高產胞外多糖植物乳桿菌篩選及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

張文平，趙英杰，羅晟，程新

(江西農業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌，330045)

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一種糖類高聚物的總稱[1-2]。大量研究表明，乳酸菌胞外多糖具有多種生理功能，如抗氧化、抗腫瘤、促進腸道菌群平衡、免疫調節(jié)等[3]，此外，乳酸菌胞外多糖可以作為一種天然的食品添加劑，改善食品黏稠度、質地和風味等[4]，因此被廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領域[5-7]。

目前，乳酸菌胞外多糖的產量普遍偏低，這也是制約著其大規(guī)模工業(yè)化生產的主要原因之一[8-9]。基于此，近年來，大多數(shù)研究都集中在如何進一步優(yōu)化乳酸菌胞外多糖產量[10-12]。葉廣彬等[13]采用響應面法優(yōu)化檸檬明串珠菌TD1產胞外多糖條件，優(yōu)化后產量是優(yōu)化前的1.76倍。WANG等[14]對LactobacillusplantarumKX041合成胞外多糖的發(fā)酵條件進行響應面法優(yōu)化，優(yōu)化后，最大胞外多糖產量達到599.52 mg/L，是優(yōu)化前的3倍。因此，優(yōu)化菌株營養(yǎng)和培養(yǎng)條件是提高乳酸菌胞外多糖產量的重要途徑。

本實驗以提高胞外多糖產量為出發(fā)點，從課題組保藏的20株乳酸菌中篩選高產胞外多糖的乳酸菌，采用形態(tài)學、生理生化和分子生物學手段對菌株進行鑒定，同時，采用單因素和響應面實驗進行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝條件，為乳酸菌胞外多糖的工業(yè)化生產提供一定的理論基礎和技術手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

乳酸菌，江西農業(yè)大學微生物資源開發(fā)與利用實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，無水乙酸鈉5.0 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，吐溫-80 1.0 mL/L，pH 6.2～6.4，121 ℃高壓滅菌，15 min。

改良MRS培養(yǎng)基：用蔗糖代替葡萄糖，其他同MRS培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設備

JW-3022HR高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；721可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；LRH-250-C培養(yǎng)箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司； FEI Quanta 250型掃描電子顯微鏡，美國FEI。

1.2 實驗方法

1.2.1 高產胞外多糖乳酸菌的篩選

將保藏于-80 ℃的20株乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基中進行活化，采取平板劃線法將活化好的乳酸菌接種于改良的MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，選取菌落表面黏稠且可拉絲的單菌落[15]，保藏于MRS培養(yǎng)基斜面，置于4 ℃冰箱保存。

將初篩獲得的菌株接種于改良的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置發(fā)酵24 h。取發(fā)酵液于10 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，取上清液加三氯乙酸至終質量分數(shù)4%，4 ℃反應12 h后，10 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，收集上清液，于上清液中加入3倍體積95%(體積分數(shù))的乙醇溶液于4 ℃浸提12 h后在10 000 r/min，4 ℃條件下離心15 min，收集沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀后，將沉淀用去離子水溶解定容，溶液用去離子水透析(8 000～14 000 Da)3 d，每8 h換一次水，透析結束后減壓真空濃縮至原體積即為粗多糖溶液[16]。

采用硫酸-苯酚法[17]測定胞外多糖含量。從而確定高產胞外多糖的乳酸菌菌株。

1.2.2 高產胞外多糖乳酸菌的鑒定

菌株形態(tài)學鑒定、掃描電鏡、生理生化特性分析、16S rDNA鑒定分別參考文獻[18-21]進行。

1.2.3 單因素優(yōu)化乳酸菌產胞外多糖條件

在MRS培養(yǎng)基的基礎上，分別研究碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖)、最佳碳源濃度(10、20、30、40、50 g/L)、氮源(酪蛋白、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蛋白胨、硫酸銨)、最佳氮源濃度(5、10、15、20、25 g/L)、發(fā)酵時間(18、24、30、36、42 h)、發(fā)酵溫度(20、25、30、35、40 ℃)、發(fā)酵初始pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、接種量(2%、4%、6%、8%、10%(體積分數(shù)))等因素對乳酸菌胞外多糖產量的影響。

