外源褪黑素對‘愛媛38號’柑橘品質和乙醇代謝的影響

王晶，洪敏，馮雨,2，賀明陽,3，王日葵,2*，喻最新，周煉

1(中國農業科學院 柑桔研究所，重慶，400712) 2(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)3(中國科學院 華南植物園，植物資源保護與可持續利用重點實驗室，廣東 廣州, 510650)

柑橘是我國重要的經濟作物之一，因其味道酸甜可口、風味濃郁且營養充分，深受消費者喜愛。然而柑橘經采摘后，隨著時間的延長果實失去水分，風味逐漸變淡，通常還積累異味物質。乙醇是柑橘在貯藏期間積累的主要異味物質之一[1]，果實產生褐斑、浮皮枯水和水腫等生理病害與其有密切聯系[2]，因此乙醇的積累是決定果實風味和品質好壞的重要因素之一。經研究表明，柑橘果實中乙醇的積累情況受果皮厚度[3]、貯藏溫度[4]與涂膜處理[5]等因素的影響，同時這些因素也會使其他風味物質和果實基本品質發生變化。近些年來，學者們通過不同調控方式改善果實的風味與品質，這些研究已經在獼猴桃[6]、番茄[7]和梨[8]等果實上實現。

褪黑素(melatonin，MT)是一種吲哚胺類物質，是多數動植物體內合成的天然抗氧化劑，對人體有促進睡眠、鎮痛、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等功效[9]，在植物中其能調節植物的生長衰老，增強植物對脅迫的耐受性，提高果實的抗逆性[10]。目前褪黑素在果實生長調節[11]、貯藏品質[12]與抗性研究[13]方面已有一定進展，但是褪黑素對柑橘采后品質和風味的研究還比較少。

‘愛媛38號’是南香與西子香雜交選育出的新興品種，成熟期較早，由于其果面光滑美觀，口感細膩化渣、清香爽口、風味極佳，市場需求前景廣闊[14]。本文通過研究褪黑素對柑橘果實品質與乙醇代謝的影響，為柑橘果實貯藏品質與風味調控提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用‘愛媛38號’柑橘果實，于2018年10月30日采自四川資陽，采收時選擇成熟度一致(八成熟)、大小一致并且無機械損傷的果實，采后將果實隨機分成CK、MT 2組，MT組果實經質量濃度為1.0 g/L的褪黑素溶液浸泡10 min，CK組用清水浸泡作為對照組。晾干后單果薄膜套袋，置于6～8 ℃環境中貯藏。入庫貯藏后分別于貯藏0、10、20、40、60 d時進行相關指標的測定分析。

2,4-二硝基苯肼，上海滬試；三氯乙酸(TCA)，天津市光復精細化工研究所；二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、無水乙醇(色譜級)、乙醛(色譜級)，Aladdin；交聯聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone, PVPP)、2-嗎啉乙磺酸、丙酮酸鈉，Adamas；丙酮酸脫羧酶(PDC)ELISA試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)ELISA試劑盒，南京草本源生物科技有限公司；植物多糖多酚總RNA提取試劑盒、SYBR?PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑，日本TaKaRa公司；草酸、NaCl、BaCl2、NaOH、酚酞、2,6-二氯靛酚鈉等,成都市科龍化工試劑公司。

1.2 儀器與設備

Pocket Brix-Acidity Meter Master kit手持式折光儀，日本愛拓公司；CFX98TM Real-Time熒光定量儀,Bio-Rad ；TU-1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；Agilent 5977 MSD氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司；Varioskan LUX酶標儀，美國賽默飛公司。

1.3 指標測定與方法

1.3.1 感官評定

感官評價采用描述測試法，參考OBENLAND等[15]的方法，稍作改動。選擇12名20～25歲的評定人員進行感官評價，12名評定人員分別為6男6女，評價項目與標準如表1所示。評定人員于相同評鑒環境不同品評間，對貯藏60 d后的果實進行評價。評價指標有新鮮度、水分含量、果面缺陷、氣味和口感，記錄各項目的評分值，收集評分表，進行統計分析。

