菜豆環氧水解酶歸一性水解間硝基環氧苯乙烷的研究

李闖 文正 劉暢 鄔敏辰

（1. 江南大學生物工程學院，無錫 214122；2. 江南大學無錫醫學院，無錫 214122）

光學純環氧化物和鄰位二醇具有較高的附加值，是合成一些農藥、醫藥以及材料等精細化學品的重要手性砌塊［1］。例如，（S）-環氧苯乙烷可以用來合成殺線蟲劑［2］，而（R）-苯乙二醇是液晶材料制造過程中重要的手性添加劑［3］。利用（R）-對氯環氧苯乙烷制備的一種神經保護劑（R）-依利羅地，較其S型對映體具有更強的療效［4］。本研究中所涉及到的（R）-間硝基苯乙二醇（m-nitrophenyl-1，2-ethanediol，mNPED）則是α-羥基酸以及具有阿爾茨海默病療效的β-分泌酶抑制劑的重要合成子［5-6］。

通過Jacobsen 環氧化及Sharpless 不對稱雙羥基化等傳統化學合成法制備的手性環氧化物和鄰位二醇，有時存在產物光學純度和產率低的問題［7］。此外，在反應過程中通常需要使用有毒的高價重金屬催化劑，給環境帶來了嚴重的威脅［8］。近年來，生物制備法作為一種低成本且環境友好的補充或替代方案而備受關注［9］，其符合國內外社會所倡導的“綠色工業”和“可持續發展”，以及國家“十三五”規劃中關于“加快改善生態環境”的相關內容。

環氧水解酶（Epoxide hydrolase，EH）廣泛存在于微生物與動、植物體內，能夠立體選擇性的催化廉價的外消旋（racemic，rac-）環氧化物發生開環水解，保留單一構型的環氧化物和/或生成鄰位二醇［10］。但是，不同EH 與環氧化物的反應組合往往表現出不同的立體選擇性。根據這種差異性，可以將EH 催化的不對稱反應劃分為動力學拆分和對映歸一性水解兩大類［11］，前者的理論產率僅有50%，而后者可達100%［12］。目前，基于EH 的歸一性水解反應來制備手性鄰位二醇的途徑主要有：雙酶協同催化法［13-14］、酶與化學酸串聯催化法［15-16］及單酶催化法［17-18］。其中，僅利用單酶實現外消旋環氧化物的歸一性轉化被認為是一種理想的催化方法［19］。然而，這要求EH 針對于目標環氧化物S與R兩種對映體同時表現出高且互補的區域選擇性，即區域選擇性系數αS和βR均接近于100%［20］。因此，同拆分反應相比，歸一性水解相關的報道則相對較少［21］。

本研究將菜豆來源的EH 基因pveh2 插入至冷休克表達載體，在大腸桿菌中實現酶的胞內表達。隨后，以rac-間硝基環氧苯乙烷（m-nitrostyrene oxide，mNSO）為底物，利用工程菌E. coli/pveh2 全細胞測定其EH 活性和區域選擇性。將水溶性有機試劑作為底物助溶劑，并依據助溶劑的種類與劑量對全細胞EH 活性的影響，篩選出最適的緩沖液/助溶劑反應體系，顯著提高了歸一性水解中底物rac-mNSO 的最高反應濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和培養基E. coliJM109、Rosetta（DE3）以及含有重組質粒pET28a-pveh2 的工程菌E.coli/pET28a-pveh2 由實驗室保藏；克隆質粒pUCm-T購自上海生工公司；表達質粒pCold II 購于TaKaRa公司；Luria-Bertani（LB）液體培養基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L 和酵母提取物5 g/L，pH 7.0。

1.1.2 試劑盒與工具酶 柱式質粒提取試劑盒和DNA 膠回收試劑盒均為康為世紀產品；限制性內切酶NcoI、NdeI 和SalI，T4DNA 連接酶以及ExTaqDNA 聚合酶均購自于TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因擴增 以pET28a-pveh2 作為PCR 模板，pveh2-F（5′-CATATGGAATACATAGTACACAG AAC-3′，下劃線為NdeI 的酶切位點）和pveh2-R（5′-GTCGACTCAGAACTTGTTGATAAAATC-3′，下劃線為SalI 的酶切位點）為上下游引物進行擴增反應：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，30 個循環；72℃充分延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳純化后切膠回收目的基因pveh2，17℃與pUCm-T 連接10 h，利用熱激法轉化E. coliJM109感受態細胞，最后經藍白斑篩選、NcoI 單酶切驗證和DNA 測序，將結果正確的重組質粒命名為pUCm-T-pveh2。

