低強度UV-A光循環輻照對4 ℃下鮮切菠菜品質及抗氧化能力的影響

郁杰，張雨宸，謝晶

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306) 2(農業農村部冷庫及制冷設備質量監督檢驗測試中心(上海)，上海，201306)3(上海冷鏈裝備性能與節能評價專業技術服務平臺，上海，201306)4(食品科學與工程國家級試驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306)

菠菜(SpinaciaoleraceaL.)又名波斯菜、赤根菜、鸚鵡菜等，屬藜科菠菜屬，一年生草本植物，原產于伊朗，外觀呈墨綠色，葉片厚實且大小適中，葉片和莖為主要食用部分，富含維生素A、維生素C以及鐵元素等微量元素，深受國內外消費者青睞，在我國，人們常將其鮮切后置于4 ℃下售賣[1]，但由于菠菜葉片面積大氣孔分布廣，極易受到腐敗菌侵染，一旦微生物進入氣孔內部，很難被清除[2]，同時鮮切后的菠菜發生汁液流失、愈傷呼吸劇烈(healing respiration)[3]，這一系列反應加劇了鮮切菠菜相關代謝酶的降解進程以及微生物對其的侵染，同未經加工的菠菜相比，鮮切菠菜的貯運時間更短，因此在順應消費者對鮮切菠菜的需求下，應著重維持鮮切菠菜貨架期內的品質，探尋適宜的保鮮方式。

紫外線(ultraviolet, UV)是指波長10～400 nm輻射的總稱，根據波長不同，可分為長波紫外線UV-A(320～400 nm)、中波紫外線UV-B(280～320 nm)和短波紫外線UV-C(200～280 nm)，其中UV-A約占太陽總輻射的6%，是紫外輻射中危害最小的部分[4]，UV-A輻射對采后作物基因的表達、酶、活性氧代謝等生理反應均有不同程度的影響，而植物本身也會觸發一系列抗逆反應來中和輻照的影響，如：黃酮類化合物、羥基肉桂酸及抗壞血酸等抗氧化物的合成[5]，還有文獻指出，通過UV-A照射，光粒子可與細胞中水分子相互作用產生自由基[6]，而鮮切菠菜組織內水分含量高達92%，因此該效應在植物中十分明顯，植物細胞可對這些活性氧產生強烈的反應增強抗逆進程提高品質。同時，輻照處理具有綠色環保、無副產物的優勢，且應用成本低、操作可行性高，近年來已經廣泛應用于上海青[7]、牛角椒[8]、蘋果[9]等果蔬中。

本試驗首先確定UV-A處理鮮切菠菜的最佳光照總量，隨后通過不同的照射方式處理鮮切菠菜，結合腐敗菌數量、水分變化、超氧化物歧化酶等抗氧化指標，綜合探討UV-A對鮮切菠菜的保鮮效果，為延長鮮切菠菜的貨架期提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

NaCl、丙酮、碳酸鈣粉、石英砂、KI，(AR級)國藥集團化學試劑有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、抗壞血酸(Vitamin C)測定試劑盒、過氧化物酶(POD)測定試劑盒(測植物)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)測試盒，南京建成生物科技有限公司；三氯乙酸(AR級)，上海生工生物工程有限公司；I2(AR級)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

H-2050R-1型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；HVE-50高溫高壓滅菌鍋，日本Hi-rayama制造有限公司；VS-1300L-U超凈工作臺，上?？蹈Ｌ丨h境科技有限公司；BCD-447W冰箱，博西華家用電器有限公司；E200三目生物顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；D30D微型計算機，戴爾公司；WYT-32型手持式折光儀，泉州光學儀器廠；WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；植物紫外線UV輔助補光燈390 nm(9 W/0.6 m)：T8(波長范圍：374～406 nm，峰值：390 nm)，山東貴翔光電有限公司；ST-513光強測定儀，先馳光電股份有限公司；高光防霧膜(PVC材質，食品級，膜厚度11 μm)，良維(廈門)吸塑包裝有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菠菜鮮切處理及分組

菠菜：要求當天采摘、大小均一、色澤鮮綠、清潔、無明顯缺陷、無病蟲毒害。菠菜為大棚種植，有刺種，于3月份采摘，采摘時溫度約15 ℃，濕度約為80%，采摘后20 min內由農戶直接送至試驗室。

將樣品用自來水沖洗，除去表面泥污，且至洗滌后的廢水仍為澄清代表清洗完成，待其晾干后用已滅菌的不銹鋼菜刀距菠菜葉片莖部約4 cm處鮮切。初篩組隨機分為6大組，每大組分為18個小組；試驗組將菠菜隨機分為4大組，每大組分為8個小組。以上每個小組分裝70 g/盒，包裝材料為高透光防霧膜。