表1 感官評價項目及評分標準Table 1 Sensory evaluation items and scoring standards

1.3.2 可溶性固形物與可滴定酸含量測定

取10個果實榨汁后，用手持式折光儀測定可溶性固形物和可滴定酸含量，重復測定3次。

1.3.3 抗壞血酸含量測定

采用2,6-二氯靛酚滴定法[16]，單位g/100 mL。取10個果實榨汁后，吸取5 mL原果汁用質量分數1%草酸定容至100 mL，取2 mL置于燒瓶中，用2,6-二氯靛酚滴定，使稀釋果汁變成淡粉色，30 s不褪色為滴定終點，重復測定3次。

1.3.4 呼吸強度測定

采用靜置堿液吸收法[17]。玻璃干燥器清洗干凈，晾干后下面放入培養皿，用移液管吸取10 mL摩爾濃度0.4 mol/L NaOH標準液放入培養皿中，放置隔板，裝入10個果子，蓋好干燥器，于6～8 ℃下靜置2 h，隨后將堿液轉移到三角瓶中(沖洗3次)，加飽和BaCl2溶液5 mL和2滴酚酞指示劑，用摩爾濃度0.2 mol/L草酸標準溶液滴定，粉色沉淀變成白色為滴定終點，記錄草酸用量，重復測定3次。

1.3.5 Real-time qRCR測定

果肉總RNA提?。簠⒄罩参锒嗵嵌喾涌俁NA提取試劑盒操作，然后檢測其完整性和純度。使用兩步法進行cDNA合成。采用SYBR染料法測定乙醇代謝相關基因在不同貯藏期的轉錄水平，參照SYBR?PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作，PCR擴增在實時熒光定量PCR儀上進行。每個樣品設3次重復，以ddH2O為陰性對照，采用2-ΔΔct法進行相對定量分析。引物：ACTIN-F：CATCCCTCTCAGCACCTTCC，ACTIN-R：CCAACCTTAAGCACTTCTCC；ADH-F：GCTGGAGGGATTGTAGAAAGTGTAG，ADH-R：CCTGAGGAGGTCACACATATTGCTT；PDC-F：GC AAACGCAATGGGCTCAACGGGTC，PDC-R：CGGCTCCGCT ATGAGATGATCCAAG。

1.3.6 PDC、ADH酶活性檢測

將果肉凍樣用液氮研磨成粉末，稱取8.00 g果肉后加入5 mL 0.1 mol/L MES-Tris提取緩沖液(含2 mmol/L DTT，4% PVPP，pH 6.5)，冰浴研磨成勻漿，于10 000 r/min，4 ℃條件下離心30 min，收集上清液冰浴保存備用。PDC與ADH酶活性測定參照試劑盒操作，重復測定3次。

1.3.7 丙酮酸、乙醇、乙醛含量測定

丙酮酸含量采用2,4-二硝基苯肼法測定[18]，略微改動：將果肉凍樣用液氮研磨成粉末，稱取8.00 g果肉后加入18 mL體積分數5%TCA，在冰上孵育20 min，隨后于4 ℃，10 000 r/min離心15 min，上清液即為提取液。取酶提取物(400 μL)于試管中，加入2 mL DNPH(0.25 g 2,4-二硝基苯肼溶于1 mol/L HCl中)。將試管在37 ℃的水浴中溫育10 min。然后加入2 mL 1.5 mol/L NaOH，通過渦旋混合，1 min后立即測定混合液在515 nm處的吸光度。

乙醇、乙醛含量參考OLIVEIRA[19]的方法測定，略有改動，取待測果肉用液氮研磨成粉末，精準稱取3.00 g，加入2 mL飽和NaCl溶液，在40 ℃、200 r/min下溫育10 min后，頂空萃取20 min(fibre：CAR/PDMS)，上機分析。色譜柱：DB-WAX；進樣溫度240 ℃，氦氣(He)流速1 mL/min，柱溫30 ℃，保持7 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。質譜條件：EI，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質譜29～500 amu。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進行統計處理，采用SPSS 25.0軟件的Duncan法進行顯著性分析，采用Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源褪黑素對‘愛媛38號’感官品質的影響

‘愛媛38號’果實在采摘后普遍果面明亮飽滿、柑橘氣味純正、且酸甜可口、汁胞飽滿、口感良好，經過60 d貯藏后，果實均明顯出現果面微皺、果香減少、風味寡淡、口感下降、并伴隨著枯水的現象。由表2可知，在貯藏結束時，MT組果實的新鮮度顯著高于CK組(P<0.05)，果實氣味、水分含量、風味和口感與CK組無顯著差異，其中MT組果實風味好于CK組?？梢娡屎谒靥幚怼異坻?8號’果實后，能夠提高其風味并顯著提高新鮮度，這可能是因為采后褪黑素處理延緩了果實的衰老[10]。

