金屬離子對植物乳桿菌RS66CD生物膜形成及環境耐受性的影響

趙佳偉，敖曉琳*，蔡義民，劉書亮，陳安均，萬胡，徐飛，王帆，何金陽

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014) 2(日本國際農林水產研究中心，日本 茨城，305-8686；)3(四川李記樂寶食品有限公司，四川 眉山，620030)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用各種糖產生乳酸的革蘭氏陽性細菌的總稱[1]。乳酸菌不僅應用于工業化生產，而且對人體的健康有著不可忽視的影響。研究證實，乳酸菌可維持腸道健康，克服嬰兒腹瀉、抗生素相關性腹瀉，改善老年癡呆患者的認知、情緒功能等[2-4]。因此乳酸菌功能及開發應用是目前研究的熱點。

生物膜(biofilm)這一專有名詞在1978年被提出，也有其他學者翻譯為生物被膜[5],指菌體被胞外聚合物(EPS)包裹附著在載體表面的混合物[6]。HIROMI等[7]研究了形成生物膜之后的植物乳桿菌JCM 1149和浮游菌株在各種有機酸、乙醇和次氯酸鈉中的生長情況，研究結果表明,生物膜中的微生物比浮游菌株表現出更好的抗逆性。KIEW等[8]研究發現，成膜后的鼠李糖乳桿菌比浮游菌株具有更好的耐熱性，并且可以在模擬胃腸道的環境中維持更高的活性。

生物膜的形成受到很多因素影響，包括載體表面的粗糙程度、pH、黏附力、基因調控和金屬離子等[9-11]。其中金屬離子對于生物膜的形成具有明顯的作用。一定濃度的Mg2+可以刺激初期生物膜的產生；Fe3+主要是促進胞外蛋白的分泌，產生架橋作用，提高基因的表達水平來提高生物膜的穩定性；低濃度的Na+通過調控相關基因的表達和補償生物膜表型不穩定來促進生物膜的形成[12]。本試驗旨在篩選出對植物乳桿菌RS66CD生物膜形成具有明顯促進作用的金屬離子，來提高其環境抗逆性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)RS66CD，從優質傳統泡菜中篩選得到，具有良好的發酵性能。

MRS液體培養基，凱恒生物科技有限公司；改良MRS液體培養基(去掉MRS液體培養基中的MgSO4·7H2O和MnSO4·4H2O)；NaCl、CaCl2、MgCl2、FeCl3、MnCl2、戊二醛、結晶紫(均為國產分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F超凈工作臺，力辰科技；PHS-4C+精密pH計，成都世紀方舟科技有限公司；3001酶標儀，Thermo Scientific公司；SORVALL高速離心機，美國科駿儀表有限公司；EVO18掃描電鏡，Carl Zeiss。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物乳桿菌成膜菌株和游離菌株的制備

試驗組(成膜菌株)：將活化好的植物乳桿菌按照1%的接種量，接入改良MRS液體培養基，培養基中金屬離子的種類、含量和培養條件根據單因素試驗和正交試驗確定。觀察金屬離子和不同培養條件對植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響。

對照組(游離菌株)：活化好的植物乳桿菌按1%的比例，接入MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h。

空白對照組(未加金屬離子)：活化好的植物乳桿菌按1%的比例，接入改良MRS液體培養基中，37 ℃培養24 h。

1.3.2 生物膜半定量測試

活化好的菌株按照1%比例接種(其中試驗組接種到改良MRS液體培養基，對照組接種到MRS液體培養基中)，添加到96孔細胞培養板中，每孔添加200 μL，在不同條件下培養。培養完成后倒出培養液，用無菌水沖洗3次，56 ℃干燥固定1 h。加入0.5%結晶紫50 μL，染色5～10 min，用無菌蒸餾水清洗2～3次，37 ℃晾干，測定OD490 nm[13]。采用OD490 nm來反映生物膜的形成量：A490≤0.17表明沒有形成；A490>0.34表明大量生成[14]。

1.3.3 生物膜形態觀察

將消毒過后的蓋玻片置于24孔板中，按照1∶100的比例將菌體與改良的MRS液體培養基混合均勻，每孔添加1 mL，按后續設計的金屬離子濃度及培養條件下培養。取出蓋玻片置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中，4 ℃固定8 h，再依次用40%、70%、90%和100%(2次)的乙醇脫除水分，每次15 min，再進行干燥、鍍金及掃描電鏡觀察[15]。以MRS液體培養基在37 ℃下，培養24 h作為對照組。