1.2.2 基因表達 使用NdeI 和SalI 分別處理pUCm-T-pveh2 和pCold II，并混勻酶切產物進行連接反應，用連接液轉化E. coliRosetta（DE3）感受態細胞，經過氨芐青霉素抗性平板篩選與DNA 測序，獲得重組工程菌E. coliRosetta（DE3）/pCold IIpveh2，即E. coli/pveh2。將E. coli/pveh2 的單菌落接種于含有0.1 mg/mL 氨芐青霉素的LB 培養基中，于37℃、220 r/min 培養10 h，之后按2%（V/V）的接種量轉接至新鮮LB培養基內，同樣于37℃振蕩培養，并在OD600達到0.8-1.0 時加入異丙基-β-D-硫代半乳 糖 苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）至其終濃度為0.2 mmol/L，在15℃下誘導24 h 后低溫離心收集菌體。濕菌體再經真空冷凍干燥處理，獲得的干細胞粉塊用于后續的生物催化實驗和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.3 細胞EH 活性的測定 用適量的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（50 mmol/L，pH7.0）重新懸浮干細胞，配制成均勻的細胞懸浮液，從中量取500 μL 置于25℃下預熱5 min。然后加入rac-mNSO（終濃度為5 mmol/L）開始反應，10 min 后向體系中加入1.0 mL 乙酸乙酯（含有約8 mmol/L 正己醇作為內標物質）進行萃取。上層有機相經無水硫酸鎂脫水后，借助搭載有Chiralcel?OD-H 手性色譜柱（4.6 mm Φ×250 mm L）與Waters 2489 紫外檢測器的e2695 高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）系統進行檢測和分析。檢測條件：流動相為正己烷∶異丙醇 = 9∶1（V/V），流速0.8 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。HPLC 用于檢測樣品中底物rac-mNSO、水解產物（R）-與（S）-mNPED的含量，保留時間分別為9.65、16.24 和18.46 min左右。細胞的EH 活性則定義為每分鐘催化水解1.0 μmolrac-mNSO 所需要的細胞量。

1.2.4 區域選擇性系數的測定 向2.0 mL 適當稀釋的細胞懸浮液中加入rac-mNSO 至其終濃度達到5 mmol/L，于25℃下振蕩反應2 h，期間從反應混合物中定時取樣100 μL，然后按照1.2.3 所述方法處理樣品。樣品的分析采用氣相色譜（Gas chromatography，GC）儀2010 Plus（日本島津），配備有手性毛細色譜柱CP-ChiralSil-DEX CB（安捷倫）。檢測條件：檢測器和氣化室溫度250℃，載氣為氮氣，吹掃流量為3 mL/min，分流比為1∶40。檢測期間柱溫由100℃以5℃/min 的速率上升至190℃。GC 用于檢測底物rac-mNSO 中R與S兩種構型的含量，其保留時間分別為14.01 和15.05 min 左右。最后，各構型產物的含量由HPLC 檢測。

用來表征底物和產物光學純度的對映體過剩率（enantiomer excess，ee）分別為：ees=［（R-S）/（R+S）］×100% ；eep=［（Rd-Sd）/（Rd+Sd）］×100%。其中，R、S、Rd和Sd分別代表（R）-、（S）-mNSO 和（R）-、（S）-mNPED 的濃度。根據公式eep= αS+βR-1+［（βR-αS）×ees×（1-c）］·c-1， 以ees×（1-c）］·c-1為橫坐標，eep為縱坐標通過線性回歸法推導出區域選擇性系數αS與βR值［18］，c代表底物rac-mNSO 的轉化率，為被水解消耗的racmNSO 與初始量的百分比。

1.2.5 緩沖液體系中的歸一性水解反應 向4 組含有40 mg/mLE. coli/pveh2 干細胞的20 mL 磷酸鹽緩沖液中分別加入不同終濃度（5、10、15 和20 mmol/L）的rac-mNSO，于25℃反應12 h，期間定時取樣，按照1.2.3 所述處理樣品，進行HPLC 檢測，計算不同時間點rac-mNSO 的c值。

1.2.6 助溶劑種類與劑量的篩選 選取5 種常見的水溶性有機試劑作為底物助溶劑：甲醇、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、異丙醇和丙三醇。利用磷酸鹽緩沖液分別配制含有2%、5%和8%（V/V）上述助溶劑的細胞懸浮液。按照1.2.3 所述方法測量細胞的EH 活性，對照組不添加任何助溶劑。

1.2.7 緩沖液/助溶劑體系中的歸一性水解反應 在確定最適助溶劑與劑量后，構建4 組含有40 mg/mL 干細胞的20 mL 緩沖液/助溶劑體系，將底物rac-mNSO 的濃度分別提高至20、30、40 和50 mmol/L，于25℃反應12 h，按照1.2.3 所述處理樣品，進行HPLC 分析。產物（R）-mNPED 的產率 = 反應終止時產物濃度/底物初始濃度×100%。