表2 貯藏結束時感官評價結果Table 2 Sensory evaluation results at the end of storage

注：不同字母表示在P<0.05的水平上存在顯著性差異。

2.2 外源褪黑素對‘愛媛38號’基本品質的影響

2.2.1 外源褪黑素對‘愛媛38號’可溶性固形物和可滴定酸的影響

可溶性固形物(total soluble solids，TSS)與可滴定酸(titratable acids，TA)是衡量果實風味和品質的重要指標之一[20]。如圖1-A所示，在貯藏期間，果實TSS含量基本呈上升趨勢，后期略有下調。CK組果實在貯藏前40 d時由初始8.9%上升至9.4%，在貯藏結束時降至9.05%。MT組果實在貯藏20 d時TSS含量最高，在貯藏20～60 d期間緩慢下降，貯藏60 d時，MT組果實的TSS含量為9.5%，在貯藏期間，MT組的TSS含量始終高于CK組，差異不顯著(P>0.05)。

根據圖1-B可知，果實的TA含量整體呈下降趨勢。2組果實在貯藏10 d時的TA含量均有少許下降，隨后在20 d時達到峰值后又逐漸降低。貯藏結束時，CK、MT組的TA含量分別為0.62%和0.56%，在整個貯藏期間，2組果實的TA含量變化趨勢大致相同，且MT組的TA含量始終顯著低于CK組。LIU等[21]用褪黑素營養液培育番茄后會提高番茄果實的TSS、TA含量，但在本次試驗中外源褪黑素雖然可以提高‘愛媛38號’果實的TSS含量，TA含量卻顯著降低。杜天浩等[22]用褪黑素處理鹽脅迫下的番茄后發現外源褪黑素可以顯著提高果實TSS含量，但TA含量會因為褪黑素處理的濃度有所差異，可能是因為本試驗中所用的褪黑素濃度不宜用于提高果實的TA含量。

圖1 貯藏期間果實可溶性固形物含量(A)和可滴定酸含量(B)Fig.1 Fruit soluble solid content (A) and titratable acidcontent (B) during storage注：不同字母表示在同一時期2組果實在P<0.05的水平上存在顯著性差異。下同。

2.2.2 外源褪黑素對‘愛媛38號’Vc含量的影響

柑橘類水果是維生素C(Vitamin C，Vc)的重要供應來源，Vc能防止自由基的傷害，可提高人體免疫能力、防癌和機體應急能力，果實中的Vc含量是評價果實品質指標之一[23]。如圖2所示，在貯藏期間Vc含量整體呈下降趨勢，在貯藏10 d時，CK組的Vc含量高于MT組，隨后CK組Vc含量迅速降低，而MT組緩慢增長，貯藏20 d時，CK組和MT組Vc含量為10.70、11.96 mg/100 mL。2組果實在貯藏40 d時Vc含量皆有所上升，在40～60 d時含量下降，至貯藏60 d時，CK組和MT組果實Vc含量分別為11.63、12.66 mg/100 mL，在貯藏20～60 d時，MT組果實顯著高于CK組(P<0.05)。Vc是柑橘中主要的抗氧化物質之一[24-25]，當果實內部氧化脅迫加強而Vc合成相關酶活性減弱時，Vc與活性氧離子發生反應后其含量也會有所下降，褪黑素同樣具有清除活性氧自由基的作用[26]。所以推測可能是外源褪黑素參與了與活性氧之間的反應后減少了Vc的損耗，從而提高了果實的Vc含量。