1.3.4 金屬離子對植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響

分別向改良MRS液體培養基中添加NaCl(40、44、46、48、52、56、60 g/L)、CaCl2(5、15、25、35、45、55 g/L)、MgCl2(5、15、25、35、45、55 g/L)、MnCl2(5、15、25、35、45，55 g/L)、FeCl3(15、25、35、45、55 g/L)，考察乳酸菌在不同金屬離子及不同濃度對生物膜形成的影響。將過夜活化培養后的植物乳桿菌按1%的比例分別接種至上述的培養基中，振蕩搖勻后加到96孔細胞培養板中，每孔添加200 μL，37 ℃放置24 h[16]。按照1.3.2的方法對生物膜形成量進行測定。按照1.3.3的方法進行掃描電鏡觀察，對試驗結果進行驗證。

1.3.5 培養條件對植物乳桿菌生物膜RS66CD形成的影響

1.3.5.1 培養溫度

在確認最佳金屬離子及作用范圍下，參照任曉鏷[17]的方案，將植物乳桿菌按照1%的比例接種，分別在8、15、20、25、37、42、50 ℃下培養24 h，按照1.3.2的方法測定形成量。

1.3.5.2 培養時間

在確認的最佳金屬離子及添加量下，將植物乳桿菌按照1%的比例接種，37 ℃分別培養12、24、36、48、60、72 h[18]。按照1.3.2的方法測定形成量。

1.3.6 正交試驗

根據單因素試驗結果選取金屬離子添加量、培養時間和培養溫度3個因素進行正交試驗，以植物乳桿菌實際成膜量為標準，未接種的MRS液體培養基作為空白組，如公式(1)所示。

實際成膜量=OD值試驗組-OD值空白組

(1)

1.3.7 植物乳桿菌RS66CD生物膜耐受性測定

1.3.7.1 溫度耐受性

參照司淼菲[19]的方法，將1.3.6最適培養條件下培養的試驗組和MRS液體培養基37 ℃培養24 h的對照組,分別接種到5 mL的MRS液體培養基中，菌液濃度均為106CFU/mL。置于55、60、65、70 ℃下水浴30 min，平板計數，分別計算試驗組和對照組的存活率，來比較成膜前后的菌株對溫度的耐受性。

1.3.7.2 鹽耐受性

將1.3.6最適培養條件下培養的試驗組和MRS液體培養基37 ℃培養24 h的對照組,分別接種至5 mL的NaCl含量為60、80、100、120、140 g/L的MRS液體培養基中[16]，菌液濃度均為106CFU/mL，37 ℃處理4 h，進行平板計數。分別計算試驗組和對照組的存活率，比較成膜前后的菌株對不同鹽濃度的耐受性。

1.3.7.3 pH耐受性

將1.3.6最適培養條件下培養的試驗組和MRS液體培養基37 ℃培養24 h的對照組,分別接種到5 mL的pH值為2、3、4、8、9的MRS液體培養基中，菌液濃度均為106CFU/mL，37 ℃處理4 h，進行平板計數。分別計算兩者的存活率，來比較對不同pH的耐受性。

1.3.7.4 膽鹽耐受性

配制膽鹽質量濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L的5 mL的MRS液體培養基，將1.3.6最適培養條件下培養的試驗組和MRS液體培養基37 ℃培養24 h的對照組分別接種到培養基中，菌液濃度均為106CFU/mL，37 ℃處理4 h，進行平板計數。分別計算試驗組和對照組的存活率，來比較成膜前后的菌株對不同膽鹽濃度的耐受性。

1.3.7.5 存活率計算

分別計算試驗組和對照組經不同條件處理后的存活率,對比兩者耐受性。按公式(2)計算：

(2)

1.4 數據分析

每個樣品做3個平行，采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。最終數據表示為平均值±標準偏差，試驗結果用SPSS 22.0 軟件進行Duncan多重比較和方差分析，顯著性水平為0.05，不同字母表示具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 不同培養條件對植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響