1.2.2 光參數的確定

使用光強測定儀測定。燈下垂直30 cm處透過防霧膜的輻照度4.2 W/m2，峰值波長398 nm，半波寬16.8 nm，主波長436.64 nm，色純度97.9%，光子通量密度10.12 μmol/(m2·s)。

1.3.3 UV-A光照方式及環境變量

各試驗組的光照方式見表1，以飽和KCl鹽溶液控制濕度，使樣品在4 ℃，85% RH的環境下貯藏。單日光照總量的設定通過初篩試驗組根據鮮切菠菜的貨架期篩選得出，分別為360、420、600、720、900 s。

1.4 指標測定

1.4.1 革蘭氏陰性菌的計數

參考KOUKOUNARAS等[10]的方法計數。

1.4.2 假單胞菌的計數

參考郁杰等[11]的方法計數。

1.4.3 水分變化

各個樣品取樣位置要求一致，并按照4.0 cm×3.0 cm的尺寸剪切成長方形，參照楊沖等[12]的試驗方法進行低場核磁共振(low-field nuclear magnetic resonance， LF-NMR)T2譜的測定。

1.4.4 氣孔情況

參考樓柏丹等[13]的方法并稍作改進，步驟如下：選取直接撕取表皮法，固定葉片后用無菌手術刀輕劃一下葉片表面，用鑷子掀開葉片的表皮，使用軟刷刷去葉肉細胞，后用鑷子將表皮完全取下，乙醇脫色后放在載玻片中央使用1% I2-KI溶液染色90 s，蓋上蓋玻片，鏡檢觀察，選擇目鏡10×，物鏡10×，放大100倍觀察氣孔情況。

1.4.5 可溶性固形物

將樣品充分研磨后，在4 000 r/min的條件下離心10 min，取上清液滴加至檢測鏡上，合上蓋板防止產生氣泡，水平對準光源準確讀取刻度尺讀數，以質量分數(%)表示，重復3次。

1.4.6 葉綠素含量

參照NY/T 3082—2017[14]標準，按照公式(1)計算總葉綠素的含量，使用分光光度法測定總葉綠素、葉綠素a、葉綠素b的含量，并計算脫鎂葉綠素、類胡蘿卜素的含量。

(1)

式中：G，1 g樣品中葉綠素的含量，mg/g；A645，在645 nm處測得的提取液吸光度；A663，在663 nm處測得的提取液吸光度；VT，提取液的總體積，mL；n，提取液稀釋倍數；FW，鮮切菠菜鮮質量，g。

1.4.7 Vc含量

參照果蔬采后生理生化試驗指導[15]中2，6-二氯酚靛酚滴定法測定抗壞血酸的含量。

1.4.8 APX活性

參照徐冬穎等[16]的方法，方法如下，(1)上清液的制備：取1 g樣品葉片放入9 mL冰冷的磷酸鹽緩沖液中，用勻漿機以10 000～15 000 r/min在冰浴的條件下上下研磨制成100 g/L的勻漿液，在5 000×g的條件下離心10 min，取上清。(2)反應體系為3 mL，在測定管中依次加入含有0.1 mmol/L EDTA和0.5 mmol/L抗壞血酸的反應緩沖液2.6 mL和待測樣品的上清液0.1 mL，最后加入2 mmol/L H2O2溶液0.3 mL啟動酶促反應，立即混勻并開始計時，在反應15 s時開始記錄反應體系在波長290 nm處吸光度，將其作為初始值OD290I，每隔30 s記錄1次記為OD290F，連續測定取得至少6個點的數據后，根據公式(2)計算每分鐘吸光度的變化值ΔOD290，重復3次后取平均值，如公式(3)所示計算酶活性。

(2)

式中：ΔOD290，每分鐘反應混合液吸光度變化值；OD290F，反應混合液吸光度終止值；OD290I，反應混合液吸光度初始值；tF，反應終止時間，min；tI，反應初始時間，min。

(3)

式中：APX活性，1 g樣品中APX的含量，U/g；ΔOD290，每分鐘反應混合液吸光度變化值；V，樣品提取液總體積，mL；VS，測定時所取樣品提取液體積，mL；m，樣品質量，g。