圖2 貯藏期間果實Vc含量Fig.2 Fruit ascorbic acid content during storage

2.2.3 外源褪黑素對‘愛媛38號’呼吸強度的影響

呼吸強度反映果實內部營養物質的消耗與果實整體的衰老情況，果實在貯藏期間呼吸強度隨著時間延長而下降，并且果實的呼吸作用是影響柑橘風味劣變的原因之一[27]。如圖3所示，果實呼吸強度整體呈下降趨勢。在貯藏10 d時，果實呼吸強度下降明顯，CK組果實呼吸強度低于MT組，貯藏20 d時，CK組果實呼吸強度上升至9.17 CO2mg/(kg·h)，MT組下降至8.69 CO2mg/(kg·h)，隨著貯藏期的延長，果實呼吸強度在40 d時有1個明顯的減弱，隨后在60 d時趨向平緩，在貯藏20～60 d期間，MT組呼吸強度一直低于CK組，在貯藏結束時，果實呼吸強度最低，此時CK組、MT組果實呼吸強度分別為5.86、4.49 CO2·mg/(kg·h)，貯藏期間2組果實的呼吸強度始終無明顯差異(P>0.05)。辛丹丹等[28]報道了外源褪黑素處理可以抑制黃瓜貯藏過程中的呼吸速率，從而減少有機干物質的消耗，維護細胞膜的完整性，減緩了果實的衰老，褪黑素處理降低了‘愛媛38號’的呼吸強度，因此果實的衰老得以延緩，MT組果實在貯藏后仍維持了較好的新鮮度。

圖3 貯藏期間果實呼吸強度Fig.3 Fruit respiration intensity during storage

2.3 外源褪黑素對‘愛媛38號’乙醇代謝的影響

2.3.1 Real-Time qPCR測定

果實采后進行無氧呼吸時會促進內部乙醇的積累，乙醇生成的反應主要有兩步[29]：丙酮酸作為底物經過丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)催化生成乙醛，乙醛再經過乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)催化生成乙醇[6]。當PDC、ADH的基因表達量比較低時，果實采后的乙醇、乙醛含量積累也會受到抑制[30]。由圖4-A可知，在貯藏期間果實中PDC基因相對表達量呈上升趨勢，CK組果實在貯藏前20 d時，PDC基因相對基因表達量趨于平穩狀態，在貯藏20 d后CK組的PDC基因相對表達量開始上調，在60 d時CK組的PDC基因相對表達量是初始的2.70倍。而MT組在貯藏前40 d時的PDC基因相對表達量都比較穩定，在40 d時劇增，貯藏結束時MT組果實的PDC基因相對表達水平是初始的2.37倍，在40、60 d時，CK組的PDC基因相對表達水平顯著高于MT組(P<0.05)。圖4-B表明，在貯藏20 d時CK組果實ADH基因表達量最低，在20 d后ADH基因相對表達水平上調達到峰值，為初始的3.13倍，在貯藏結束時降至1.74倍。MT組果實在貯藏10 d時ADH基因相對表達量有所減少，隨后在20 d時上升至1.05，顯著高于CK組(P<0.05)，而后波動性上升，60 d時ADH基因相對表達量為初始的1.35倍，在40、60 d時，MT組果實的ADH基因相對表達量顯著低于CK組(P<0.05)。SUN等[31]報道了褪黑素在番茄的花青素合成期間會促進PDC基因表達與果實成熟，同時也有研究[32]表明番茄采后用50 μmol/L褪黑素處理會使ADH基因表達上調，這可能是由于褪黑素在植物不同階段起的生長調節作用不同，同時推測不同植物對褪黑素的感受機制可能存在差異性。

圖4 貯藏期間PDC(A)、ADH(B)的基因表達量Fig.4 Relative expression of PDC(A) andADH (B) during storage

2.3.2 外源褪黑素對‘愛媛38號’PDC、ADH酶活性的影響

PDC、ADH的酶活性升高會促進乙醛、乙醇的生成[33]。由圖5-A可知，果實的PDC酶活性在貯藏期間先下降后上升，在貯藏40 d后趨向平緩。在貯藏20 d時,CK組、MT組果實PDC酶活性最低，分別為9.02、8.08×10-3U/(g·FW)，隨后二者酶活性差距逐漸縮小，在60 d時，PDC酶活性基本相同。貯藏期間，MT組果實PDC酶活性始終低于CK組，差異不顯著。由圖5-B可知，在貯藏期間CK組果實ADH酶活性呈波動性下降趨勢，MT組果實在貯藏前20 d酶活性下降迅速，隨后逐漸趨向平穩。在貯藏10 d時CK組果實ADH酶活性顯著高于MT組，隨后CK組和MT組果實ADH酶活性下降，在20 d時2組果實ADH酶活性最低。在20～60 d，CK組先上升隨后下降，而MT組果實ADH酶活性緩慢上升，在貯藏期間CK組果實的ADH酶活性始終高于MT組，并在10、40 d時差異顯著(P<0.05)。乙醛、乙醇積累時通常伴隨著PDC、ADH酶活性的提高[34]，而外源褪黑素處理可以使果實的PDC、ADH酶活性降低，可以抑制丙酮酸向乙醛、乙醇轉化。

