基于高通量測序技術(shù)分析新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬微生物群落多樣性

武亞婷，杜木英，何歡歡，闞建全，程方方，殷娜，劉維兵，丁承焱，尹小慶，武運*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊,830052)2(新疆果品精深加工與貯運保鮮工程技術(shù)研究中心，新疆 烏魯木齊,830052)3(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 4(中匈食品科學(xué)聯(lián)合研究中心，重慶，400715)

自然發(fā)酵辣椒醬營養(yǎng)豐富，色澤鮮艷，其風(fēng)味不僅取決于辣椒原料和生產(chǎn)工藝，還與發(fā)酵過程中的微生物代謝密切相關(guān)[1]。不同的微生物會利用辣椒原料進(jìn)行發(fā)酵，可能產(chǎn)生不同的有機酸和氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)，從而對辣椒醬的品質(zhì)造成一定的影響[2]。新疆地區(qū)的辣椒醬多以農(nóng)戶家庭自制為主，眾所周知，農(nóng)家自制辣椒醬的環(huán)境相對開放，基質(zhì)中存在大量微生物，可能蘊藏一定數(shù)量對辣椒醬品質(zhì)形成有積極意義或有潛在益生特性的菌株，也可能含有一些致病菌及條件致病菌[3-4]。傳統(tǒng)微生物檢測主要通過觀察形態(tài)、革蘭氏染色和生化反應(yīng)等進(jìn)行比對分析，雖然操作簡單且可直接得到結(jié)果，但不適用于菌群大批量分析鑒定[5]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和測序成本的降低，宏基因組測序、擴增子測序和16S rDNA測序等手段越來越受到國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注[6]。如沈馨等[7]利用Miseq高通量測序技術(shù)研究了辣椒醬核心細(xì)菌類群，發(fā)現(xiàn)湖北當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬中的優(yōu)勢菌是芽孢桿菌(Bacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)；趙玲艷等[8]研究了自然發(fā)酵辣椒微生物多樣性及其宏轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵線椒中的優(yōu)勢細(xì)菌為Weissella、Lactobacillus、Aureimonas和Rhizobium，優(yōu)勢真菌為Hanseniaspora、Debaryomyces、Rhodotorula和Trichosporon等；鐘燕青[9]研究湖南地區(qū)自然發(fā)酵剁辣椒，發(fā)現(xiàn)主要優(yōu)勢細(xì)菌是植物乳桿菌(Lacto-bacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和短乳桿菌(Lactobacillusbreris)；韓俊燕等[10]研究發(fā)酵辣椒多樣性，發(fā)現(xiàn)剁辣椒中的優(yōu)勢菌是魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌。

新疆地域遼闊，辣椒產(chǎn)業(yè)是當(dāng)?shù)丶t色產(chǎn)業(yè)，辣椒適栽區(qū)具有復(fù)雜多樣的生態(tài)地理環(huán)境，蘊含著豐富的微生物菌株資源[11]。但遺憾的是目前關(guān)于新疆地區(qū)辣椒醬細(xì)菌微生物多樣性的研究一直未得到應(yīng)有的重視，其多樣性研究在新疆尚屬空白。沙漠等[12]圍繞新疆辣椒醬在加工中的問題，篩選了適用于發(fā)酵辣椒制品發(fā)酵性能穩(wěn)定的乳酸菌；但是未對辣椒醬發(fā)酵過程中的真菌進(jìn)行深入研究，尤其是酵母菌在發(fā)酵過程中的作用。

本研究利用MiSeq技術(shù)對新疆哈密(A)、伊犁(B)、昌吉(C)、阿克蘇(D)和烏魯木齊(E)地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中的微生物組成進(jìn)行解析，以期揭示自然發(fā)酵辣椒醬中細(xì)菌和真菌的多樣性，為發(fā)酵辣椒的安全生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)，同時為適合辣椒醬發(fā)酵微生物的篩選提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

利用無菌袋，對5個地區(qū)的自然發(fā)酵辣椒醬進(jìn)行取樣，每個地區(qū)取5份樣品,具體如表1所示。

表1 試驗樣品Table 1 Experimental samples

1.2 試劑與儀器

瓊脂糖，西班牙Biowest Agarose公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，AXYGEN公司；Gold View I核酸染料，北京中生瑞泰科技有限公司；所有無機、有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

