），二氧化碳 培 養 箱（HERA cell VIOS 160i，Thermo Fisher），生物安全柜（NU-543-400S，Nuair），倒置顯微鏡（CKX31，Nikon），免疫磁性分離架（QuadroMACSTMSeparator，Miltenyi），分光光度計（NANODROP 2000，Thermo scientific），凝膠成像系統（Tanon 1600，上海天能科技有限公司），PCR 儀（ABI，Applied Biosystems）。

1.2 方法

將L5178Y 細胞解凍復蘇后置于完全培養基R10（含有10%馬血清，1%青鏈霉素混合液，0.2 mg/mL 丙酮酸鈉的 RPMI 1640）在37℃、5% CO2的培養箱內培養，培養基隔天更換，待細胞增殖至適宜密度后進行試驗。

1.2.1 細胞毒性 通過細胞相對倍增速率（Relative population doubling，RPD）進行評價：

細胞倍增速率（Population doubling，PD）=［log（受試物處理后細胞量/初始細胞量）］/log 2；RPD=（受試物組PD/對照組PD）×100%。

1.2.2 連續（24 h）處理組 細胞達對數生長期后，更換R0 培養基（含有1%青鏈霉素混合液，0.2 mg/mL 丙酮酸鈉RPMI 1640），并添加不同濃度的Glc（0、5.625、11.25、22.5、45 μg/mL），NaCl（0、1.8、3.75、7.5、15、30、60 μg/mL），EMS（0、10、100、200、300、400、500 μg/mL），ENU（0、25、50、75、100、125、250 μg/mL），調整細胞密度為5×105個細胞/mL 于10 mL 培養基中，細胞于37℃，5%CO2條件下與受試物作用24 h。處理結束后收集細胞并計數，細胞經離心（1000 r/min，5 min，室溫），PBS 洗滌兩次，細胞重懸于10 mL 完全培養基R10，表達期細胞密度維持在1.0×106-2.0×106個細胞/mL。

1.2.3 短時（4 h）處理組 細胞達對數生長期后，更換R0 培養基（含有1%青鏈霉素混合液，0.2 mg/mL 丙酮酸鈉的 RPMI 1640），并添加不同濃度的4-NQO（0、0.01、0.05、0.075、0.10、0.15、0.20 μg/mL），B（a）P（0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL）和2% S9mix，調整細胞密度為5×105個細胞/mL 于50 mL 離心管中。37℃，20 r/min 振搖4 h。細胞經離心（1000 r/min，5 min，室溫）后，PBS 洗滌兩次，重懸于10 mL 完全培養基R10。給藥后24 h 后作細胞計數，表達期細胞密度維持在1.0×106-2.0×106個細胞/mL。

1.2.4 流式門控模板調試 取2×106個細胞離心（1000 r/min，4℃，5 min），每孔加入200 μL APCanti-CD45 和PE-anti-CD90.2 混合工作液，終濃度為1 μg/mL，2-8℃避光孵育30 min，后置于室溫繼續孵育10 min，離心（340×g，4℃，3 min），收集細胞進行流式檢測，初步確定適宜電壓及補償策略。

在EMS 給藥表達后第21 天收集5×108個細胞離心（1000 r/min，4℃，5 min），加入2.5 mLAPCAnti-CD45 和PE-Anti-CD90 抗體工作液，2-8℃避光孵育30 min，后置于室溫繼續孵育10 min，離心（300×g，4℃，5min），加入120 μL anti-PE 磁珠于500 μL 工作液（2% FBS+PBS）混勻，置于2-8℃，避光孵育15 min，離心（340×g，5 min，4℃），加入5 mL 工作液（2% FBS+PBS）混懸均勻。提前準備工作液（2% FBS+PBS）潤洗LS 柱子，過柱分離，收集流出組分，離心（340×g，5 min，4℃），收集細胞進行流式檢測，用于確定流式檢測模板。

1.2.5Pig-a基因突變檢測周期的確定 L5178Y 細胞分別經不同濃度EMS 處理后，于給藥后第4、8、12、16、20 天檢測Pig-a基因突變頻率，以確定最大突變頻率發生時間點。

1.2.6 免疫熒光成像分析 取野生型細胞和突變型細胞混合，置于4%多聚甲醛室溫固定20 min，5%山羊血清37℃封閉30 min，一抗RbpAbCD45（1μg/mL）和Rat mAb to CD90（1 μg/mL）4℃孵育過夜， 二 抗Goat-anti-Rat（AlexaFluor 488） 和Goatanti-Rb（AlexaFluor 568）及DAPI 4℃避光孵育1 h，熒光顯微鏡成像分析。

