MBW 復合體在植物花青素合成途徑中的研究進展

高國應 伍小方 張大為 周定港 張凱旋 嚴明理

（1. 湖南科技大學生命科學學院，湘潭 411201；2. 中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081）

花青素是植物呈色的一種關鍵物質，是天然水溶性色素，隸屬于類黃酮類色素。植物色素具有廣泛的生物學功能，不僅使植物呈現豐富色彩引誘昆蟲和動物傳粉，而且使植物抵御多種生物脅迫和非生物脅迫（干旱、冷、鹽、強光、紫外線、生長調節劑等）［1-6］。花青素生物合成由一系列結構基因編碼的酶催化完成，編碼花青素合成的結構基因直接受MYB 轉錄因子、堿性螺旋-環-螺旋（bHLH）轉錄因子、WD40 轉錄因子及其互作形成的MBW復合體調控［7］。本文概述了MYB、bHLH 和WD40類轉錄因子在植物花青素合成中的功能，探討了轉MYB、bHLH 和WD40 類轉錄因子對植物花青素合成的影響，并綜述了花青素合成的生物過程和調控網絡，旨為研究植物花青素形成的分子調控機理提供借鑒。

1 植物花青素合成途徑

植物花青素合成途徑由結構基因催化完成（圖1）。結構基因編碼一系列合成酶，是花青素形成的關鍵物質。如查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構酶（CHI）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）、類黃酮-3′-羥化酶（F3’H）、無色花青素雙加氧酶（LDOX）、二氫黃酮醇4- 還原酶（DFR）、花色素合成酶（ANS）和類黃酮3-O-葡糖基轉移酶（UFGT）等。Li 等［8］發現模式植物擬南芥（Arabidopsis thaiianaL.）UGT79B2和UGT79B3過表達顯著增加了花青素的積累，同時增強了植物對低溫以及干旱和鹽脅迫的耐受性。Zohar 等［9］發現石榴（Punica granatumL.）PgLDOX編碼區中的堿基插入是導致“白色”石榴花青素含量較少的原因。Tan 等［10］發現芒果（Mangifera indicaL.）MiANRs在ban突變體中過度表達重建了種皮內原花青素（PAs）的生物合成途徑。Wang 等［11］證明SoCHS1在紫丁香（Syringa oblataLindl.）類黃酮的生物合成中起著重要作用，過度表達可使花的顏色從淡粉色變成粉紅色，可用于植物類黃酮成分的改良。

轉錄因子通過與結構基因啟動子中的順式元件結合，調控花青素生物合成途徑。其中包括MYB 轉錄因子、bHLH 轉錄因子和WD40 轉錄因子。Feng等［12］發現水芹（Oenanthe javanica）OjMYB1在擬南芥中異源表達可以提高花青素的含量，并上調與花青素生物合成相關的結構基因的表達水平。Wang等［13］發現PdMYB118在楊樹（Populus deltoids）葉片原生質體中表達時，促進了花青素生物合成基因的表達。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）bHLH 轉錄因子MtTT8是控制花青素和PAs 生物合成的三元復合物的中心成分，MtTT8能恢復擬南芥tt8突變體中PAs 和花青素的產生［14］。Gonzalez 等［15］研究發現擬南芥AtTTG1與bHLH 和MYB 形成轉錄復合物直接靶向花青素晚期生物合成基因，促進幼苗花青素合成。

2 植物花青素合成途徑的轉錄因子研究

2.1 MYB轉錄因子

MYB 轉錄因子存在于所有的真核生物中，N 末端含一個高度保守的DNA 結合結構域，由1-4 個含51-53 個氨基酸的不完全重復（R1、R2 和R3）序列組成［16］，是植物最大的轉錄因子家族之一。根據MYB 結構域中不完全重復數目，MYB 轉錄因子可以分為4 個亞類：1R-MYB，R2R3-MYB，R1R2R3-MYB 和4R-MYB［17］。其中，1R-MYB 類蛋白是一類重要的端粒結合蛋白，主要維持染色體結構的完整性和調節基因轉錄；R2R3-MYB 類蛋白是植物中數目最多的一類，形成包含100 多個成員的MYB 亞科，它們以N 端含兩個MYB 結構域構成的DNA 結合功能域為共同特征，參與植物主要和次生代謝合成［18］；R1R2R3-MYB 主要參與細胞周期的控制和細胞分化調節；4R-MYB 類蛋白是植物中最少的一類。MYB轉錄因子家族各成員在植物中發揮著重要作用，包括次生代謝，激素信號轉導與環境因子應答和對內外環境脅迫的反應等［16，19］。