5430R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；My Cycler型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀，美國Bio-rad公司； Bio-Best 200E 型凝膠成像分析系統(tǒng)，賽多利斯公司； Miseq測序儀，Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取和PCR擴增

稱取10 g辣椒醬樣品，DNA提取嚴(yán)格按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit說明書進(jìn)行。用Primer 6.0軟件設(shè)計引物，細(xì)菌16S rDNA V3-V4擴增通用引物：341F(5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)；真菌I T S 2區(qū)域擴增通用引物：2045F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和2930R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反應(yīng)體系為：2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μL，引物(10 μM)F和R各為1 μL，模板DNA為50 ng，最后加ddH2O 至30 μL。細(xì)菌PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性180 s；95 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，反應(yīng)35 個循環(huán)；72 ℃延伸48 s，-20 ℃保存。真菌PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性180 s；98 ℃變性20 s，58℃退火15 s，72℃延伸20 s，執(zhí)行35 個循環(huán)；最后72 ℃維持300 s，-20 ℃保存。利用Thermo NanoDrop 2 000紫外微量分光光度計和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，而后根據(jù)AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒說明書切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.3.2 Illumina MiSeq HiSeq PE250 測序

文庫質(zhì)檢合格后，使用Qubit 2.0進(jìn)行文庫定量，并根據(jù)每個樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。采用MiSeq平臺PE250策略進(jìn)行雙末端測序，通過重疊關(guān)系進(jìn)行拼接，獲得高變區(qū)的長reads。

1.4 數(shù)據(jù)處理

16S序列長為220～500 bp，保證每條reads含N數(shù)不超過3個，且平均質(zhì)量值不低于20。對序列完全相同的Clean Reads，過濾掉其中的Singletons，根據(jù)其豐度大小進(jìn)行排序。使用UPARSE(http://drive5.com/uparse/)將97%相似度進(jìn)行OTU聚類，利用Userach 7.0鑒定并移除嵌合體序列。使用RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/)，將OTU置信度閾值設(shè)置為0.8，利用RDPC lassifer(http://rdp.cme.msu.edu/)將具有代表性的序列進(jìn)行物種注釋。OTU proflingtable和alpha多樣性分析通過Qiime的python腳本實現(xiàn)[13-14]。使用R語言和Network工具分析和作圖；使用主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis，PCoA)的方法展示各個樣品間的差異大小；使用單因素方差分析比較樣本間是否存在顯著性差異，采用fdr方法對p值進(jìn)行多重檢驗校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU分析

由圖1-a看出，5個地區(qū)的25個樣品共含有1 562個細(xì)菌OTU，5個地區(qū)共有的細(xì)菌種類有440個，在不同組樣品間有顯著差異的OTU(P<0.05)共57個。其中D地區(qū)OTU數(shù)量最多，有1 182個，A地區(qū)最少，有724個；B、C和E 3個地區(qū)OUT差異不顯著(P>0.05)，說明細(xì)菌種類比較相似。由圖1-b看出，25個樣品中含有396個真菌OTU，5個地區(qū)共有的真菌種類有88個，在不同組樣品間有顯著差異的OTU(P<0.05)共14個。其中A地區(qū)OTU數(shù)量最多，有249個;C地區(qū)最少，有198個；B、D和E 3個地區(qū)OTU差異不顯著(P>0.05)，真核微生物種類相似度較高。綜合分析，在新疆自然發(fā)酵辣椒醬中，不同地區(qū)真菌種類明顯少于細(xì)菌種類，伊犁地區(qū)和烏魯木齊地區(qū)微生物多樣性比較相似。

a-細(xì)菌;b-真菌圖1 微生物群落維恩圖Fig.1 Venn diagram of microbial community

2.2 α-多樣性分析

Coverage指數(shù)代表測序?qū)ξ锓N的覆蓋度，Shannon指數(shù)能夠?qū)悠分形⑸锒鄻有赃M(jìn)行衡量，Shannon數(shù)值越大說明微生物的多樣性越高。Chao指數(shù)可以估算樣品中物種的數(shù)目。