1.2.7 突變位點檢測 富集ENU 致突變型細胞，進行PCR方法檢測組織樣本中目的基因序列突變位點。從NCBI 數據庫確認小鼠Pig-a基因序列，引物設計見表1。

表1 小鼠淋巴瘤L5178Y 細胞Pig-a 基因引物設計

采用TRIzol 總RNA 提取試劑進行樣本RNA 提取，PrimeScriPtTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 進行cDNA 反轉錄。

PCR 樣本檢測：將所有cDNA 樣品分別配置RealtimePCR 反應體系。按以下程序進行：95℃，3 min；30 個PCR 循 環（95℃，30 s，58℃，30 s，72℃，40 s）；72℃，5min。擴增結束后取5 μL 產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，切膠回收目的片段，經DNA 凝膠回收試劑盒純化后，用ABI PRISM TM377XL 測序儀以末端標記雙脫氧法測序，Chromas軟件（TechnelysiumPly Ltd. Version 2.6.2）分析測序結果。

1.2.8 數據處理 試驗數據采用GraphpadPrism7（USA，Graphpad Software 公司）進行數據統計，采用One Way ANOVA 檢驗將各受試物處理組的突變率與溶媒對照組作比較，組間比較P＜ 0.05 視為差異存在統計學意義。

2 結果

2.1 細胞毒性測定結果

不同受試物給藥24 h 或4 h 后的RPD 結果如圖1 所示。給藥24 h：非S9代謝活化條件下：Glc，NaCl，EMS，ENU，給藥4 h 組：S9代謝活化條件下B（a）P，4-NQO 所設濃度組RPD 均大于50%。提示本研究受試物在給藥濃度范圍內均未見無明顯細胞毒性作用，排除試驗中假陽性結果。

2.2 流式門控調試

初步流式門控調試如圖2 所示。分別對細胞進行空白對照、單染APC-anti-CD45、PE-anti-CD90.2和雙染進行流式電壓、補償等調試至合適的圖譜，初步確定合適的流式門控策略，收集突變體細胞對突變域進一步完善確認。

收集突變表達21 d 后的EMS 細胞通過免疫磁性分離技術對突變型細胞進行富集后進行流式檢測（圖3-A），通過上述流式門控策略調試進一步確定R2 區域為GPI（-）區域，即CD45（+）/CD90.2（-）。

2.3 Pig-a基因突變檢測周期的確定

Pig-a基因突變頻率變化見圖4，呈現先上升后下降趨勢，整體在第8 天左右呈現最大突變頻率，最終確定細胞在受試物作用時間結束后表達8 d 作為Pig-a基因突變頻率檢測時間終點。

圖1 不同受試物給藥24 h 或4 h 后的RPD（±s，n=3）

圖2 流式模板初步調試過程圖

2.4 不同受試物突變頻率

EMS、ENU、NaCl、Glc 作用24h，B（a）P、4-NQO 給藥4 h 表達8 dPig-a基因突變頻率檢測結果（圖5-6）顯示，非S9代謝活化條件下，EMS 濃度大于100 μg/mL 時，Pig-a基因突變率與溶媒對照組相比，存在顯著性差異（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001），且呈濃度遞增趨勢；ENU 濃度大于125 μg/mL 時，Pig-a基因突變率與溶媒對照組相比，存在顯著性差異（**P＜0.01，***P＜0.001），且呈濃度遞增趨勢。

S9代謝活化條件下，當B（a）P 濃度大于2.0 μg/mL 時，Pig-a基因突變率與溶媒對照組相比，存在顯著性差異（*P＜0.05，***P＜0.001），且成濃度遞增趨勢。當4-NQO 濃度大于0.075 μg/mL 時Pig-a基因突變率與溶媒對照組相比，存在顯著性差異（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001），且成濃度遞增趨勢。

非S9代 謝 活 化 條 件 下， 陰 性 對 照Glc、NaClPig-a基因突變率與溶媒對照組相比，不存在顯著性差異（P＞0.05），且無濃度梯度關系。

圖3 流式突變區域確認與質控圖

圖5 EMS、ENU 給藥24 h，B（a）P、4-NQO 給藥4 h 表達8d Pig-a 基因突變頻率

2.5 免疫熒光結果

采用免疫熒光方法染色識別細胞核（DAPI，藍色）、細胞表面CD45（AlexaFluor 568，橙色）和細胞表面CD90.2（AlexaFluor 488，綠色）后，可見細胞表面僅表達綠色熒光信號的突變細胞和同時表達紅色及綠色熒光信號的野生型細胞（圖7）。

