冷磨橙皮油生產工藝中離心廢水與精油的揮發性物質差異分析

張群琳，李貴節,2，程玉嬌，何雅靜，ROUSEFF R L，谷利偉,3*，吳厚玖，孫志高*

1(西南大學 柑桔研究所，國家柑桔工程技術研究中心，重慶，400712) 2(重慶市功能性食品協同創新中心，重慶，400067) 3(佛羅里達大學 食品科學與人類營養系，美國，32611-0720)

甜橙(Citrussinensis)屬蕓香科植物，其植株的果實、花及葉中都含有香氣物質[1]。甜橙外果皮中分布有扁圓形的油胞，直徑一般可達0.4～0.6 mm[2]，內含豐富的香精油，具有令人愉悅的獨特芳香風味，是一種廣受消費者歡迎的天然香料。食品、飲料及其他輕工業中大量使用甜橙精油來賦予產品天然橙香[3]。此外，甜橙精油還具有抑菌[4]、抗氧化、消炎[5]、抗病毒[6]和降血壓[7]等作用，因此也被廣泛應用于化妝品和醫藥行業。近年來，國內外市場對甜橙精油的需求呈持續增長的態勢。

甜橙精油的工業提取方法主要有冷磨法、水蒸汽蒸餾法和超臨界萃取法等[8]。其中冷磨法為常溫下機械力加工，未經熱處理，所得精油成分最接近天然組成，其香氣品質更接近于新鮮果香，因此冷磨法成為生產高品質甜橙精油的主要方法。典型的冷磨設備主要由螺旋軸和齒輥組成，果實被螺旋推進并由齒輥帶動翻滾，該過程中外果皮被刺傷，油胞破裂，皮油被大量噴淋水沖刷收集，形成皮油乳液[9]。乳液粗濾后，經第1次離心分離得到濃縮乳液、少量廢渣和一級離心廢水，濃縮乳液再經第2次離心分離得到冷磨油和二級離心廢水。冷磨油最后經低溫貯藏去除其中殘留的水分和蠟質，得到冷磨橙皮精油[10]。

甜橙精油的香氣源于其中所含的揮發性有機物(volatile organic compounds, VOCs)，主要由萜烯類、醇類、醛酮類和酯類組成。生產過程中不可避免地會有部分揮發性成分隨過濾皮渣、離心沉淀物以及離心廢水(aqueous effluent, AE)而損失。BRAT等[11]對揮發性物質在離心后皮渣和上清液中的分布情況展開研究，結果表明，乙醇、乙酸乙酯等醇、酯類高極性物質在水相中的溶解度更大。有文獻表明[9]，離心廢水中殘留總揮發性物質的量將在很大程度上影響精油的產量和品質，MOSHONAS等[12-13]對商業上生產橙皮油獲得的離心廢水進行了簡單定性分析，發現其中含有甜橙的大多數特征香氣成分；還對濃縮橙汁時的蒸餾回收物“水溶性精油(aqueous essence)”和精油間的香氣及揮發性成分進行比較，發現水溶性精油和精油具有不同的芳香特征，可能是由于揮發性物質的種類和含量上的差異造成的。這些研究表明與皮油直接接觸的水相中殘留有揮發性成分，可能成為回收香氣物質的重要來源，而目前針對冷磨甜橙精油離心廢水中揮發性物質的準確定性、定量分析研究尚無報道。

本研究以全球廣泛種植的伏令夏橙(Valenciaorange)為原料，通過實驗室模擬工業冷磨法生產精油的過程，利用頂空固相微萃取-氣質聯用技術(headspace solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)對2次離心廢水及精油中的揮發性物質進行定量與定性分析，為全面了解離心廢水中的揮發性物質種類和其香氣品質提供基礎數據，同時為進一步提高冷磨精油(cold-pressed oil, CPO)過程中總揮發性物質的回收利用率提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟伏令夏橙果實，中國農業科學院柑桔研究所資源圃；環己酮(>99.5%)，aladdin公司；C5-C25正構烷烴(色譜級)，Honeywell公司。

1.2 儀器與設備

9N50型碟片式分離機，青海農牧機械制造有限公司；Sorvall ST 16R高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Agilent 7890 GC-5977 MSD氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；85 μm，CAR/PDMS固相微萃取裝置，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 冷磨橙皮精油的制備及水、油取樣