表2 α-多樣性指數(shù)Table 2 α-diversity index of samples

由表2可知，辣椒醬中微生物Coverage指數(shù)都大于0.99，說明樣本測序結(jié)果可以反應(yīng)樣品的真實情況。根據(jù)Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)可知，不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌平均Chao指數(shù)差異較明顯。E地區(qū)的平均Chao指數(shù)最大，為124.87；D地區(qū)的平均Chao指數(shù)最小，為83.26，其中Y78和Y44樣品的Chao指數(shù)較大，屬于異常值；B地區(qū)樣品的平均細(xì)菌Shannon指數(shù)為1.88，顯著高于其他地區(qū)。綜上說明，烏魯木齊地區(qū)的細(xì)菌物種數(shù)目多于其他地區(qū)，伊犁地區(qū)細(xì)菌群落多樣性優(yōu)于其他地區(qū)。

就真菌而言，D地區(qū)的平均Chao指數(shù)和平均Shannon指數(shù)最大，分別為669.904和4.53，說明阿克蘇地區(qū)真菌群落豐度和多樣性都高于其他地區(qū)。從α-多樣性指數(shù)可以得出，辣椒醬樣品中細(xì)菌物種豐度顯著高于真菌，說明在辣椒自然發(fā)酵過程中主要優(yōu)勢菌群是細(xì)菌，由于自然發(fā)酵的辣椒醬多在室溫厭氧環(huán)境中進(jìn)行，該環(huán)境更有利于細(xì)菌生長。

2.3 新疆不同地區(qū)辣椒醬樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

從微生物分類門的水平上來看，A、B、C、D、E地區(qū)的樣品中分別含有15、16、16、17、16個門水平的細(xì)菌，主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、螺旋體門(Spirochaetes)和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)等。

由圖2可知，在門水平下，不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對豐度。厚壁菌門是5個地區(qū)辣椒醬樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌，E地區(qū)樣品的平均豐度最大，為57.93%；D地區(qū)樣品豐度最小，為37.86%；A、B和C地區(qū)的豐度分別為48.73%、43.21%和47.64%。藍(lán)藻菌門是5個地區(qū)樣品中相對豐度較大的細(xì)菌，平均豐度達(dá)到41.46%；在B、C、D和E地區(qū)中的平均相對豐度分別為26.39%、25.84%、27.44%和22.39%。厚壁菌門和藍(lán)藻菌門豐度之和均大于60%，這可能是由于厚壁菌門中的乳桿菌和乳球菌大多數(shù)為厭氧細(xì)菌，能夠產(chǎn)酸且在強酸環(huán)境下生長。藍(lán)藻菌門可能來自原料辣椒中的葉綠體。從各樣品在門水平的分類情況來看，5個地區(qū)樣品中都出現(xiàn)了大量的藍(lán)藻菌門，但在接下來的分類水平中沒有具體分類。據(jù)報道線粒體、葉綠體分別起源于原始的好氧細(xì)菌和藍(lán)藻類原核細(xì)胞，它們長期與宿主進(jìn)行共生而逐漸演化為細(xì)胞器[15]。因為辣椒的葉綠體和線粒體DNA與原核生物的DNA具有同源性，故推測藍(lán)藻菌門可能是來自辣椒原料中的葉綠體和線粒體。

圖2 不同地區(qū)辣椒醬樣品中門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.2 Distribution of bacterial communities’ structure inchili sauce samples from different areas at phylum level