1.2.4 Plackett-Burman實驗設計篩選發(fā)酵工藝條件顯著因子

根據(jù)單因素的結果，使用Design-expert 8.0軟件，選用19因素，20次實驗次數(shù)的Plackett-Burman設計[22]，采用Design-expert 8.0軟件分析實驗結果，確定顯著因子。

1.2.5 響應面實驗

根據(jù)Plackett-Burman實驗設計結果，篩選出對出發(fā)菌株產胞外多糖影響顯著的3個因子，以胞外多糖產量為響應值，根據(jù)中心組合設計原理，采用Design-Expert 8.0軟件設計三因素五水平實驗并進行顯著性分析[23]，確定最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復3次，采用Design Expert 8.0軟件進行Plackett-Burman和Central Composite Design實驗設計及數(shù)據(jù)分析，圖形繪制采用Origin 8.5軟件，數(shù)據(jù)處理采用DPS 7.5軟件；對不同處理間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，Duncan法進行多重比較，圖中不同小寫字母表示處理間在P<0.05水平上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 高產胞外多糖乳酸菌篩選

將保藏的20株乳酸菌在改良的MRS固體培養(yǎng)基上平板劃線，觀察菌落特征，初篩結果如表1所示，選取其中6株菌落黏稠、有拉絲現(xiàn)象的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定其胞外多糖產量進行復篩。復篩結果如圖1所示。結果表明，其中1、2、6、10、16號5株菌的胞外多糖的產量基本都在550～800 mg/L之間，而LPC-1的胞外多糖產量可以達到1 060.39 mg/L，故選擇LPC-1菌株作為出發(fā)菌株進行后續(xù)實驗。

表1 產胞外多糖乳酸菌初篩結果Table 1 Preliminary screening results of exopolysacch-arides-producing lactic acid bacteria

注：“+”：是；“-”：否。

圖1 產胞外多糖乳酸菌復篩結果Fig.1 Re-screening results of exopolysaccharides-producing lactic acid bacteria

2.2 菌株LPC-1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學觀察

菌株LPC-1在改良MRS固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)如圖2所示，LPC-1菌落呈圓形、乳白色、邊緣整齊光滑，表面濕潤有光澤、黏稠、中央隆起、不透明。通過光學顯微鏡及掃描電鏡觀察顯示，LPC-1菌體為革蘭氏陽性，桿狀，不形成芽孢。菌落形態(tài)及菌體照片如圖2所示。

圖2 LPC-1菌株菌落及菌體形態(tài)Fig.2 Colony morphologies and electron micrograph(8 000×) of strain LPC-1

2.2.2 生理生化鑒定

對LPC-1菌株進行生理生化特征分析，以干酪乳桿菌菌株為對照，結果如表2所示，LPC-1菌株過氧化氫酶、H2S實驗、硝酸鹽還原實驗、明膠液化實驗、吲哚實驗表現(xiàn)為陰性，可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、棉子糖、甘露糖、阿拉伯糖、蜜二糖等，不能利用鼠李糖，與植物乳桿菌的性質接近。

表2 菌株生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical characters of strains

注：“-”表示陰性，“+”表示陽性。

2.2.3 分子生物學鑒定

對菌株LPC-1的16S rRNA序列進行擴增，獲得大小約為1.5 Kb的擴增片段(GenBank登錄號為MK722196)，將序列提交GenBank做Blast同源性比對分析。結果顯示，該序列與多株植物乳桿菌16S rRNA基因序列相似性為99%，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹結果如圖3所示，結果發(fā)現(xiàn)LPC-1菌株與乳桿菌屬在同一個分支，具有極高的同源性。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化等微生物學特性及其遺傳特性16S rDNA將菌株LPC-1初步鑒定為Lactobacillusplantarum。

圖3 16S rDNA構建的菌株LPC-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the polygenetic analysisof 16S rDNA sequences showing the position ofstrain LPC-1