圖5 貯藏期間PDC酶活性(A)、ADH酶活性(B)變化Fig.5 Changes in PDC enzyme activity (A) and ADHenzyme activity (B) during storage

2.3.3 外源褪黑素對‘愛媛38號’丙酮酸、乙醛和乙醇含量的影響

植物在呼吸作用時會先通過糖酵解將糖氧化分解生成丙酮酸[35]，在無氧呼吸作用下，丙酮酸會向乙醛、乙醇轉化而減少其含量。由圖6-A可知，2組果實的丙酮酸含量一直處于波動狀態，并且在0～20 d時波動最大。CK組與MT組果實丙酮酸含量在貯藏10 d時最低，分別為31.08、33.04 μg/g，在20 d時劇烈增長至50.04、60.60 μg/g，此時果實丙酮酸含量達到最高值，2組間差異顯著(P<0.05)。在20～60 d果實丙酮酸含量先減少后增加，40 d時MT組果實丙酮酸含量顯著高于CK組(P<0.05)，在貯藏結束時丙酮酸含量上調，2組間差異不顯著，且貯藏期間MT組果實丙酮酸含量始終高于CK組。推測可能是因為PDC、ADH基因表達受到抑制后，酶活性降低，丙酮酸向乙醛、乙醇的轉化受到抑制，導致丙酮酸含量上調。

果實內部的乙醇代謝直接影響乙醇和乙醛的積累水平，而且柑橘在貯藏期間，果實中的乙醇、乙醛濃度會隨貯藏期延長而不斷變化[36]。如圖6-B可知，貯藏期間果實中的乙醛含量整體呈上升趨勢。在10～20 d時CK組果實乙醛含量先上升后下降，在20 d時為0.03 mg/g，隨后乙醛含量持續上升，至貯藏結束時，達到0.10 mg/g；貯藏前40 d時MT組果實乙醛含量一直增加，貯藏結束時緩慢降至0.06 mg/g，40 d時，MT組果實乙醛含量顯著高于CK組(P<0.05)，但CK組在貯藏后期增長劇烈，貯藏60 d時，CK組果實乙醛含量是MT組的1.58倍。如圖6-C所示，貯藏期間果實的乙醇含量先上升隨后下降，隨后持續上升，總體呈波動上升的狀態。貯藏10 d時，CK組、MT組果實乙醇含量分別0.47、0.28 mg/g，在20 d時下降至0.33、0.25 mg/g，在20～40 d時2組乙醇含量均增長了約0.1 mg/g，在貯藏40 d后，CK組果實乙醇含量增長劇烈，在貯藏結束時達到0.89 mg/g，約為MT組的2.09倍，在貯藏期間，2組果實間的乙醇含量均有顯著差異(P<0.05)。研究表明，與常溫貯藏相比，低溫貯藏能夠顯著減少柑橘果實中乙醇的積累量[37]，而在本研究中，采后褪黑素處理能夠進一步減少柑橘在低溫貯藏過程中乙醇的積累。

圖6 貯藏期間果實的丙酮酸(A)、乙醛(B)和乙醇(C)含量Fig.6 Contents of pyruvate (A), acetaldehyde (B) and ethanol (C) during storage time

3 結論

綜合以上結果表明，‘愛媛38號’果實經過褪黑素處理后，能夠顯著提高貯藏期果實的新鮮度，果實風味也得到一定改善。在貯藏結束時，經褪黑素處理后的果實與對照組相比,可溶性固形物含量提高了0.45%，Vc含量提高了1.37 mg/100 mL，并且褪黑素處理果實后可以抑制果實的呼吸強度，減少可滴定酸含量從而提高果實的固酸比。測定發現‘愛媛38號’經褪黑素處理后果實中PDC、ADH的酶活性和基因相對表達量會受到抑制，導致丙酮酸含量累積，乙醛、乙醇含量減少。在貯藏60 d后，經褪黑素處理過的果實與對照組相比乙醇含量減少了52.21%，乙醛含量減少了36.85%。由此可見，使用質量濃度為1.0 g/L的褪黑素溶液處理‘愛媛38號’可以延緩果實衰老，提高果實貯藏期品質，并通過抑制PDC和ADH兩個基因相對表達量進而降低酶活性,最終減少乙醛、乙醇的積累，延緩貯藏期間柑橘果實異味的產生。