冷磨橙皮油的制備參考MATTHEWS等[14]的方法并稍作修改，流程如圖1所示，具體步驟為：稱取3.3 kg伏令夏橙，量取1.4 L自來水于容器中，在水中用不銹鋼銼板對果實表皮進行適度銼磨，使油胞破裂釋放其中的皮精油。為減少皮油成分的揮發損失，容器全程置于冰水浴中。所得皮油乳液經200目紗布過濾去除大部分不溶性皮渣后，采用碟片式分離機進行第一級離心，循環多次獲得濃縮皮油乳液，同時收集第一級離心廢水(aqueous effluent I, AE I)。測定AE I的體積和可溶性固形物含量(total soluble solids, TSS)，置于-18 ℃氮氣中密閉保存待用。濃縮皮油乳液于4 ℃高速冷凍離心機中以7 026×g進行二級離心，收集上層澄清精油和下層廢液(aqueous effluent II, AE II)，分別測定其體積和AE II的TSS，而后置于-18 ℃氮氣中密閉凍藏備用。

圖1 冷磨精油生產工藝流程圖Fig.1 The flow chart of essential oil by cold pressing methods

1.3.2 頂空固相微萃取

取50 μL精制冷磨油于18 mL頂空瓶中，AE I、AE II解凍后各取2 mL于20 mL頂空瓶中，以使3個樣品的頂空體積基本相同。分別加入環己酮內標，充入氮氣后密閉。樣品于40 ℃水浴中平衡30 min，靜態頂空SPME吸附15 s，立刻進行GC-MS檢測。

1.3.3 GC-MS檢測條件

氣相條件：DB-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度230 ℃，不分流；升溫程序： 35 ℃保持3 min，以6 ℃/min升溫至203 ℃，以10 ℃/min升溫至243 ℃，保持3 min。氣體流速：1.2 mL/min。

質譜條件：電子轟擊離子源，70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z：40～350。

1.4 數據分析與統計

定性分析：以W10N14譜庫檢索結合DB-5色譜柱的保留指數進行定性。

保留指數(retention index, RI)將C5-C25正構烷烴混合標準品按1.3.3條件進樣，確定各物質保留時間，根據公式(1)進行計算：

(1)

式中：ti、tz、t(z+1)分別代表待測組分及碳數為z、z+1正構烷烴的保留時間，min。

半定量分析：利用內標法定量，以環己酮為內標物質。

待測組分在精油和2次離心廢水中的質量濃度X(μg/mL)分別根據公式(2)、(3)計算：

(2)

(3)

式中：Ai，待測組分峰面積；ms，內標物質量,μg；As，內標物的峰面積；V，進樣瓶中樣品體積,mL；f，相對揮發度，即內標物“環己酮”在水相和油相中標準曲線的斜率比，經過換算得f水/油=5.62。

所有實驗均測定3組平行樣品，實驗結果用平均值±標準偏差表示，顯著性分析使用SPSS 22.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同樣品中揮發性物質的定性和定量分析

一級離心廢水、二級離心廢水和冷磨精油中揮發性物質的總離子流圖如圖2所示。

a- AEI；b- AEII；c-CPO圖2 兩級離心廢水及冷磨精油的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile compounds in AE I、AE II and CPO注：對高響應值物質色譜峰進行標注，編號見表1；右上角小圖為完整總離子流圖，其中虛線區域內為放大部分。

通過譜庫檢索及與對比保留指數數據庫[15-16]，從3個樣品中共檢測鑒定出77種揮發性物質，各物質名稱及其在3個樣品中的濃度信息如表1所示。其中，AE I、AE II和CPO中分別鑒定出75、72和63種揮發性物質。

2.2 不同樣品中揮發性物質的分類分析及比較

如表2所示，AE I、AE II及CPO中揮發性物質總質量濃度分別為962.39、1 602.22及52 081.27 μg/mL，CPO濃度遠高于廢水的濃度；但將各個樣品中VOCs總濃度與樣品的總體積相乘(分別為1 400、36和3 mL)后，發現AE I中VOCs的含量占3個樣品VOCs總量的86.30%，遠大于AE II和CPO的含量(3.69%和10.00%)。該結果說明一級離心廢水帶走了原本屬于精油中的大量揮發性物質。與VOCs總量類似，除有機酸類化合物外，其他各類物質在CPO中的濃度均為最高，但以總量計則仍為AE I中含量最多。其中，醛酮類、醇類物質在AE I中的含量占3個樣品總含量的96.39%和94.94%。