根據(jù)物種分類結(jié)果，由于樣品中所檢測出的微生物種類繁多，其中許多在物種中含量相對較少，因此篩選出優(yōu)勢物種，分別對豐度前20的細(xì)菌和真菌進(jìn)行物種分類統(tǒng)計。由圖3可知，在屬水平下，不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對豐度。A、B、C和E地區(qū)樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌是鏈形植物屬(Streptophyta)和乳桿菌屬(Lactobacillus)，其中A地區(qū)兩者豐度之和最大，為62.97%，B地區(qū)兩者豐度之和最小，為46.09%；D地區(qū)樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌是鏈形植物和腸球菌屬(Enterococcus)，豐度之和為34.25%。在屬水平下，鏈形植物、乳桿菌屬和明膜串珠菌屬是新疆地區(qū)辣椒醬中的優(yōu)勢菌株。存在大量鏈形植物屬是由于采集的樣品多為秋季農(nóng)家自制的辣椒醬，在大氣顆粒物中大量存在[16]。乳桿菌屬和明膜串珠菌屬均隸屬乳酸菌，辣椒發(fā)酵過程中乳酸菌利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，同時產(chǎn)生醇類、醛類、酮類等多種風(fēng)味物質(zhì)，各個地區(qū)間豐度的差異也致使不同地區(qū)辣椒醬風(fēng)味物質(zhì)各有千秋。腸球菌屬通常為非條件致病菌，部分為人體腸道內(nèi)正常微生物，能利用糖酵解和戊糖磷酸途徑對糖進(jìn)行降解，產(chǎn)生有機酸[17]。該屬細(xì)菌在不同地區(qū)樣品中豐度差異較大，其中在E地區(qū)中豐度最小，僅占2.43%，與樣品有機酸含量相對較低，酸味口感不突出的結(jié)果一致。

在A、B、C、D和E地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬樣品中分別存在 0.011%、0.017%、0023%、4.471%、0.021%的芽孢桿菌，分析原因可能與辣椒醬中食鹽含量不同有關(guān)，D地區(qū)辣椒醬樣品的食鹽含量較低，芽孢桿菌含量相對較高。值得關(guān)注的是，芽孢桿菌是自然發(fā)酵豆豉中的優(yōu)勢菌，該菌株的存在可能會賦予辣椒醬特殊的風(fēng)味[18]。

圖3 不同地區(qū)辣椒醬樣品中屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.3 Distribution of bacterial communities’ structure inchili sauce samples from different areas at genus level

2.4 新疆不同地區(qū)辣椒醬樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析

由圖4可知，在門水平下，從A、B、C、D和E地區(qū)中一共鑒定出子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)和鞭毛菌亞門壺菌綱(MastigomycotinaChytridiomycota)4個真菌物種，優(yōu)勢真菌都是子囊菌門(Ascomycota)，其豐度分別為31.45%、29.15%、33.80%、36.89%和18.81%。說明子囊菌門在辣椒醬發(fā)酵中起重要作用。擔(dān)子菌門相對豐度在5個地區(qū)之間的差異較明顯，A、C、E地區(qū)辣椒醬樣品中擔(dān)子菌門的含量顯著低于B、D 2個地區(qū)。值得注意的是，在E地區(qū)還檢測到鞭毛菌亞門壺菌綱，有研究發(fā)現(xiàn)隸屬鞭毛菌亞門壺菌綱的馬鈴薯癌腫病菌是一種專性寄生的低等真菌，目前尚不能人工培養(yǎng)[19]；發(fā)現(xiàn)5個地區(qū)真菌的優(yōu)勢菌群差異較大，未知酵母的相對豐度都超過60%，E地區(qū)樣品中未知酵母高達(dá)80.55%，說明新疆不同地區(qū)辣椒醬中真菌多樣性有待進(jìn)一步挖掘和發(fā)現(xiàn)。

圖4 不同地區(qū)辣椒醬樣品門水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.4 Distribution of fungal communities’ structure inchili sauce samples from different areas atphylum level

由圖5可看出，在屬水平下，A地區(qū)樣品中優(yōu)勢真菌菌屬是畢赤酵母屬(Pichia)，相對豐度為9.31%，絲孢畢赤酵母屬是發(fā)酵飲料中常見的產(chǎn)香酵母，對發(fā)酵產(chǎn)品有增香作用[20]；B地區(qū)樣品中優(yōu)勢菌屬是孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora)，相對豐度為17.44%，Hanseniaspora主要存在于土壤、水果、腐敗的食品和飲料中，可發(fā)酵葡萄糖，生長需要肌糖[21]；C地區(qū)樣品中優(yōu)勢菌屬是威克漢姆酵母(Wickerhamomyces)，相對豐度為19.99%，據(jù)報道異常威克漢姆酵母菌株具有低產(chǎn)尿素、產(chǎn)風(fēng)味，耐酒精、耐酸的特征，是一種產(chǎn)香酵母，具有較高的產(chǎn) 3-甲基-1-丁醇能力，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生乙酸乙酯、2-苯基乙酸乙酯、乙酸異戊酯等對發(fā)酵辣椒風(fēng)味具有促進(jìn)作用的酯類物質(zhì)，對發(fā)酵制品風(fēng)味有很好的貢獻(xiàn)作用[22]；D和E地區(qū)樣品中優(yōu)勢菌屬是曲霉屬(Aspergillus)，相對豐度分別為27.17%和2.28%，LV等[23]從10份紅曲米酒酒曲中分離鑒定米曲霉和黃曲霉很強的α-淀粉酶或糖化酶活性，這說明曲霉屬在米酒發(fā)酵過程中能夠有效地分解淀粉，增加小分子糖的含量，因而使米酒含糖量升高，導(dǎo)致口感偏甜。這與D、E 2地區(qū)辣椒醬樣品口味偏甜，酸味不突出結(jié)果一致。