1.4.9 SOD活性

參照T-SOD測試盒中的羥胺法，方法如下，(1)上清液的制備：取1g樣品葉片放入9 mL冰冷的磷酸鹽緩沖液中，在冰浴的條件下用勻漿機以10 000～15 000 r/min上下研磨制成100 g/L的勻漿液，在5 000×g的條件下離心10 min，取上清。(2)反應體系為4.3 mL，在測定管中分別加入75 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)1 mL、待測樣品的上清液1 mL、0.1 mol/L鹽酸羥胺溶液0.1 mL、75 mmol/L黃嘌呤溶液0.1 mL和0.037 U/L黃嘌呤氧化酶0.1 mL，用旋渦混勻器充分混勻，對照管以1 mL蒸餾水代替，置37 ℃恒溫水浴30 min后取出，加入顯色劑2 mL混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處蒸餾水調零并比色，重復3次，參照公式(4)計算酶活性。

(4)

式中：SOD活性，1 g樣品中SOD的含量，U/g。

1.4.10 POD活性

參照胡瑞斌等[17]的方法，方法如下,(1)上清液的制備：取1g樣品葉片放入9 mL冰冷的磷酸鹽緩沖液中，用勻漿機以10 000～15 000 r/min在冰浴的條件下上下研磨制成100 g/L的勻漿液，在5 000×g的條件下離心10 min，取上清。(2)反應體系為3.7 mL，在測試管中分別加入3.0 mL 25 mmol/L愈創木酚溶液和0.5 mL待測樣品上清液，再加入200 mL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合啟動反應，同時開始計時。將混合液倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，在反應15 s時開始記錄反應體系在波長470 nm處吸光度，將其作為初始值OD470I，后每隔1 min記錄1次記為OD470F，連續測定取得至少6個點的數據后，根據公式(5)計算每分鐘吸光度的變化值ΔOD470，重復3次后取平均值，見公式(6)計算酶活性。

(5)

式中：ΔOD470，每分鐘反應混合液變化值；OD470F，反應混合液吸光度終止值；OD470I，反應混合液吸光度初始值；tF，反應終止時間，min；tI，反應初始時間，min。

(6)

式中：POD活性，1 g樣品中POD的含量，U/g；ΔOD470，每分鐘反應混合液變化值；V，樣品提取液總體積，mL；VS，測定時所取樣品提取液體積，mL；m，樣品質量，g。

1.4.11 數據處理及分析

本試驗重復3次，各指標每次測定設3次平行，取平均值用origin 2018軟件繪圖，并使用IBM SPSS Statistics 24對組間數據進行ANVOA方差顯著性分析(P<0.05代表存在顯著差異、P<0.01代表差異極顯著)。

2 結果與分析

2.1 單日UV-A光照總量的篩選

在BERNADETH等[18]的研究中可知，愈傷后的高等植物細胞受到外源輻照的刺激后，會激活不同的防御機制，以此中和輻照帶來的損傷，輻照時間越長，機體的抗逆進程越強烈。因此本試驗首先根據貨架期篩選最佳輻照劑量，如圖1所示，以間隔24 h、單日持續光照總量在420 s的輻照條件下，鮮切菠菜的貨架期可延長至10 d為最高，故根據初篩試驗結果設計試驗組，如表1所示。

圖1 不同光照總量的UV-A光對鮮切菠菜貨架期的影響Fig.1 Effects of different irradiation time of UV-A onshelf life of fresh-cut spinach

表1 不同光照頻率的UV-A光處理鮮切菠菜的分組情況Table 1 Groups of fresh-cut spinach treated withdifferent irradiation frequencies of UV-A

2.2 UV-A光照抑菌性能的評估

已有文獻證實，在葉類凈菜的貯藏過程中，腐敗菌的增長與發酸、軟腐等一系列品質劣變有強相關性，熒光假單胞菌為鮮切菠菜的主要腐敗菌[11]。由圖2可知，各輻照處理組的總菌、假單胞菌的數量均呈先下降后上升的趨勢，在前4 d，各輻照處理組總菌含量均顯著低于CK組(P<0.05)，且抑菌性能依次為A組>B組>C組，假單胞菌數量變化與總菌變化趨勢類似；到了貯藏末期，各組總菌含量差異不顯著(P>0.05)，但各輻照處理組假單胞菌數量顯著低于CK組(P<0.05)，輻照組組間差異不明顯(P>0.05)。ANA等[19]的研究指出UV-A的殺菌性能一般，假單胞菌屬受到輻照后會短暫地失去增殖能力，但仍具備致腐能力，這與本試驗結果一致：在前2 d，經過輻照后的細菌數量并未急劇下降，驗證了這個觀點，但之后細菌數量呈下降趨勢，推測一方面是由于一部分細菌對冷藏環境的不耐受使得數量變化不明顯[20]，另一方面是經UV-A光處理，刺激鮮切菠菜分泌了某些抑菌物質，如類黃酮物質，間接使得細菌數量降低[21]。