表1 一級離心廢水、二級離心廢水和精油中的揮發性物質Table 1 Volatile compounds contained in AE I、AE II and CPO

續表1

續表1

序號RI1RI2化合物名稱化合物濃度/(μg·ml-1)AEIAEIICPO定性方法氣味描述詞[15-16]7515231524杜松萜烯Cadinene,d0.11±0.010.07±0.141.75±0.15MS、RI[E]woody,dry,mild7615281521順式-去氫白菖烯cis-Calamenene0.12±0.030.19±0.255.65±0.22MS、RI[A]herb,spice7716811677卡達烯Cadalene0.01±0.000.02±0.010.51±0.05MS、RINA

注：RI1表示DB-5色譜柱的保留指數，RI2文獻中參考保留指數；“—”表示未檢出；“tr”表示檢測到但沒有定量；NA表示未查到描述詞；[A～I]分別代表藥草香、果香、青香、油脂香、木香、松香、花香、不愉悅、橘香等香氣屬性。

表2 三個樣品中揮發性物質分類匯總表 單位：μg/mLTable 2 Structural categorization of volatile components in three samples

注：a-各類化合物所含成分的個數;b-其他包含單萜氧化物和蒎烷等。

2.2.1 單萜烴類化合物

有研究表明[17]，在甜橙精油中，單萜烴類化合物中的D-檸檬烯、檜烯、β-月桂烯、蒎烯等是最主要的氣味貢獻成分。從表1、2可知，單萜碳氫化合物在AE I、AE II和CPO中的含量分布情況相似，都是相對含量最高的物質。D-檸檬烯是3個樣品中含量最豐富的共有成分；在離心廢水中含量較高的其他主要單萜類成分有β-月桂烯、α-萜品油烯、α-蒎烯和檜烯，前兩者分別具有濃郁的香料味和柑橘味，后兩者則被描述為松脂味[15]。3-蒈烯僅在AE I被檢測到；(E)-b-羅勒烯僅在AE I和CPO中檢測到，且其在AE I中的濃度遠高于CPO。2,6-二甲基-3-辛烯和(-)-β-香茅烯含量極低(<0.005%,w/w)，屬于痕量成分。

2.2.2 倍半萜烴類化合物

在3個樣品中，瓦倫西亞橘烯都是含量最高的倍半萜類物質，為柑橘類果實常見的香氣成分，通常被描述為木頭味和柑橘味[16]。含量次之的此類物質，在AE I中分別為α-古巴烯、β-反式石竹烯、β-蛇麻烯，而在AE II和CPO中為順式-去氫白菖烯、α-金合歡烯。有文獻[18]稱在肯尼亞伏令夏橙皮油中α-金合歡烯為含量最高的倍半萜類物質，且未檢測到瓦倫西亞橘烯，2種物質在含量上的差異顯示果實產地可能對揮發性成分的組成有重要影響。

2.2.3 醛酮類化合物

相關文獻表明，醛酮類中多數物質香味閾值很低，低濃度時也可表現出很強的氣味[19]，如辛醛、癸醛、壬醛和香茅醛等[20]。在AE I、AE II及CPO中，醛酮類化合物是除單萜烴類化合物之外含量最高的化合物種類，其中辛醛和癸醛是3個樣品中含量最高的醛類物質，兩者含量之和分別占AE I及AE II中醛酮類物質總量的71.39%、72.12%(w/w)。香葉醛、橙花醛、紫蘇醛和香茅醛是3個樣品中主要的單萜醛類物質，其中香茅醛含量最高，與其他甜橙皮油的研究結果一致[18]。正己醛在AE I中的濃度極大地高于其在CPO中的濃度，與RADFORD等[21]構建的含柑桔果渣和水的模擬體系中醛類的分布相類似，即極性更高的醛類主要存在于水相中。在AE I、AE II色譜圖的前10 min發現存在3-羥基-正丁醛、(E)-2-戊烯醛和3-甲基-2-丁烯醛(圖3)，這些醛類物質在CPO中并沒有檢測到。(Z)-香芹酮是3個樣品中最主要的酮類物質，其濃度是其他同類物質濃度的5～7倍；2,3-丁二酮是AE II中檢測到的唯一酮類物質。

a- AE I；b- AE II；c-CPO圖3 3個樣品的總離子流圖前端色譜圖Fig.3 Early eluting part of the total ion chromatograms of the volatile compounds in three samples注：圖(a)、(b)中物質的色譜峰對應編號見表1。