圖1 花青素生物合成途徑

Paz-Ares 等［20］從單子葉植物玉米（Zea maysL.）中克隆出與花青素合成有關的ZmC1基因，是植物中第一個被分離鑒定的MYB 轉錄因子。隨后大量MYB 轉錄因子從各種植物中陸續得到分離和鑒定，這些MYB 類轉錄因子能夠參與調節植物組織著色，在花青素合成途徑中發揮重要的調控作用（表1）。

MYB 轉錄因子對植物積累花青素具有重要意義。Hernandez 等［21］發現R2R3-MYB 類轉錄因子ZmC1/P1需要bHLH 類轉錄因子ZmR才能轉錄共激活花青素合成途徑的CHS和DFR的啟動子以調控玉米花青素的合成。而在擬南芥花青素合成途徑的研究中，部分MYB 類轉錄因子（AtTT2、AtTT3、AtTT5、AtTT6、AtTT7、AtPAP1、AtMYB12等 基 因）已被克隆并闡明其作用模式，它們分別與不同的關鍵酶基因啟動子結合來促進或抑制花青素的合成［22-23］。Bai 等［24］從苦蕎（Fagopyrum tataricumL.）中分離到R2R3-MYB 型的轉錄因子基因FtMYB1、FtMYB2，過表達FtMYB1和FtMYB2顯著增加了原花青素的積累。Luo 等［25］在擬南芥中通過異位表達FtMYB15（R2R3-MYB）發現轉基因擬南芥中葉片和種皮色素沉著增加，花青素和原花青素積累水平顯著提高。

花青素濃度是許多水果顏色的重要決定因素，蘋果（Malus pumilaMill.）MdMYB9是編碼原花青素合成的正調控因子，與楊樹（Populusspp.）PtMYB134功能相似，能夠激活蘋果和楊樹花青素還原酶（ANR）啟動子，參與調節花青素含量變化［26］。Wang 等［2，27］通過蘋果愈傷組織過表達和擬南芥突變體異位表達MdMYB12，MdMYB22和MdMYBPA1，明確了它們在黃酮類化合物合成中的作用，這些研究為選育高含量花青素的優質蘋果奠定了基礎。Matus 等［28］發現葡萄（Vitis viniferaspp.）中3 個密切 相 關 的R2R3-MYB 基 因VvMYBA1，VvMYBA6和VvMYBA7通過激活關鍵酶基因UFGT和3AT參與花青素合成途徑。Xu 等［29-30］從紫色胡蘿卜（Daucus carotaL.）品種中分離R2R3 型MYB 基因DcMYB6和DcMYB7，通過異位表達和敲除驗證了它們是決定花青素合成的關鍵基因。

激活因子和抑制因子的協同作用可能對花青素生物合成在發育或應激后的精細調控具有重要意義。如小麥（Triticum aestivumL.）TaPL1作為正調控 因 子通過結合CHS、DFR、LDOX和UF3GT基因的啟動子促進花青素合成；而TaMyb1D作為負調控因子參與類黃酮合成途徑，另一方面增強了植物對干旱和氧化脅迫的耐受性［1，31］。在楊樹中，PtMYB165和PtMYB194在瞬時轉錄激活實驗中均抑制PtMYB134對類黃酮途徑酶基因啟動子的激活，它們在楊樹中的過表達使花青素和原花青素等化合物的積累量大大減少［32］。Zhou 等［33］發現桃子（Prunus persicaL.）花青素相關MYB 轉錄因子PpMYB10.1和原花青素相關MYB 轉錄因子PpMYBPA1均可激活抑制因子PpMYB18的轉錄，PpMYB18 蛋白與MYB 激活物相競爭，與bHLH 轉錄因子bHLH3和bHLH33結合，激活反饋調節環以平衡花青素和原花青素的積累。

綜上，MYB 轉錄因子在植物色素積累和生理發育調控中均具有重要作用，MYB 轉錄因子功能多樣，繼續挖掘其有效功能可為MYB 家族轉錄因子的研究提供參考依據。

2.2 bHLH轉錄因子

bHLH（basic Helix-Loop-Helix）轉錄因子家族，也參與了植物花青素的合成，bHLH 轉錄基序約含60 個氨基酸殘基，包括兩個功能區，由C 末端的α 螺旋-環-α 螺旋（HLH）區域和N 末端的（能與DNA 順式元件結合的）堿性氨基酸區域組成，HLH中環的長度依據不同bHLH 蛋白而定，且區域之間可依賴疏水氨基酸相互作用形成同型或異型二聚體。通常bHLH 蛋白運用保守的基序參與蛋白質間的相互作用，具有調控其核心的功能［34］。