2 結果

2.1 PvEH2基因的生物信息學分析

根據pveh2 的測序結果，在GenBank 數據庫中查找到編碼PvEH2 的基因組DNA 序列（圖1），其位于菜豆（品種G19833）第6 號染色體上，包含兩段長度分別為465 bp 和239 bp 的內含子以及951 bp的開放閱讀框，共編碼316 個氨基酸。利用BDGP啟動子在線分析工具Promoter 預測的轉錄起始位點是位于起始密碼子ATG 中腺嘌呤上游143 bp 處的鳥嘌呤。使用程序PlantCARE 預測在轉錄起始位點-30 和-135 處分別存在真核生物典型的TATA-box（TATAAAT）和CAAT-box（CAATTA）序列。此外，PvEH2 基因的啟動子中還存在與誘導作用相關的元件ARE、GCN4 和circadian，在-617 位存在增強子（TA-rich region），以及sp1、GT1 和GAG 等多個光感應調控元件。以上預測結果表明該基因的轉錄水平可能受植物體外環境脅迫及光信號誘導的影響。

圖1 PvEH2 基因組DNA 序列和氨基酸序列

2.2 全細胞EH活性與SDS-PAGE檢測結果

以rac-mNSO 為底物測得E. coli/pveh2 的EH 活性 為15.4 U/g干細胞， 較E. coli/pET28a-pveh2 的8.1 U/g干細胞有了較為顯著的提高，而經IPTG 誘導后的E. coli/pCold II（含有pCold II 空質粒的E. coli轉化子）未檢測出EH 活性。SDS-PAGE 結果（圖2）顯示，相較于E. coli/pCold II，E. coli/pET28a-pveh2 與E. coli/pveh2 均在約38.1 kD 處存在明顯的特異蛋白條帶，與預測的重組PvEH2 的理論值37898 Da 基本一致。此外，E. coli/pveh2 產酶活性的升高可能與PvEH2 表達量的提高有關（泳道2 和3）。

圖2 重組E. coli 轉化子的SDS-PAGE 分析

2.3 E. coli/pveh2針對rac-mNSO的對映歸一性水解

2.3.1E. coli/pveh2 的區域選擇性 由線性回歸分析推導出水解反應的區域選擇性系數αS和βR分別為90.3% 和96.4%，即PvEH2 以90.3% 的 概 率 進攻（S）-mNSO 含氧三元環上的α 碳原子，使構型在反應前后發生翻轉，生成（R）-mNPED。相反地，針對（R）-mNSO 的情況，PvEH2 則以96.4%的概率進攻β 碳原子，使構型得以保持，同樣生成（R）-mNPED（圖3）。說明E. coli/pveh2 或PvEH2 擁有歸一性水解rac-mNSO 的優良特性。

圖3 E. coli/pveh2 針對于（R）-和（S）-mNSO 的區域選擇性

2.3.2 緩沖液體系中底物濃度對轉化率的影響 不同rac-mNSO 濃度下的轉化率c隨反應進程的變化趨勢見圖4。當反應進行到6 h 時，10 mmol/L 的racmNSO 幾乎完全水解，即c值在95.0%以上，生成82.4%eep的（R）-mNPED。然而，當底物濃度繼續提高至15 和20 mmol/L 時，即使反應延長至12 h，rac-mNSO 也不能被完全地轉化。因此，需要篩選合適的水解體系。

圖4 緩沖液體系中不同濃度底物轉化率隨時間的變化

2.3.3 底物助溶劑對全細胞EH 活性的影響 測定E. coli/pveh2 在不同緩沖液/助溶劑體系中的EH 活性，以對照組的相對活性作為100%，結果如圖5 所示。總體上，按照E. coli/pveh2 的EH 活性由高到低依次為含有丙三醇、異丙醇、DMSO、DMF 和甲醇的緩沖液。其中，5%和8%（V/V）的丙三醇均使E.coli/pveh2的EH活性較對照組略微提高8.2%和8.9%。綜合考慮后選擇含有5%（V/V）丙三醇的緩沖液作為反應體系。