2.2.4 醇類物質

芳樟醇不僅是CPO，也是AE I、AE II中含量最高的醇類物質，分別占3個樣品中總醇類物質量的92.53%、91.11%和89.44%(w/w)。其他含量較高的醇類物質為α-松油醇、4-松油醇和香茅醇等，有文獻表明檸檬烯經水合作用可以轉化為α-松油醇[22]，這可能是AE I、AE II中含較高濃度α-松油醇的原因之一。此外，CPO中缺失了幾種醇類物質，它們僅在AE I、AE II的色譜圖中檢測到，分別為3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、(Z)-2-戊烯-1-醇，這些醇類在其他甜橙精油中也并未見報道。

2.2.5 其他物質

研究發現酯類物質含量極低。其中在CPO中鑒定出辛酸乙酯和丁酸香茅酯，這2種酯類物質被多次報道存在于甜橙果汁中[21,23]，但尚未在冷磨橙皮油中檢出。順式-氧化檸檬烯是3個樣品中唯一被鑒定出的環氧化物，其他文獻報道的環氧月桂烯、(E)-芳樟醇氧化物、環氧石竹烯[18,24]等物質均未被檢測到。這些氧化物可能是甜橙油中的天然成分，也可能是在樣品制備、儲存或分析過程中，在熱或酸的影響下經氧化而形成[18]。本研究前處理在低溫和氮氣保護環境下進行，可能在一定程度上避免了氧化反應的發生。

由上述分析可知，離心廢水與精油中的揮發性成分種類接近，均檢測出烯烴、醛酮、醇、酯等化合物。兩類樣品間的差異主要體現在VOCs的濃度和含量上，還體現在極性較強的小分子醇、醛和酯類物質的分布上。后者的分布趨勢與MOSHONAS等[13]的報道相符。

2.3 不同樣品間各香氣屬性物質的組成差異

揮發性香氣物質的濃度是影響樣品香氣品質的重要原因之一[25]。通過比對數據庫[15-16]以及查閱文獻資料[26-29]，完成對所有揮發性物質所對應香氣描述詞的查找和匹配，最終將3個樣品中的揮發性物質歸為果香型(7個)、青香型(6個)、花香型(9個)、脂香型(8個)、木香型(6個)、松香型(7個)、橘香型(8個)、藥草香型(12個)及不愉悅氣味(4個)9類香型。分別計算3個樣品(j=1、2、3)中每種香型(i=1、2、…、9)物質濃度占該樣品總VOCs濃度的比例Z(j,i)(c/c,%)，以Z(j,i)最大值為單位“1”作圖，比較香型分布的樣品差異，結果如圖4所示。

圖4 不同香氣類型的揮發性物質在3個樣品中的分布差異Fig.4 Distribution variance of volatile compounds that attribute to different aroma type in three samples

由圖4可知，就同類香型物質而言，其在AE I、AE II及CPO中的分配比例具有極顯著差異(P<0.01)。果香、青香、花香、脂香、藥草香等香型成分在AE I中所占比例明顯高于AE II及CPO，其中AE I中花香型物質所占比例為4.88%(c/c)，是CPO中(0.81%)的6倍；木香、松香等香型物質在CPO中更為豐富，如松香成分在CPO和AE I中所占比例(c/c，%)分別為5.39%和2.26%，前者約是后者的2.4倍。

3 結論

通過HS-SPME-GC-MS對離心廢水和冷磨皮精油中揮發性物質的定性、定量分析，檢測鑒定出77種揮發性物質，在2次離心廢水中發現的揮發性物質種類與皮精油中揮發性物質種類基本重疊，其區別集中體現在一些易溶于水的小分子脂肪族醇、醛及酯類物質上。通過定量分析，雖然各物質在精油中的濃度顯著高于其在AE I、AE II中的濃度，但AE I中的揮發性物質的總量卻是精油中總量的8.6倍，占3個樣品揮發性物質總和的86.30%。2次離心廢水與精油中不同香型物質的濃度在各樣品VOCs總量中的分配比例存在顯著差異(P<0.01)，離心廢水中青香、果香、花香、藥草香等香型物質比例高于精油中的比例。綜合可知，冷磨橙皮油生產過程中產生的離心廢水中含有種類豐富的大量揮發性物質，具有很大的回收利用價值。