圖6 NaCl、Glc 給藥24 h 表達8 d Pig-a 基因突變頻率

圖7 免疫熒光結果圖

2.6 突變位點序列分析

PCR 結果（表2）測序顯示存在4 種突變類型。

3 討論

表2 Pig-a 基因突變類型

已知非致突變化合物NaCl 和Glc 在本研究體系中均顯示為陰性結果，細胞與兩者共同作用24 h 后表達8 d 均未見CD90 突變率增加。EMS 屬于烷化劑，在非代謝活化狀態下可導致基因突變，以點突變為主。ENU 則是體內Pig-a基因突變首選陽性劑，可導致DNA 堿基烷化、互補堿基對橫向交聯等損傷，最終引發基因突變［15］。本研究結果顯示，上述兩種陽性劑均可在非代謝活化條件下引起L5178Y 細胞Pig-a基因突變率顯著性升高，大于陰性對照的10倍。陽性劑B（a）P 則需經細胞微粒體中的混合功能氧化酶激活轉化為環氧化物，與DNA 共價結合形成加合物，從而誘發突變［16］。4-NQO 在還原酶的作用下可轉化為4-羥氨基喹啉-1-氧化物及4-乙酰基喹啉-1-氧化物，后者能以共價結合的方式結合核酸形成DNA 加合物，引起堿基的改變（G →A）［17-18］。本研究結果顯示在S9代謝活化條件下，B（a）P 濃度大于2 μg/mL 時與L5178Y 細胞作用4 h 后可引起Pig-a基因突變率顯著性升高，大于陰性對照的10倍。4 種陽性化合物與2 種陰性化合物的試驗結果與預期相符。

EMS 作用于L5178Y 細胞24 h 后進行20 d 表達培養，分別于第4、8、12、16、20 天檢測Pig-a基因突變頻率，整體趨勢呈現出先上升趨勢，于8 d左右出現峰值，后隨時間推移呈現下降趨勢，提示最佳檢測時間點為8 d。陽性劑體內Pig-a基因突變頻率變化為上升而無下降趨勢，體內/外Pig-a基因突變頻率變化趨勢存在一定差異，主要原因是受試物進入機體后產生骨髓毒性，通過不斷造血將突變細胞釋放至外周血，產生累積效應。但L5178Y 細胞需通過稀釋傳代維持在合適的細胞密度，當表達峰值過后再進行稀釋傳代，突變細胞比例降低，故突變頻率呈現下降趨勢。L5178Y 細胞在給藥濃度設置上應明確最高劑量，細胞毒性RPD 應大于或略低于50%，以排除因細胞毒性過大而造成的假陽性結果。免疫熒光結果進一步證實突變細胞表面無CD90表達。

ENU 致突變細胞測序結果顯示存在G →C，A →C，C →T 三種不同類型的點突變。相關研究顯示采用不同陽性劑有不同的突變類型。David R等［9］研究結果顯示EMS 作用L5178Y 細胞后主要的突變類型有G →A，C →T 兩種突變類型；Javier Revollo 等［19］發現B（a）P 誘導的Pig-a基因突變主要是G：C 或富含G：C 序列的堿基對的取代，小插入或缺失等，主要的突變類型有G →T，G →C，G →A，A →T，T →C。

基因突變檢測是遺傳毒性評價的重要手段，本研究所用L5178Y 細胞建立Pig-a基因突變試驗，與體內Pig-a基因突變試驗相比可大幅度節省試驗成本，檢測耗時周期短，不涉及動物倫理，符合“3R”原則。可適用于Ames 試驗中不適宜檢測的化合物，作為后續追蹤檢測。相較于傳統的hprt或tk基因突變存在一定的優勢，試驗耗時短，耗材少，可進行高通量檢測。另外，L5178Y 細胞Pig-a基因自發突變率較低，試驗前期無需進行雜合性突變缺失檢測，但tk基因突變則在試驗前期進行預清除［20］。對上述4 種試驗方法進行對比討論見表3。

綜上，本研究在國內首次建立并驗證報道流式細胞術檢測L5178Y 小鼠淋巴瘤細胞中Pig-a基因突變的方法，并使用四種誘變劑檢驗該方法的有效性和可靠性。后期可經不同實驗室進行進一步大規模聯合驗證，建立和規范相關試驗規程操作，作為藥物遺傳毒性致突變評價中介于Ames 試驗和體內Pig-a的橋梁，進一步完善體外遺傳毒性致突變組合。

表3 Ames、Tk/Hprt、體外Pig-a、體內Pig-a 基因突變對比

4 結論

本研究通過使用流式細胞術檢測EMS、ENU、B（a）P、4-NQO、NaCl、Glc 致小鼠淋巴瘤細胞L5178Y 表面GPI 連接的CD90 蛋白缺失情況，建立并驗證基于L5178Y 細胞的體外Pig-a基因突變試驗方法。