植物bHLH 轉錄因子能夠參與調控多種生理代謝途徑，如植物氣孔開閉、激素應答、光形態建成、花器官發育、毛狀體發生及體內離子平衡等，而調節花青素生物合成是植物bHLH 轉錄因子最重要的功能之一，尤其是在植物次生化合物的合成和代謝途徑發揮著重要的作用。1989 年，Chandler等［35］在玉米中鑒定出調控類黃酮途徑的第一個bHLH 轉錄因子，隨后bHLH 轉錄因子序列在不同的生物中被鑒定出來（表1）。Zhou 等［36］研究發現AtGL3/TT8可與TTG1和PAP1形成復合物參與氮營養物質協同調節擬南芥花青素的合成。Xu 等［37］在前人研究的基礎上對AtTT8進行深入研究發現，AtTT8調節涉及至少6 種不同的MBW 復合物，形成正反饋調節回路以調控花青素合成。Gao 等［38］發現甘藍型油菜（Brassica napusL.）BnGL3-1基因在擬南芥gl3-3突變體中的異位表達導致真葉中花青素水平高于野生植物。Li 等［39］在研究光誘導茄子（Solanum melongenaL.）花青素合成的分子機理時發現轉錄因子SmTT8與光感受器共同參與花青素合成。Oiu 等［40］驗證了番茄（Lycopersicon esculentumMill.）AH基因編碼bHLH 蛋白，過度表達AH顯著提高了番茄下胚軸、葉片和果皮的花青素水平。Wang等［41］發現獼猴桃（Actinidia chinensis）AcbHLH42和AcMYB123能激活AcANS和AcF3GT1的啟動子，調節獼猴桃內果皮組織特異性花青素的合成。Li 等［42］從石斛雜交蘭（Dendrobiumhybrids orchid）中克隆出DhbHLH1基因，發現其能在唇部組織中形成明顯的花青素色素沉著。An 等［43］通過在蘋果愈傷組織中過表達MdMYC2發現，花青素生物合成基因MdDFR、MdUF3GT、MdF3H和MdCHS的轉錄水平顯著上調。

大量的研究數據表明bHLH 轉錄因子在植物花青素合成途徑中發揮著重要的調控作用，但花青素合成代謝過程是一個復雜的調控網絡，目前對bHLH 轉錄因子的研究還不能完全揭示它的全部功能，需要更充實的實驗來為bHLH 轉錄因子的功能揭示提供依據。

2.3 WD40轉錄因子

WD40 轉錄因子基序是由44-60 個氨基酸組成的保守序列，N-末端（距N-末端11-24 個殘基）的GH 起始和C-末端的WD 結尾［44］。WD40 蛋白不直接參與靶基因啟動子的特異性識別，而在增強基因激活方面更具有積極作用，通常通過組蛋白的修飾來參與染色質的重塑，進而影響轉錄調控。矮牽牛（Petunia hybridaVilm）PhAN11 是植物中第一個分離出來的WD40 蛋白，研究發現矮牽牛an11突變體中結構基因DFR的表達量下降［45］。之后，Walker 等［47］從擬南芥中克隆出與AN11同源基因AtTTG1，其功能與AN11相似［46］。Humphries 等［47］將棉花（Gossypiumspp.）的兩個WD-repeat 基因GhTTG1和GhTTG3在白花紫羅蘭（Matthiola incanaL.）Mittg1突變體中異位表達，恢復了部分花青素的表型。Li 等［48］從馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）中克隆了一個WD40基因StAN11發現，該基因參與調控馬鈴薯花青素的合成。An 等［49］發現蘋果MdTTG1基因與bHLH 轉錄因子和MYB 轉錄因子相互作用形成復合物，然后啟動下游花青素合成基因MdDFR和MdUFGT轉錄。Liu 等［50］發 現 楊 梅（Myrica rubra）MrWD40-1與MrMYB1和MrbHLH1相互作用參與楊梅花青素積累。Zhao 等［51］發 現 藍 莓（Vacciniumspp.）WD40 轉 錄因子VcWDL2與VcMYBL1和VcbHLHL1相互作用參與藍莓果實花青素積累和顏色發育（表1）。

WD40 類轉錄因子在植物組織花青素調控途徑中具有重要作用，通過與bHLH 和MYB 轉錄因子作用形成復合物影響植物花青素和原花青素的合成。因此需要進一步挖掘WD40 蛋白的功能以及深入的調控機理來揭示花青素合成網絡。