圖5 底物助溶劑對E. coli/pveh2 全細胞EH 活性的影響

2.3.4 緩沖液/丙三醇體系中的歸一性水解 基于上述篩選的結果，構建含有5%（V/V）丙三醇的緩沖液反應體系，并研究了20-50 mmol/Lrac-mNSO 的水解情況（表1）。當反應進行到12 h 時，40 mmol/L及以下濃度底物的c值超過95.0%，且（R）-mNPED的產率均超過90.0%。但是，當rac-mNSO 繼續提升至50 mmol/L 時，高細胞濃度（40 mg干細胞/mL 約相當于250 mg濕細胞/mL）的E. coli/pveh2 無法有效將其水解。因此，在緩沖液/丙三醇體系內，最高底物濃度由原先單緩沖液體系的10 mmol/L 提高至40 mmol/L。另外，底物在歸一性水解反應進程中的代表性HPLC 色譜圖如圖6 所示。

表1 緩沖液/丙三醇體系中各濃度底物在12 h 時的水解結果

圖6 底物rac-mNSO（40 mmol/L）的c 值分別達到0%（a），45.0%（b）和95.2%（c）時的HPLC 譜圖

3 討論

絕大多數植物來源的EH 屬于α/β 折疊型水解酶超家族［22］，盡管在氨基酸組成和三維結構等方面存在一定的相似性，但是這些植物EH 的底物譜各具特色，其中也不乏擁有良好立體選擇性的野生型酶與環氧化物底物的反應組合。例如，赤豆EH 與苯基縮水甘油醚［8］、綠豆EH 與對硝基環氧苯乙烷［17］以及馬鈴薯EH 與環氧苯乙烷［23］等。

大多數已報道的組合是關于環氧化物的拆分反應，而借助于單酶實現特定環氧化物歸一性水解的案例則相對較少［21］。就rac-mNSO 而言，利用經過突變改造后的菜豆PvEH1 進行10 mmol/L 底物的反應，也僅使（R）-mNPED 的eep從14.7%提升至52.3%［12］。使用同樣是菜豆來源的野生型PvEH2 作為催化劑，所得二醇的eep可超過80.0%，這主要歸因于該酶針對S和R型底物高且互補的區域選擇性（αS=90.3%，βR=96.4%），均好于PvEH3（αS=64.4%，βR=71.5%）［20］、mbEHA（αS=82.0%，βR=93.0%）［24］和VrEH3（αS=74.2%，βR=89.0%）［25］。 迄 今 為止，也僅有很少的借助于生物法制備（R）-mNPED的 報 道。Jin 等［26］利用100 mg/mL 表達有EH 的Aspergillus niger濕細胞水解12.1 mmol/Lrac-mNSO，但是（R）-mNPED 的產率和eep僅有48%和66%。本研究采用全細胞代替其破碎液或純酶作為催化劑，主要是由于前者容易獲得且一般情況下比后者穩定［27-28］。目前已有很多使用表達有EH 的全細胞來轉化環氧化物的報道［13，25，29］。此外，由實驗中的對照組可知，宿主E.coli/Rosetta（DE3）中未檢測到rac-mNSO 的水解活性，結果與先前報道相一致［30-31］。

由EH 介導的不對稱水解被認為是一種頗具研究與應用價值的生物催化途徑，但是目前能夠實現大規模催化的反應卻很少［32］，其主要問題在于環氧化物底物在水中的溶解度低以及底物、產物對EH的抑制作用等［33-35］。為了克服上述瓶頸，一些有機試劑被添加到水相反應體系內，作為底物的助溶劑。憎水性的有機試劑與水相形成雙相體系［36-37］，而一定量的親水性有機試劑則與水互溶保持為單相體系［38-39］。在雙相體系內，有機試劑分子和相界面的毒性容易使酶失活［40］。向反應體系中加入適量的親水性有機試劑是一種較為溫和而有效的策略。本研究基于E. coli/pveh2 的催化活性，從預先構建好的15 種含有不同種類和劑量親水性有機試劑的緩沖液中，篩選到最適的反應體系為緩沖液/5%（V/V）丙三醇。這可能是由于體系內的丙三醇一方面起到了助溶底物的作用；另一方面增加了酶的穩定性。在相同的反應條件下，將rac-mNSO 的最高反應濃度較原先的緩沖液體系提高了3 倍。

4 結論

PvEH2 的基因來源于菜豆中，其轉錄水平可能與植物體外環境條件的誘導有關。SDS-PAGE 與全細胞EH 的測定結果表明，冷休克表達體系能夠提高PvEH2 在E. coli中的表達量，進而提高了重組工程菌的EH 活性。區域選擇性分析顯示，E.coli/pveh2 或PvEH2 針對于R和S兩種構型的底物同時表現出高且互補的區域選擇性，結合底物的水解結果，證實了E. coli/pveh2 具有很好的對映歸一性水解rac-mNSO 的能力。針對磷酸緩沖液中底物濃度低的問題，本研究構建并優化了一種緩沖液/有機助溶劑體系，顯著的提高了底物的最高反應濃度。