2.3 單因素對LPC-1胞外多糖產量的影響

2.3.1 碳源對LPC-1胞外多糖產量的影響

由圖4-A所示，L.plantarumLPC-1均可以利用所添加的多種碳源，但胞外多糖產量各異，其中以蔗糖為碳源時，胞外多糖產量最高為1 080.86 mg/L，其次，分別為麥芽糖、葡萄糖和果糖，乳糖最低，因此選擇蔗糖作為L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的最佳碳源。DESAI等[24]從印度發(fā)酵穇子中篩選得到1株L.plantarum，研究發(fā)現(xiàn)其產胞外多糖的最佳碳源為乳糖。而姜云蕓等[25]對植物乳桿菌K25產胞外多糖影響因素發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖為碳源時，其胞外多糖產量達到最大，可達235.4 mg/L。以上說明植物乳桿菌產胞外多糖對優(yōu)勢碳源的需求存在一定的菌株差異性。

不同蔗糖濃度對L.plantarumLPC-1產胞外多糖的影響如圖4-B所示，隨著蔗糖濃度的增加，胞外多糖的產量先增加后降低，當蔗糖質量濃度為30 g/L時，胞外多糖產量達到最大1 268.19 mg/L，所以選擇蔗糖質量濃度為30 g/L作為L.plantarumLPC-1產胞外多糖的最佳碳源濃度。

圖4 不同碳源和碳源濃度對L. plantarum LPC-1胞外多糖產量的影響Fig.4 Effects of different carbon sources and concentra-tions on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.3.2 氮源對LPC-1胞外多糖產量的影響

如圖5-A所示，當以大豆蛋白胨為氮源時，胞外多糖產量達到最大為1 302.03 mg/L，所以選擇大豆蛋白胨為最佳氮源進行下一步實驗。劉晶等[26]從芬蘭傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的LactobacillusparacaseiVL8，利用大豆蛋白胨為氮源，其產胞外多糖產量達到最大，與本研究結果相一致。

不同大豆蛋白胨濃度對L.plantarumLPC-1胞外多糖產量的影響如圖5-B所示，當大豆蛋白胨為10 g/L時，L.plantarumLPC-1胞外多糖產量最大，為1 309.12 mg/L，過高或過低的碳氮比均會降低胞外多糖的產量，所以選擇大豆蛋白胨質量濃度為10 g/L作為L.plantarumLPC-1產胞外多糖的最佳氮源濃度。

圖5 不同氮源和氮源濃度對L. plantarum LPC-1胞外多糖產量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources and concentr-ations on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.3.3 發(fā)酵時間和溫度對LPC-1胞外多糖產量的影響

如圖6-A所示，當發(fā)酵時間達24 h時，胞外多糖產量達到最大，隨著發(fā)酵時間的延長，胞外產量逐漸降低，可能是由于發(fā)酵后期營養(yǎng)物質消耗和菌體產生降解多糖的酶。廖乾偉等[27]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌SR2-2胞外多糖隨著時間的延長而增加，在24 h達到最大值463.64 mg/L，隨后胞外多糖產量逐漸降低，與本實驗的L.plantarumLPC-1發(fā)酵條件相符合。

發(fā)酵溫度對L.plantarumLPC-1胞外多糖產量的影響如圖6-B所示，胞外多糖產量隨著溫度升高而增加，當溫度為30 ℃時，胞外多糖產量最高，溫度再升高時，胞外多糖產量有所下降。馮小婉等[28]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌AR307產胞外多糖最佳溫度為32 ℃，與本研究結果較為相似。

圖6 不同發(fā)酵時間和溫度對L. plantarum LPC-1胞外多糖產量的影響Fig.6 Effects of different fermentation time and temper-ature on the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.3.4 初始pH和接種量對L.plantarumLPC-1胞外多糖產量的影響

由圖7-A可知，初始pH值對L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的影響較大，L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的初始pH值為6.5時，即弱酸性條件，L.plantarumLPC-1胞外多糖產量達到最高。王英等[29]對干酪乳桿菌FM10-3的發(fā)酵產胞外多糖的pH研究也得到了相同的結論。

