SARS-CoV-2基因組流行病學研究進展

陳愛平,凌 華,葉 盛,張擁軍

2019年12月湖北武漢市出現聚集性不明原因肺炎疫情，經過中國疾病預防控制中心調查，鑒定出一種新的冠狀病毒，后來被命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，相關疾病被命名為2019年冠狀病毒病(COVID-19)[1-2]。COVID-19全球大流行迄今已經累計確診>900萬人，死亡超過47萬(2020年6月24日)[3]。在全球大流行疫情持續蔓延的同時，國內外眾多研究機構和實驗室不斷獲得并分享SARS-CoV-2病毒基因組數據，不斷刷新對該病毒生物學特征的全面認識。本文旨在介紹目前SARS-CoV-2基因組流行病學研究進展，以便更加深入地解析病毒基因組信息，全面了解病毒流行和傳播特征，促進大流行疫情的防控。

1 多方位推動病毒基因組測序及數據共享

作為第7種能夠感染人類的冠狀病毒，SARS-CoV-2病毒在分類上屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬，基因組為單股正鏈RNA，全長約30 000核苷酸，編碼10個蛋白[1]。疫情暴發之初，由于各種公共數據庫中均無相關毒株完整的基因組信息，中國疾病預防控制中心在鑒定獲得完整的SARS-CoV-2基因組過程中，結合了Illumina測序、nanopore測序以及5′-或3′-cDNA末端快速擴增(RACE)片段的毛細管測序等多種手段[1]。自第一株SARS-CoV-2基因組序列公開發布之后，根據參比毒株基因組序列，國內外不同機構先后推出了基于擴增子的毛細管測序和高通量測序方案，以及直接從臨床樣品中進行宏基因組測序分析的方案，例如美國疾病預防控制中心(CDC)在4月初將不同測序平臺的方案匯總后發布到github網站(https://github.com/CDCgov/SARS-CoV-2_Sequencing)[4], 美國加州大學圣克魯茲分校于5月初上線了SARS-CoV-2基因組瀏覽器 (https://genome.ucsc.edu/covid19.html)[5]，以便全球研究人員對基因組進行可視化注釋，推動SARS-CoV-2基因組測序。

隨著SARS-CoV-2感染病例被發現，來自世界各地的相關基因組數據迅速匯集到全球共享流感數據倡議組織(GISAID)數據庫EpiCoV，迄今已經>55 000條(截至2020年6月24日)[6]。中國國家生物信息中心(CNCB)/國家基因組科學數據中心(NGDC)首先建立了病毒基因組序列信息庫(https://bigd.big.ac.cn/ncov)[7]，中國國家微生物科學數據中心發布“全球冠狀病毒組學數據共享與分析系統”(http://nmdc.cn/coronavirus)[8]，旨在促進國內外冠狀病毒數據的匯集、綜合分析及共享。在世界衛生組織(WHO)宣布COVID-19全球大流行之后，英國一些公共衛生實驗室和學術機構成立了英國COVID-19基因組聯合組織(COG-UK)，為當地國家健康體系(NHS)中心和政府提供大規模快速基因組測序[9]。美國在2020年5月宣布成立由CDC牽頭的全國基因組聯合組織(SPHERES), 以便在全國監測病毒變異，并在全國、全球范圍及時分享基因組數據，參加的機構包括聯邦、州公共衛生實驗室、學術機構、國家實驗室、非贏利研究所等100多個實驗室[10]，以上平臺獲得的基因組序列同時跟GISAID數據庫共享。其它國家也緊急啟動了類似計劃，從全球不同地域感染者檢測到的病毒基因組序列源源不斷地傳送到GISAID數據庫，促進了當前SARS-CoV-2實時基因組流行病學的實現。

2 SARS-CoV-2基因組分型現狀

相對于其它常見RNA病毒如流感病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)等，SARS-CoV-2病毒基因組較大，編碼蛋白更復雜，生物信息學分析存在一定難度，尚未建立起約定俗成的分型體系。自疫情暴發以來，不同研究團隊為了顯示不同來源(如地域、時間、群體等)病毒株之間的遺傳聯系，使用過單倍型(haplotype)、型(type)、分支(clade)、譜系(lineage)等術語[11-14]。