本研究采集的樣品為發(fā)酵中后期的辣椒醬，由于酸度的增加，真菌的種類和相對豐度都大大降低。A、C地區(qū)中包含德巴利(氏)酵母屬(Debaryomyces)，其豐度分別為6.60%、1.16%。B、C、D和E地區(qū)中都含有假絲酵母(Candida)，豐度分別為1.44%、2.98%、1.85%和0.58%。B、D地區(qū)中含有未知傘菌屬(Agaricomycetes_unidentified_1)，豐度分別為8.07%、16.29%。D地區(qū)中含有豐度較高的毛霉菌屬(Mucor)和青霉屬(Penicillium)，豐度分別為1.25%和0.53%。張仁鳳等[24]指出霉菌可產(chǎn)生物胺，不同菌株產(chǎn)生物胺的能力各不相同,但該地區(qū)樣品中生物胺含量還需要通過進(jìn)一步驗證說明。A地區(qū)樣品中特有的菌種是孢圓酵母(Torulaspora)，豐度為3.98%。李華敏等[25]指出孢圓酵母能顯著提高櫻花酒中β-苯乙醇、丁酸乙酯、異戊酸乙酯等揮發(fā)性組分的含量，能夠增加發(fā)酵香氣。C地區(qū)特有的菌種是螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)，豐度為5.44%。據(jù)報道,粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachysrosea)可以通過分泌堿性泛解酸內(nèi)酯水解酶,將毒素玉米赤霉烯酮轉(zhuǎn)化成無雌激素性質(zhì)的產(chǎn)物[26]。E地區(qū)特有的菌是鏈格孢屬(Alternaria)，其豐度為0.63%。鏈格孢屬是重要的植物病原真菌,種類繁多,寄主廣泛,近年來其在葡萄上引起的病害引起了國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[27]。5個地區(qū)包含了絕大多數(shù)的未知真菌物種，相對豐度都超過60%， E地區(qū)的樣品中未知真菌物種高達(dá)80.62%，優(yōu)勢菌群比較少。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)辣椒醬發(fā)酵過程中特有的真菌，其功能需要進(jìn)一步探索，以便于更好地為辣椒醬產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化和現(xiàn)代化服務(wù)。

圖5 不同地區(qū)辣椒醬樣品中屬水平真菌群落結(jié)構(gòu)分布圖Fig.5 Distribution of fungal communities’ structure in chilisauce samples from different areas at genus level

2.5 不同地區(qū)樣品間物種組成分析

如圖6-a所示， PCoA分析可以直觀地將樣品間相似或差異程度體現(xiàn)在二維坐標(biāo)圖上，距離越近則表示越相似。統(tǒng)計分析的可信度用P表示，P小于0.05表示統(tǒng)計具有顯著性。使用秩和檢驗的方法對不同分組之間進(jìn)行顯著性差異分析，以找出對組間劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的物種，對于不同組樣品細(xì)菌群落，有19個屬、7個科和3個目，存在顯著性差異(P<0.05)。R為0.116,介于(-1，1)之間且大于0，說明組間差異顯著。PCoA1和PCoA2分別解釋了不同地區(qū)樣品中細(xì)菌群落 39.54%和 33.96%的信息，2個主成分之和大于70%，表明2個成分較好地代表了樣品中的細(xì)菌群落信息。不同地區(qū)可明顯地劃分為2組，C、E和A、B、D，E地區(qū)樣品中2個點雖然偏離較遠(yuǎn)，但根據(jù)主成分一(39.54%) 可與其余樣品聚為一類。發(fā)現(xiàn)A、B和D組樣品較為離散，各自獨立，說明這3個地區(qū)樣品間細(xì)菌群落相似性不高；C、E組樣品間的距離較近，說明這2個地區(qū)樣品間的細(xì)菌群落相似性高，該結(jié)果與這2個地區(qū)距離較近有密切關(guān)系。