2.4 MBW復合體

MBW 復合體是MYB、bHLH 和WD40 三類轉錄因子互作形成的三元復合物，能夠調控花青素合成，主要參與調節晚期類黃酮生物合成基因的表達（表2）。如擬南芥在合成原花青素和花青素的過程中，MBW 復合物直接參與晚期生物合成基因（LBGs）的表達［52］。MBW 復合物在擬南芥種子原花青素合成的不同部位發揮著重要作用，如TT2-TT8-TTG1 復合物通過調節關鍵酶基因DFR、LDOX、BAN、TT19、TT12和AHA10的表達在種子內皮細胞中具有活性；TT2-GL3/EGL3-TTG1 復合物通過調控LDOX、BAN、AHA10和DFR的表達在種子的合點部位具有作用，這些結果突出了花青素調控機制的復雜性和精密性［7，53］。此外，MBW 復合物還能在激素茉莉酸酯（JA）的誘導下激活下游信號級聯反應以調節花青素積累，從而增加植物應對外界脅迫的能力［6］。玉米中ZmPAC1基因編碼WD40 蛋白類似于花青素調控蛋白 AN11 和TTG1，能與玉米的ZmR1（bHLH）和ZmC1（MYB）互作共同控制花色素的合成［54］。Falcone Ferreyra 等［55］通過染色質免疫沉淀（ChIP）實驗證明了ZmFLS是P1、C1/PL1和R/B1調節復合物的直接靶標，證明其與玉米類黃酮早期合成途徑相關。對大麥（Hordeum vulgareL.）籽粒糊粉層和果皮中不同色素積累研究發現，糊粉層中藍色顆粒的色素積累與MBW 復合物相關［56］。

表1 部分花青素合成途徑相關的轉錄因子

Spelt 等［57］在矮牽牛葉片中異位表達PhAN2（MYB）能夠誘導PhAN1（bHLH）的表達，而在花藥中PhAN1的表達又依賴于PhAN4（MYB），表明PhAN2和PhAN4均是PhAN1表達的激活因子；同時它們又與PhAN11（WD40）組合成復合物調控下游結構基因DFR的表達，從而激活花青素合成途徑。而PhMYB27是矮牽牛中的一種抑制子，通過抑制MBW 復合物的bHLH 因子PhAN1的表達來抑制花青素生物合成基因的表達［58］。草莓（Fragaria ananassaDuch.）中FaMYB9/FaMYB11，FabHLH3和FaTTG1的功能與擬南芥AtTT2，AtTT8和AtTTG1相似，將草莓的基因轉到擬南芥tt2-1，tt8-3和ttg1突變體中，發現能夠激活擬南芥BAN啟動子而參與合成花青素［59］。Ben-Simhon 等［60］通過實驗驗證了石榴PgWD40基因能與PgAn1（bHLH）和PgAn2（MYB）共表達參與調節花青素生物合成的下游結構基因DFR和LDOX的表達。

在不依賴WD40 蛋白的條件下，MYB 和bHLH轉錄因子也能協同調控花青素合成基因的表達。如蘿 卜（Raphanus sativusL.）RsTT8和RsMYB1相互作用能顯著增加內源性花青素生物合成基因的表達和花青素的積累［61］。楊梅MrbHLH1和MrMYB1的共表達以及荔枝（Litchi chinensisSonn.）LcbHLH3和LcMYB1的共表達均能激活下游花青素生物合成基因，促進果實花青素合成［62-63］。

表2 花青素合成途徑的MBW 復合物及其被調控的基因

3 展望

植物花青素的合成是一個復雜的過程，通過結構基因編碼一系列的酶參與合成各種花青素途徑相關的化合物，而各種調節基因則獨自或相互作用結合成復合物與結構基因啟動子中能被識別的順式元件特異性結合，通過上調或下調結構基因的表達，最終調控花青素的合成。除了MYB、bHLH 和WD40 蛋白外，WADS、WRKY 和WIP 類蛋白也在植物花青素代謝途徑中發揮著重要的調控作用，可能與MBW 復合物相互作用或作用于其上下游參與花青素調控網絡。

目前對植物花青素調控網絡的研究已經從結構基因轉向了調控基因，越來越多的花青素合成調控因子在轉錄水平上被鑒定出來。然而許多非模式植物或不同組織器官中花青素合成相關的轉錄因子還未廣泛鑒定，迄今為止，MYB，bHLH 和WD40 轉錄因子及其組成的MBW 復合體對基因表達的調控機制還遠未揭示。未來需要借助基因組測序技術、轉基因技術、CRISPR-Cas9 技術、瞬時轉錄激活實驗、酵母雙雜交技術及蛋白質組學技術進一步對植物各類轉錄因子及其組成的MBW 復合體進行鑒定，對轉錄因子間以及轉錄因子與結構基因間的相互作用及其表達調控模式進行深入研究。為進一步了解花青素生物合成途徑的復雜調控過程和對培養具有優異農藝性狀的蔬菜水果及觀賞植物品種具有重要的價值意義。通過對花青素合成調控網絡的深入研究，運用轉基因或敲除技術控制轉錄因子的表達以定向改變植物顏色，增加植物的觀賞價值，提高蔬菜水果的營養價值，為將來實現花青素合成的工業化生產奠定理論基礎。同時也為抵御生物和非生物多樣性脅迫，增強植物與環境之間的適應性，培育植物各種生理發育功能以及揭示植物品質資源豐富度提供必要的科學依據。