Forster等[11]將疫情初期來自全球的感染者共160株基因組序列進行種系發生網絡分析，按照氨基酸改變區分出3種主要變異株，命名為A、B、C三種型(type)。A型最古老，與云南蝙蝠分離株BatCoV RaTG13遺傳關系最接近。B型主要在東亞，A和C型則主要在歐洲和美洲。A型和B型的差異體現在T8782C和C28144T 兩處突變，前者為無義突變，后者引起一個亮氨酸突變為絲氨酸，而C型病毒與B型差異是G26144T，甘氨酸突變為纈氨酸。

GISAID網站在收集、維護全球毒株基因組數據庫的同時，也有團隊專門從事基因組流行病學研究。疫情初期每日更新數據，及時提供了基于全長基因組序列的種系發生分析結果，以便公眾了解不同來源冠狀病毒之間遺傳聯系。隨著疫情持續積累了更多序列數據，GISAID網站每周提供兩次更新，將毒株劃分為不同的分支(clade)[6]。其中，根據一些標志性突變位點，GISAID網站最初分為S和L 2個分支，分別在基因組8782和28144位點存在2個緊密聯系的單核苷酸多樣性(SNPs), 前者導致orf1ab基因無義突變T8517C，后者導致ORF8基因C251T變異，對應氨基酸突變為S84L[6,12]。隨后又分為S、G、V分支，分別表示在ORF8蛋白L84S、S蛋白D614G和NS3蛋白G251V的標志性突變，以G分支毒株出現頻率最高，不具備上述特征的其余毒株則劃分為O分支(other clade)。將G分支再進一步細分，其中GH分支是在S蛋白D614G突變基礎上同時具有NS3蛋白Q57H突變，GR分支是在S蛋白D614G突變基礎上同時存在N蛋白G204R突變。因此，目前GISAID網站存在S、L、V、G、GH、GR和O共7個分支。

Nextstrain團隊(https://nextstrain.org/)一直致力于實時追蹤病原體進化[13]。疫情暴發之后，利用GISAID數據庫，Nextstrain網站提供基于全球毒株數據的實時進化樹(https://nextstrain.org/ncov/global)。該團隊命名病毒分支的原則是，當具有共同特征的病毒在全球出現頻率達到20%，即可命名一個新的分支，以“首次出現年份+字母表中最近的第2個字母”形式表示，且1個新的分支應當與先前分支存在2個以上突變。目前分為19A、19B、20A、20B、20C共5個分支。

來自英國和澳大利亞的學者提議另外一種動態命名方案，英文全稱為Phylogenetic Assignment of Named Global Outbreak LINeages，簡稱PANGOLIN方案，與“穿山甲”的英文單詞“pangolin”相同。他們提議以字母開始標記主要病毒譜系(lineage),譜系A病毒以Wuhan/WH04/2020 (EPI_ISL_406801)為代表，其ORF1ab基因8782位堿基及ORF8基因28144位堿基與蝙蝠分離株RaTG13一致；譜系B病毒以Wuhan-Hu-1 (Genbank accession MN908947)為代表。進一步的劃分則在譜系字母后面加數字，如譜系A.1、譜系B.2等。根據這個方案，他們將2685株病毒劃分為5種譜系A(lineage A.1-A.5)，8種譜系B(lineage B.1-B.8)[14]。

以上幾種分型體系雖然都是以病毒全長基因組序列為基礎，Nextstrain體系側重于核苷酸序列差異，GISAID命名主要考慮關鍵位點標志性氨基酸殘基變異。多數方案都關注了基因組8782和28144位點的變異，相對說來，PANGOLIN方案分型更加精細。根據近期GISAID網站更新數據，GISAID體系中的S、L、V、G、GR、GH分支分別與PANGOLIN方案中A、B、B.2、B.1、B.1.1、B.1* 譜系對應[6]。