a-細(xì)菌;b-真菌圖6 不同地區(qū)辣椒醬中微生物群落主成分分析圖Fig.6 The principal coordinate analysis of microbialcommunity structure in chili sauce samples from differentareas注：橫坐標(biāo)表示第1主坐標(biāo)，縱坐標(biāo)表示第2主坐標(biāo)，括號中的百分比則表示對樣品差異的貢獻(xiàn)率；圖中各點分別表示各個樣品，不同形狀代表樣品屬于不同的分組。盒形圖可以顯示最小值，第1個四分位數(shù)，中位數(shù)，第3個中位數(shù)和最大值，及由下到上的5條線，異常值以“o”標(biāo)出。

由圖6-b可知，對不同組微生物群落之間的物種進(jìn)行假設(shè)檢驗，屬、科和目各4個，在不同組樣品真菌間有顯著差異(P<0.05)。R為0.193，介于(-1，1)之間且大于0，說明組間差異顯著。PCoA1和PCoA2分別解釋了不同樣品真菌群落 54.54%和 17.69%的信息，2個主成分之和大于 70%，表明2個成分較好地代表了樣品中真菌群落信息。不同地區(qū)可明顯地劃分為2組，B、C、D和A、E，A地區(qū)樣品中的一點雖然偏離較遠(yuǎn)，但根據(jù)主成分一(54.54%) 可與其余樣品聚為一類。分析2組發(fā)現(xiàn)B、C和D組樣品較為離散，各自獨立，說明這3個地區(qū)樣品間真菌群落相似性不高；A和E組的樣品距離較近，說明這2個地區(qū)樣品間真菌群落相似性高。

3 討論

本研究檢測辣椒醬樣品微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E地區(qū)樣品中都含有腸球菌屬、葡萄球菌和梭菌，其累計平均含量分別為2.476%、10.778%、9.445%、25.366%、7.242%。隸屬于上述3個屬的部分細(xì)菌是條件致病菌，例如隸屬于腸桿菌屬的阪崎腸桿菌[28]是引起新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥的主要微生物；葡萄球菌中的金黃色葡萄球菌[29]可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、心包炎和偽膜性腸炎；梭菌屬中的破傷風(fēng)菌[30]屬是人畜破傷風(fēng)的病原體，產(chǎn)氣莢膜梭菌是人類氣性壞疽的主要病原體。綜上所述，農(nóng)戶家自制的辣椒醬樣品中可能存在一定質(zhì)量安全隱患，只是不同地區(qū)樣品間菌株含量存在差異。阿克蘇地區(qū)含量明顯高于其他地區(qū)，其中腸球菌屬的含量明顯高于其他地區(qū)，分析原因可能與其樣品發(fā)酵周期較長有關(guān)，也可能和阿克蘇地區(qū)的原料、水、土壤和空氣有關(guān)。哈密、昌吉和烏魯木齊地區(qū)樣品中特有的真菌菌種分別是孢圓酵母、螺旋聚孢霉屬和鏈格孢屬，因此后續(xù)試驗研究孢圓酵母與發(fā)酵香氣的關(guān)系具有重要意義。值得關(guān)注的是，鏈格孢屬是否對烏魯木齊地區(qū)辣椒生長有影響，因而后續(xù)研究原料辣椒中的微生物多樣性以及新疆不同地區(qū)水、土壤和空氣的微生物多樣性，無論是對了解辣椒醬的微生物多樣性，還是減少食品安全隱患均具有積極的意義。