接種量對L.plantarumLPC-1胞外多糖產量的影響如圖7-B所示，當接種量為4%(體積分數(shù))時，L.plantarumLPC-1胞外多糖達到最高，為1 670.00 mg/L。隨著接種量的增加，胞外多糖產量逐漸降低。馮美琴等[22]對植物乳桿菌70810產胞外多糖優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，接種量為5%(體積分數(shù))時有利于胞外多糖的合成，與本研究結果略有差異，可能與菌株差異性有關。

圖7 不同pH值和接種量對L. plantarum LPC-1胞外多糖產量的影響Fig.7 Effects of different pH and inoculum concentrationon the yield of EPS from L. plantarum LPC-1

2.4 Plackett-Burman篩選發(fā)酵工藝條件顯著因子結果

Plackett-Burman實驗設計及結果如表3所示，利用Design-expert 8.0軟件對結果進行方差分析結果如表4所示，經過分析可以得到胞外多糖產量一階模型：

Y=1 224.38+19.44X1-33.88X2-46.88X3-56.30X4+14.90X5-26.49X6+140.12X7+9.62X8-43.18X9+17.54X10-3.19X11+180.03X12+165.92X13+4.69X14

2.5 中心組合實驗設計結果

根據(jù)Plackett-Burman實驗篩選出的3個顯著因子(溫度、pH、檸檬酸氫二銨)進行三因素五水平的中心組合實驗考察，測定胞外多糖產量，實驗結果如表5所示，采用Design-expert 8.0 軟件獲得擬合方程：

其中，y為胞外多糖產量，x1、x2、x3分別為溫度、pH值、檸檬酸氫二銨的編碼值。

表3 Plackett-Burman實驗設計與響應值Table 3 Plackett-Burman design matrix and results

表4 Plackett-Burman實驗方差分析Table 4 Analysis of variance for the Plackett-Burmandesign

表5 中心組合實驗設計與響應值Table 5 Central composite design(CCD) matrix andresults

表6 中心組合試驗方差分析Table 6 Analysis of variance for the central compositedesign

通過Design-expert 8.0 軟件分析可知，L.plantarumLPC-1合成胞外多糖的最佳發(fā)酵工藝條件為：溫度31.71 ℃、pH值6.68、檸檬酸氫二銨3.26 g/L，在此條件下發(fā)酵所得胞外多糖質量濃度理論值為2 069.18 mg/L，根據(jù)實際可行操作情況，將發(fā)酵條件修正為溫度32 ℃、pH值6.7、檸檬酸氫二銨 3 g/L，采取上述優(yōu)化條件進行3次重復實驗，結果測得胞外多糖平均質量濃度為2 064.69 mg/L，與預測值基本一致。

3 結論

本實驗從20株乳酸菌中篩選出1株高產胞外多糖的乳酸菌LPC-1，經鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。本研究從碳源、氮源、發(fā)酵時間、溫度、pH值、接種量對合成胞外多糖影響的單因素基礎上聯(lián)合Plackett-Burman實驗和Central-Composite實驗方法，通過顯著性分析及響應面分析，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：溫度32 ℃、pH值6.7、檸檬酸氫二銨3 g/L，在此條件下發(fā)酵測得實際質量濃度為2 064.69 mg/L，與預測值基本吻合，與優(yōu)化前相比增加了48.64%。

據(jù)報道，乳酸菌胞外多糖的產量一般都在50～800 mg/L左右，優(yōu)化后也很少達到1 000 mg/L，本實驗篩選得到的L.plantarumLPC-1優(yōu)化前胞外多糖質量濃度達到1 060.39 mg/L，最終優(yōu)化后，其胞外多糖質量濃度達到2 064.69 mg/L，與現(xiàn)如今報道的乳酸菌胞外多糖產量相比，本實驗篩選得到的L.plantarumLPC-1胞外多糖產量較高，具有較大的研究價值。