2.1.1 不同金屬離子對生物膜形成的影響

由圖1可知，添加NaCl，CaCl2，MgCl2和MnCl2所測定的OD值均大于0.34，而FeCl3所有濃度下測定的OD值均小于0.17。說明Fe3+促進植物乳桿菌生物膜形成的能力較小，而Na+、Ca2+、Mg2+和Mn2+都具有不同程度促進生物膜形成的能力，其中Na+的促進效果最為明顯。但從圖1也可以看出，對照組所測OD值大于一些添加低濃度的金屬離子。這主要是由于植物乳桿菌RS66CD本身產胞外多糖，并且對照組的培養基更適合微生物的生長，所以會導致更多的菌體附著在96孔板底部。選取Na+，Mg2+，Ca2+，Mn2+和Fe3+所測OD值最大的濃度以及游離菌株進行掃描電鏡觀察。結果如圖2所示，Na+的促進效果最為明顯，故確定48 g/L的Na+作為后續試驗添加的金屬離子。

圖1 不同金屬離子對于植物乳桿菌生物膜形成的影響Fig.1 L. plantarum biofilm effected by different metal ions注：不同字母代表差異顯著，P<0.05。下同。

a-Mn2+添加量為35 g/L;b-Ca2+添加量為25 g/L;c- Mg2+添加量為25 g/L;d- Fe3+添加量為35 g/L;e-Na+添加量為48 g/L;f-游離菌株圖2 不同金屬離子最適濃度下生物膜的掃描電鏡圖Fig.2 SEM of biofilm at optimum concentrations ofdifferent metal ions

2.1.2 培養時間對生物膜形成的影響

生物膜的形成具有幾個明顯的生理階段，包括表面黏附、微菌落形成、生物膜的成熟和生物膜分散[20]。培養時間對植物乳桿菌生物膜形成的影響如圖3所示，由于12 h的培養時間較短，菌體還處于生長階段，產膜量較小，所以附著在96孔板底部的菌體量少，因此OD值也較小。培養至24 h時，開始形成生物膜來抵御鹽脅迫的不良環境，36 h處生物膜達到最大量，此時OD值也最大。隨著培養時間的增加，生物膜開始逐漸發生解聚，OD值下降。

圖3 培養時間對植物乳桿菌生物膜形成的影響Fig.3 L. plantarum biofilm effected by culture time

2.1.3 培養溫度對生物膜形成的影響

從圖4可知，不同溫度條件下培養對菌株RS66CD生物膜形成的影響差異性顯著。由試驗結果來看，在15和37 ℃時出現2個高峰。37 ℃為乳酸菌最適生長溫度，因此在37 ℃條件下培養有助于菌體生長，累積的生物膜形成量也最大。15 ℃作為適宜的低溫脅迫，菌體在此溫度脅迫下，產生生物膜來抵抗不良環境[13]。而培養溫度過低或過高都會影響菌體生長，導致菌體密度過低，不能形成穩定的膜結構。

圖4 培養溫度對植物乳桿菌生物膜形成的影響Fig.4 L. plantarum biofilm effected by culturetemperature

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，設計了L9(3)4正交試驗。以實際成膜量作為評判依據，對試驗結果進行分析，選出最優組合。結果如表2所示，對植物乳桿菌生物膜形成最主要的影響因素為時間，其次為Na+濃度及培養溫度(B>A>C)。得出最佳培養條件為A3B1C3，即NaCl添加量53 g/L， 40 ℃下培養24 h。將每個單因素最佳濃度，正交試驗得出的最佳培養條件和游離菌株通過掃描電鏡進行觀察，對試驗結果進行驗證，結果如圖5所示，在正交試驗確定的最佳培養條件培養的植物乳桿菌形成的生物膜最明顯。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

a-最適培養溫度;b-最適培養時間;c-最適鈉離子添加量d-正交試驗最適條件;e-游離菌株圖5 不同培養條件下生物膜形成以及游離菌株掃描電鏡圖Fig.5 SEM to observe biofilms of different culture conditionsand free strains

2.3 植物乳桿菌RS66CD在生物膜形成前后對環境耐受性的影響

2.3.1 溫度耐受性

結果如圖6所示，隨著溫度的升高，兩者的存活率呈下降趨勢，但是由于試驗組的菌體形成了生物膜，在相同處理溫度下比對照組表現出更好的抗逆性。由圖6可以看出來，試驗組在70 ℃處理30 min后還具有一定的活性，說明生物膜的形成可以更好地保護菌體，同時也可能由于試驗組在培養時溫度較高，提高了菌體的熱應激能力。但在65 ℃以后，試驗組和對照組的存活率都大幅度降低，說明生物膜提高菌體對溫度耐受性是有一定范圍的。在工業生產上可以利用這一特點，來保證殺滅雜菌的同時維持乳酸菌的活性[21]。