2.3 水分變化

鮮切菠菜組織內水分約占92%，葉片挺直主要依靠體內水分壓力，如果水分流失，會導致細胞膨壓降低，表觀上可以觀察到葉片萎蔫、皺縮，因此測定水分變化對評價鮮切菠菜樣品品質從而評判保鮮方式的優劣顯得十分重要。采后失水包括水分蒸發和呼吸消耗2個方面，其中水分蒸發引起的損耗是主要方面[16]。本試驗通過繪制并反演計算各個處理組在不同時期樣品弛豫時間T2，得到的T2圖譜可以反映樣品在貯藏前期(0 d)、貯藏中期(6 d)、貯藏末期(12 d)葉片中結合水(T21：0～2 ms)、不易流動水(T22：2～20 ms)、自由水(T23：20～1 000 ms)的遷移情況，峰面積與波峰呈正比關系，因此可以根據波峰判斷水分含量[22]。由圖3可得，在0～6 d內，CK組、A組、B組結合水、不易流動水含量呈上升趨勢，C組含量變化不明顯(P>0.05)，可能是因為愈傷和輻照協同刺激了鮮切菠菜發生抗逆反應以適應環境[5]，在果蔬中抗逆反應主要分為2個方面：一方面通過減少自由水使得機體新陳代謝速率下降，另一方面通過增加結合水含量增強抗逆能力[23]。其次，各組自由水含量呈大幅下降趨勢，組間差異極顯著(P<0.01)，由高到低依次為A組>B組>C組>CK組，這是因為菠菜經過鮮切及外源輻照的刺激導致作物呼吸旺盛、代謝加快帶動機體更快地蒸騰失水，故貯藏前期失水較快；到了貯藏末期(12 d)，CK組結合水含量下降，表明細胞結構已被破壞，代謝崩潰，B組自由水含量為最高，這表明間隔8 h循環輻照鮮切菠菜更有利于維持水分含量，關于輻照能夠減緩作物的水分流失，結合氣孔情況指標，猜測可能是因為作物收到輻照后暫時關閉氣孔進而關閉了蒸騰失水途徑[24]。

a-總菌；b-假單胞菌圖2 貯藏過程中總菌及假單胞菌的變化Fig.2 Changes of total viable counts and pseudomonasduring storage

a-貯藏第0天T2圖譜;b-貯藏第6天T2圖譜;c-貯藏第12天T2圖譜圖3 不同處理方式對鮮切菠菜水分變化的影響Fig.3 Effect of different treatments on moisture change of fresh-cut spinach

2.4 氣孔變化

在高等植物中，氣孔具有以下幾點作用：(1)植物的蒸騰失水即通過氣孔的開閉控制機體水分含量以適應外界環境的變化。(2)采后葉菜仍可短暫地進行光合作用，氣孔就是光的接收者，輻照可使葉片氣孔開放，光量子促使光敏色素活躍進而參與光合作用以延遲葉綠體衰老進程[25]。圖4為鮮切菠菜氣孔放大100倍后觀察到的結果，如圖4-a所示，在第0天，各試驗組葉片氣孔呈開放狀態，這是因為愈傷后的組織呼吸加快，蒸騰作用明顯；如圖4-b所示，到了第6天，CK組氣孔呈閉合狀態，這是因為受到4 ℃低溫的影響，但各試驗組呈半開半閉狀態，這是因為輻照刺激氣孔打開，進而進行抗逆反應，從總葉綠素、水分變化指標可以驗證這個觀點；如圖4-c所示，到了第12天，各組失水嚴重，所以各組氣孔均閉合，避免失水。

圖4 不同處理方式對鮮切菠菜氣孔的影響Fig.4 Effect of different treatments on stoma of fresh-cutspinach注：圖中右下方白色標尺代表長度為20 μm。

2.5 可溶性固形物

在果蔬中可溶性固形物包括糖分、總維生素、半纖維素等營養物質，是衡量鮮切菠菜中營養成分的重要指標[26]。由圖5可得，各樣品可溶性固形物的含量均隨著貯藏時間的延長而降低，這是因為采后蔬菜發生干耗[27]，在前2 d，各輻照組與CK組差異不明顯，之后，輻照組可溶性固形物含量短暫地增加，且下降趨勢較為平穩，但CK組在6 d后可溶性固形物急劇下降，總的來說，在6 d內，A組對維持可溶性固形物效果最優，其次是B、C組；6 d之后，B組下降最慢，其次是C組。出現以上現象可能是因為輻照短暫地加快了蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合酶合成方向和光合作用，從而積累了少量的可溶性糖等物質[28]，但8 d之后，可溶性固形物不再積累且開始下降，這是因為光合作用中暗反應嚴格依賴溫度進行酶促反應[29]，在4 ℃低溫下，暗反應無法及時還原多糖，而作物本身的干耗仍不斷繼續，繼而導致可溶性糖含量的降低，在12 d，B、C組含量最高，且差異不顯著(P>0.05)，其次為A組，CK組含量最低。