3 SARS-CoV-2病毒基因組流行病學應用

3.1調查病毒起源 SARS-CoV-2基因組序列公布之后，學術界和社會公眾都關注這種新出現病毒的起源。武漢病毒所石正麗團隊報道，最初發病的5例COVID-19患者所獲得病毒全長基因組序列相似，但與2002年出現的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)相似性僅為79.6%，而與中國云南蝙蝠中分離的1株冠狀病毒毒株RaTG13全長基因組相似達96%，但二者在刺突蛋白的受體結合區域(RBD)存在差異[15]。隨后，對中國南方截獲的從馬來西亞走私入境的穿山甲樣品進行宏基因組分析，得到的冠狀病毒基因組片段與SARSCoV-2病毒相似，特別是其RBD殘基與疫情相關SARS-CoV-2非常相似[16]。因此，目前證據推測蝙蝠可能充當貯存宿主，穿山甲可能為中間宿主。而最近調查發現，世界各地報道從部分家貓、狗、動物園里的虎、獅以及飼養的水貂等動物中發現感染SARS-CoV-2, 多數懷疑是通過人-動物傳播模式[17]。以上事實說明其它哺乳動物宿主也可能存在SARS-CoV-2相關病毒，進一步調查哺乳動物有助于最終明確該病毒的真正起源[18]。

3.2追蹤病毒傳播路徑 每日不斷更新的SARS-CoV-2基因組數據讓實時基因組流行病學分析成為可能，便于及時追蹤病毒傳播路徑。Deng等[19]通過調查2020年1月底至2020年3月中加州北部來自9個郡和游輪的患者共計36名SARS-CoV-2感染病例的基因組流行病學，根據與GISAID數據庫中789株進行種系發生分析，顯示這個期間當地至少存在7個不同譜系病毒的隱蔽輸入，包括與華盛頓州疫情相關的毒株WA1譜系、加州其它郡聚集性病例譜系、歐洲和紐約流行譜系、中國武漢譜系等。與此相似，研究人員對紐約市在西奈山健康體系就診(2020年2月29日至2020年3月18日)的COVID-19患者病毒基因組進行分析，根據基因組的遺傳相似性和種系發生分析結果(包括截至2020年4月1日GISAID數據庫中2363株毒株序列)，發現自紐約州出現第一例COVID-19病例以來的18天內，84株病例相關毒株多數與未追蹤到的傳播和可能的旅行暴露有關，而且顯示主要來自歐洲和美國其它地方的多個、獨立輸入途徑，同時也有證據表明存在社區傳播的聚集性病例[20]。

3.3評估核酸檢測試劑 隨著COVID-19疫情的暴發和全球大流行，對患者、疑似感染者或密切接觸者樣品進行核酸檢測成為評估感染狀態、患者管理、解除隔離等的關鍵指標。對于不同機構應急研發的核酸擴增體系，根據早期有限的基因組序列設計的引物是否具有足夠的特異性、能否涵蓋不同的病毒分支，一直備受關注。目前常見的核酸擴增體系有德國Charité體系(靶基因RdRP、 E、N)、中國CDC體系(靶基因ORF1ab、N)、美國CDC體系(靶基因為N基因3個區域)和香港大學體系(靶基因ORF1b-nsp14、N)。歐盟CDC推出了免費資源ECDC PrimerScan，便于顯示基因組中實時熒光PCR檢測體系靶基因區域的突變(https://primerscan.ecdc.europa.eu/)[21]。GISAID則從疫情暴發之初，持續更新相關靶基因引物區域突變信息，據2020年6月23日更新的分析報告，通過對33 350個毒株高質量基因組序列數據分析，實時熒光PCR引物區突變率在0.02%～1.66%之間，引物3′端5個堿基的突變率在0.01%～0.44%之間[6]。這些數據表明，目前的核酸檢測體系準確可靠。