圖6 成膜菌株與游離菌株對溫度的耐受性Fig.6 The tolerance to temperature of biofilm and planktonicL. plantarum

2.3.2 鹽濃度耐受性

結果如圖7所示，隨著鹽濃度的不斷增加，兩者的存活率均在降低。但是在相同鹽濃度條件下，試驗組表現出更好的鹽耐受性。同時隨著鹽濃度的增加，試驗組存活率的比例也在不斷的上升。說明生物膜的形成提高了對鹽度的耐受性。

圖7 成膜菌株與游離菌株對鹽的耐受性Fig.7 The tolerance to NaCl of biofilm and planktonicL. plantarum

2.3.3 pH耐受性

pH值對于微生物的生理活性具有至關重要的影響，可以通過改變酶活性來影響微生物的生理代謝，或者通過改變微生物表面電荷來影響物質的吸收[22]。從圖8可以看出，供試pH條件下，試驗組和對照組的存活率都在下降，將pH調整到2時，菌體完全失活；試驗組比對照組表現出更好的耐受性。這可能是由于EPS的官能團隨著pH增加而增加，絮凝效果增強，但是超出這一范圍則會呈現相反的效果[23-24]。

圖8 成膜菌株與游離菌株對pH的耐受性Fig.8 The tolerance to pH of biofilm and planktonicL. plantarum

2.3.4 膽鹽耐受性

從圖9可以看出，在膽鹽質量濃度低于0.50 g/L時，試驗組的存活率明顯高于對照組，表現出對膽鹽良好的耐受性。植物乳桿菌要進入人體發揮作用，必定要經過胃酸，膽鹽等消化液的消化。所以可以通過使植物乳桿菌形成生物膜，來提高進入人體后的存活率。隨著膽鹽濃度的增加，菌體的存活率也明顯下降，但試驗組存活率明顯高于對照組。說明生物膜的形成可以保護菌體，使其在一定膽鹽濃度下存活。

圖9 成膜菌株與游離菌株對膽鹽耐受性Fig.9 The tolerance to bile salt of biofilm and planktonicL. plantarum

3 討論

本試驗主要研究了幾種金屬離子對于植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的影響，首先確定影響效果最顯著的金屬離子，在此基礎上選取最佳金屬離子的添加量、培養時間、培養溫度3個單因素，進行正交試驗，得到最適培養條件。結果表明，NaCl添加量為53 g/L，40 ℃培養24 h，植物乳桿菌形成的生物膜最顯著。

研究結果與徐文生[25]、謝麗斯等[26]的研究結果相似，即在低濃度條件下Na+可以促進生物膜形成，但隨著Na+濃度不斷升高生物膜的形成會逐漸受到抑制。這可能是由于在一定滲透壓下，菌體會產生生物膜來抵抗不良環境。同時在鹽脅迫條件下，會導致raf、GroEL、DanK、LuxS等基因的表達，從而調控生物膜的形成[16,27]。并且滲透壓可以補償生物膜表型不穩定，使生物膜變得平滑[28]。

通過比較試驗組和對照組處理后的存活率，得出成膜后植物乳桿菌的耐受性顯著增加。其中在溫度耐受性試驗中試驗組的存活率比對照組平均高出5倍；pH值耐受性中高出2.8倍；鹽耐受性中高出5倍；膽鹽耐受性中高出7倍。此外AKINBOBOLA[29]及黃忠強[30]等的研究分別表明，形成生物膜后綠膿桿菌對鹽濃度耐受性和金黃色葡萄球菌對消毒劑耐受性顯著提升。這可能是由于生物膜的形成可以減緩氧化應激對菌體的傷害，生物膜基質和相關多糖可以提高菌體對極端環境的耐受性[31]。綜上所述，生物膜作為一種生物屏障，使存在其中的菌體相較于單個游離菌株在面對不良環境時顯示出更好的抗逆性。

在工業生產中，可以通過添加適當的Na+來促使生物膜的形成，從而提高植物乳桿菌對環境的抗逆性。本試驗探究了植物乳桿菌RS66CD生物膜形成的最適條件，對比了形成生物膜前后的環境耐受性。但是對調控生物膜形成的相關基因還未進行深入研究。本試驗希望為以后利用生物膜提高植物乳桿菌環境耐受性提供新的思路和方法。