沈馨等[7]以湖北當(dāng)陽地區(qū)辣椒醬為研究對象，發(fā)現(xiàn)酸味是辣椒醬樣品間差異最大的滋味指標(biāo)，微生物構(gòu)成對辣椒醬滋味品質(zhì)的形成具有較大的影響。韓俊燕等[10]研究安徽省黃山、湖南省永川、山西省平遙、吉林省延邊地區(qū)的發(fā)酵辣椒制品，發(fā)現(xiàn)菌群豐度在不同樣品中差異較大。門水平上，主要為厚壁菌門、變形菌門和藍(lán)藻菌門；屬水平上，主要微生物為乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、乳球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬。尚雪嬌等[31]研究恩施市3種泡辣椒樣品，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢細(xì)菌門為硬壁菌門(Fir-micutes)和變形菌門(Proteobacteria)；優(yōu)勢細(xì)菌屬為乳酸桿菌屬(Lactobacil-lus)。對比全國其他地區(qū)辣椒醬微生物多樣性研究，本研究結(jié)果中微生物多樣性特征與其他學(xué)者研究結(jié)果大體相同，但微生物種類及其數(shù)量上具有差異。發(fā)現(xiàn)新疆不同地區(qū)辣椒醬樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對豐度，發(fā)酵辣椒醬中細(xì)菌的構(gòu)成比單純的發(fā)酵辣椒更為復(fù)雜，菌群的種類和數(shù)量也不盡相同，與武俊瑞[32]的研究結(jié)果一致。5個地區(qū)的辣椒醬樣品中微生物在數(shù)量、種類等方面都具有一定的差異，分析其原因可能是：采樣地區(qū)的氣候、地理位置、光照時間、制作方法(如食鹽添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、使用容器等)、飲食習(xí)慣等客觀因素的不同引起發(fā)酵辣椒醬成分的不同，因此不同地區(qū)辣椒醬中的微生物多樣性具有一定的差異。

4 結(jié)論

本研究通過高通量測序技術(shù)對不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬樣品進(jìn)行分析，主要優(yōu)勢細(xì)菌菌門為厚壁菌門、藍(lán)藻菌門、變形菌門、擬桿菌門。厚壁菌門是5個地區(qū)辣椒醬樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌，藍(lán)藻菌門是5個地區(qū)樣品中相對豐度較大的細(xì)菌。鏈形植物屬和乳桿菌屬是哈密、伊犁、昌吉和烏魯木齊地區(qū)樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌；鏈形植物和腸球菌屬是阿克蘇地區(qū)樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌。從5個地區(qū)中一共鑒定出 4個真菌物種，優(yōu)勢真菌都是子囊菌門。畢赤酵母屬、孢漢遜酵母屬、威克漢姆酵母、曲霉屬和Davidiella分別是A、B、C、D和E地區(qū)樣品中優(yōu)勢真菌。畢赤酵母屬、孢漢遜酵母屬和威克漢姆酵母是哈密、伊犁和昌吉地區(qū)樣品中優(yōu)勢真菌，曲霉屬是阿克蘇和烏魯木齊地區(qū)的優(yōu)勢真菌。孢圓酵母是哈密地區(qū)樣品中特有的菌種；粘帚霉屬是昌吉地區(qū)特有的菌種；鏈格孢屬是烏魯木齊地區(qū)特有的菌種。

本研究選擇新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬為研究對象，獲得的微生物信息涵蓋所有微生物包括死亡的微生物，也包括取樣時樣品體系中的微生物和取樣過程中增加的微生物，但研究結(jié)果并不能區(qū)分時間段，具有一定局限性。細(xì)菌和真菌無法同時進(jìn)行定量，也不能將微生物與其他相關(guān)指標(biāo)建立聯(lián)系，未來研究中還需進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組測序。本試驗中存在大量未知菌屬，可能是因為測序數(shù)據(jù)中包含著較多未知數(shù)量菌種，很難通過一段DNA序列來確定來源。雖然有一定的局限性，但是也能在一定程度上反映出5個地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中微生物群落。本研究首次大量采集新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬，利用高通量測序的方法研究了新疆不同地區(qū)自然發(fā)酵辣椒醬中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，為后續(xù)建立新疆辣椒醬中微生物體系指標(biāo)提供了理論支持，同時為適合辣椒醬發(fā)酵微生物的篩選提供基礎(chǔ)。