3.4疫苗研發和治療藥物研制 COVID-19疫情迅速引起全球大流行，也催生了對疫苗研發和治療藥物研制的巨大需求。截至2020年6月4日，共有10種候選疫苗處于臨床評估階段，屬于不同的疫苗平臺如mRNA疫苗、DNA疫苗、腺病毒/慢病毒/細菌載體疫苗和滅活疫苗。另外世界衛生組織(WHO)報告有100多種候選疫苗處于臨床前評估階段[22]。研究發現，病毒刺突蛋白S和核衣殼蛋白N適合作為研制SARS-CoV-2疫苗的靶標[23]。通過計算機分析病毒基因組序列，得到S基因共有序列，然后利用免疫信息學工具鑒定病毒潛在的免疫原性區域，研制多個表位的亞單位疫苗[24]。在藥物治療方面，由于藥物研發需要漫長的安全性評價和臨床試驗過程，全新設計的藥物不能立即使用于突發的大流行疫情。但現有的部分抗病毒藥物、抗寄生蟲藥物、治療高血壓和高膽固醇藥物等，經過臨床前評估和臨床試驗，如果能夠達到逆轉低氧血癥、提供足夠器官支持、降低病毒載量、減輕疾病嚴重程度的效果，就可能改變用途再利用于COVID-19治療[25]。先后有瑞德西韋(Remdesivir)、氯喹(Chloroquine)等藥物進入臨床試驗觀察。理論上，通過計算機模擬將不同候選藥物與病毒蛋白立體構象進行分子對接，能夠快速篩選出合適的抗病毒藥物[25]。在GISAID定期更新的基因組流行病學報告中，也同時提供基于新報告基因組序列的S糖蛋白受體結合區突變監測結果。例如在6月23日報告中，就觀察到3 597個毒株基因組中，其受體結合界面附近存在29種罕見變異。這些信息對疫苗設計和藥物研發具有一定參考價值[6]。

4 展 望

面對這場前所未有的COVID-19全球大流行疫情，世界各國政府、醫療機構和科學家通力合作，信息共享，促進了SARS-CoV-2病毒基因組流行病學研究的實時進行。根據過去近6個月時間里的相關進展，目前開展基因組流行病學研究需要考慮以下因素：1)亟待達成共識，確定基因組流行病學相關通用的分析算法和命名規則。目前獨立存在的幾種分型體系，由于側重點和算法不一致，彼此之間沒有完全對應。隨著疫情逐漸從暴發流行向季節性流行轉變，分型體系標準不一致的現狀不便于持續的學術交流以及不同領域之間溝通。2)充分利用在線分析平臺和資源。由于SARS-CoV-2病毒基因組相對較大、編碼較復雜，給序列數據處理分析帶來巨大挑戰。特別是大量基因組分析過程中，對計算機配置要求高，按照傳統方法構建種系發生樹耗費時間長達數天。然而，通過云計算平臺分析，充分利用網絡資源特別是開源在線分析平臺，能夠避免計算機配置不足的缺陷，促進更多實驗室開展基因組流行病學研究。3)謹慎解讀分析結果。基因組流行病學分析的是序列文件，在解讀這類結果時，需要充分了解不同算法的特點和優缺點，特別是要注重結合病例相關流行病學資料，在合理的流行病學時間和空間框架下，進行客觀地解讀。涉及病原本身的致病性和傳播能力的推論，需要足夠的實驗證據。4)正確理解已經測序毒株數目和實際病例數之間的差異。由于不同國家和地區開展基因組測序的能力存在差異，已經測序毒株的多少主要反映實驗室測序能力，而不是疾病在人群的實際罹患率。在計算突變頻率時，盡可能使序列樣品時間和空間分布基本均勻，采樣數目與不同地理區域報告感染病例數成比例，以提高分析結果的可靠性。

綜上所述，在這場COVID-19全球大流行疫情中，廣泛開展病毒基因組測序和基因組流行病學研究不僅僅是調查不同地區早期病例的輸入來源，持續開展實時基因組流行病學研究，有助于深入了解病毒傳播方向、機制和進化，為COVID-19提供更好的診斷、疫苗和治療手段，及時評價和調整區域性和階段性防控措施，促進COVID-19全球大流行疫情的防控。

利益沖突：無