圖5 不同處理方式對鮮切菠菜可溶性固形物的影響Fig.5 Effect of different treatments on soluble solidsof fresh-cut spinach

2.6 光合色素含量的變化

葉綠素是含鎂的四吡咯衍生物，當鎂離子被氫離子取代后形成脫鎂葉綠素，會使葉片出現褐變、發黃等現象[30]，因此結合脫鎂葉綠素可以動態地評判葉綠素分子的狀態。由圖6-a和圖6-b可知，B組和C組在貯藏過程中使葉綠素含量始終保持在較高水平，葉綠素分子結構較為完整，而A組和CK組含量差異變化相似(P>0.05)，呈快速下降趨勢，這可能是因為在葉綠體內膜上，每次閃光生成一個產物，而這個產物必須在第2次閃光到來之前被利用掉，若第2次閃光到達太早，則吸收的能量主要以熱和熒光的形式損失[31]，葉綠素分子會被激發成三線態，但當與基態的氧分子結合時，會較快地將葉綠體分子恢復到基態，但同時氧分子被激發成單線態，單線態氧自由基對生物體損傷較大故不利于維持品質[32]。

類胡蘿卜素作為輔助色素存在于高等植物中，吸收光譜在400～500 nm，主要有以下2點功能：(1)作為光合事件的啟動者：將吸收的光能傳遞給葉綠素a從而進行后續的光化學反應。(2)保護葉綠體細胞：胡蘿卜素本身可以淬滅單線態氧自由基，本身可以無傷害地衰變回基態。由圖6-c可知，CK組含量始終最低，A組由于連續光照，變化最為劇烈，4 d后迅速下降，B組次之，而C組變化最為緩和，在整個貯藏期間都保持了較高水平。因此B、C組不僅可較好地維持類胡蘿卜素的含量，還可以維持葉綠素含量。

a-總葉綠素的含量；b-脫鎂葉綠素的含量；c-類胡蘿卜素的含量圖6 不同處理方式對鮮切菠菜光合色素的影響Fig.6 Effect of different treatments on photosynthetic pigment of fresh-cut spinach

2.7 Vc含量的變化

對人體來說，Vc是一種人體無法自身合成但又不可或缺的微量元素，主要從果蔬中攝入。同時也是一種抗氧化劑以調節作物的采后生理代謝，已有文獻指出，在貯藏過程中，采用光輻照技術處理果蔬，Vc含量均有不同程度上升，如：芹菜[33]、生菜[34]等葉類蔬菜。由圖7可得，CK組呈不斷下降趨勢，各輻照組前6 d呈遞增趨勢，之后逐漸下降，值得注意的是：單次輻照劑量越大，Vc含量下降速率越快，即A組在貯藏末期含量最低，這一結果同劉超超[35]試驗結果一致。

圖7 不同處理方式對鮮切菠菜抗壞血酸的影響Fig.7 Effect of different treatments on Vc of fresh-cutspinach

2.8 抗氧化酶含量的變化

3 結論

本試驗通過初篩試驗以貨架期確定最佳光照總量為420 s(1.764 kJ/m2)，在這個基礎上以不同頻率循環輻照4 ℃下貯藏的鮮切菠菜，綜合試驗結果表明：貯藏期前6 d，以間隔24 h的輻照頻率處理鮮切菠菜效果最好，可有效控制總菌、假單胞菌的數量，延緩水分、可溶性固形物的損失，且Vc含量、SOD、APX、POD的活性最高，表明機體在6 d內具有較高的抗逆性能，貨架期達10 d；但間隔8 h的輻照頻率處理可使鮮切菠菜的貨架期達12 d，在第12 天仍可維持最高的水分含量、Vc和可溶性固形物含量，使鮮切菠菜在第12 天仍具有商品價值，而以間隔4 h的輻照頻率處理僅使鮮切菠菜的貨架期達11 d。因此，可根據不同的保鮮目的，選擇不同的照射方式，達到理想的保鮮效果。

a-SOD的含量；b-APX的含量；c-POD的含量圖8 不同處理方式對鮮切菠菜抗氧化酶的影響Fig.8 Effect of different treatments on antioxidant enzyme of fresh-cut spinach