入壇發酵對安岳壇子肉脂質代謝以及風味物質形成的影響

肖嵐，李燮昕，鮮丹丹，劉妍佳，朱楠，熊敏

(四川旅游學院 食品學院，四川 成都，610100)

四川安岳壇子肉是將豬五花肉經過油炸之后再拌入香辛料，一層腌制蘿卜絲一層肉入壇腌制發酵而形成的發酵肉制品，是一種歷史悠久的傳統肉制品，因入陶壇中腌制發酵而成名，故名壇子肉。安岳壇子肉具有濃郁的醬香風味，且脂肪部分晶瑩剔透、肥而不膩，其典型品質及良好風味形成可能與入壇發酵過程中發生的一系列反應有關。廖定容[1]對四川漢源罐罐肉的風味形成機理進行了初探，主要從蛋白質、脂肪、微生物、內源酶、美拉德反應、揮發性物質幾個方面進行研究，結果發現罐罐肉獨特的風味特征主要是通過蛋白質降解、脂肪水解氧化、美拉德與焦糖化反應共同作用而產生的。BOLZONI等[2]研究了不同發酵時間的Parma火腿在發酵過程中揮發性風味成分的變化，羰基化合物、酯、醇和醛是其主要揮發性風味成分。章建浩等[3]研究了金華火腿傳統工藝過程中揮發性風味物質的變化規律，高溫成熟工藝過程中產生的大量羧酸構成其獨特風味。王德寶等[4]報道了發酵劑對羊肉香腸中蛋白質、脂質代謝與風味物質的影響，結果表明，添加復合發酵劑有助于提高香腸單不飽和脂肪酸含量及風味感官品質。陸應林[5]對南京板鴨加工過程中蛋白降解及風味物質進行了研究，結果表明，南京板鴨加工過程中共有90種化合物，成品南京板鴨中醛、醇、烴和酮類化合物含量較高。周才瓊等[6]分析了酸肉發酵過程中的風味物質，主要風味物質是癸酸乙酯和 2,4-癸二烯醛。以上研究提示，發酵肉制品典型品質及良好風味形成與發酵期間的微生物作用[7]、蛋白質降解[8-9]、氨基酸Strecker降解[10]、脂肪的氧化和降解[11-12]、美拉德反應[13]密切相關。然而關于安岳壇子肉特征風味形成機理的研究報道比較鮮見，因此，本文選擇安岳壇子肉入壇前以及入壇發酵20、40、60、75 d為研究對象，動態探究入壇發酵對壇子肉脂質代謝及風味物質形成的影響，以期為安岳壇子肉風味形成的機制提供科學依據，也為安岳壇子肉的實際生產應用提供理論依據及數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四川安岳壇子肉，委托安岳縣普州壇子肉食品有限公司加工。

石油醚(沸程 30～60 ℃)、三氯甲烷、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、2-硫代巴比妥酸(TBA)等，均為分析純；脂肪酶試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器設備

Thermo Trace 1300氣相色譜，美國Thermo公司；Thermo scienrific ISQ質譜，美國Thermo公司；PAL System三合一進樣器，瑞士CTC公司；100 μm PDMS萃取纖維頭，美國Supelco公司；AUW220D電子天平(精度為0.1 mg)，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 壇子肉樣品準備

委托安岳縣普州壇子肉食品有限公司按照冬季生產的工藝流程制備壇子肉，工藝流程如下：

豬五花肉(四川三元雜交內江豬，屠宰后未排酸成熟，采用五花肉作為原料，切配成 500 g左右的長條狀) →晾干(自然晾干，夏季風干 1～2 h，冬季風干 2～4 h，肉塊表面干爽為止) →油炸(采用豬油進行油炸，油溫 160～180 ℃，油炸 5～8 min，表面微黃即可)→碼味腌制(將濾過油的肉均勻涂抹上食鹽、白酒以及香辛料，放置2～3 h即可入壇腌制發酵) →入壇發酵 75 d(一層腌制蘿卜絲一層肉脯的方式入燒制的土壇中厭氧發酵，水封隔絕空氣)

取樣：分別在入壇前以及入壇發酵 20、40、60、75 d各取1次樣，經真空包裝后保存于-80 ℃，備用。

1.3.2 脂肪相關理化指標的測定

參照GB 5009.6—2016 《食品中脂肪的測定》測定壇子肉總脂肪。參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》測定壇子肉游離脂肪酸含量。參照GB 5009.229—2016 《食品中酸價的測定》測定測定壇子肉酸價。參照GB 5009.227—2016 《食品中過氧化值的測定》測定測定壇子肉過氧化值。參照鐘智豪[14]的方法硫代巴比妥酸值的測定。脂肪酶活力采用南京建成的分脂肪酶試劑盒測定。

1.3.3 壇子肉揮發性物質GC-MS測定

參照葉芳艷等[15]的方法。電離源EI，能量70 eV，倍增電壓1 400 V；離子源溫度200 ℃，接口溫度280 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描范圍40～450m/z，間隔0.3 s。采集到的質譜數據經與MEANLIB、NISTDEMO和WileyLibrary數據庫檢索定性，將匹配度大于800作為鑒定依據，并采用峰面積歸一化法分析各成分的相對含量。

1.3.4 數據處理

試驗數據經3次平行試驗后得到，均以平均數±標準差表示，采用Excel和SPSS 19. 0統計軟件對數據進行統計處理和顯著性分析，顯著水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 入壇發酵對安岳壇子肉脂肪氧化相關指標的影響

如表1所示，隨著入壇發酵時間的延長，總脂肪含量持續降低，發酵第75天壇子肉中脂肪含量極顯著低于入壇前壇子肉(P<0.01)，一方面可能與壇內蘿卜絲吸附壇子肉的脂肪有關，另一方面與壇子肉脂肪自身發生的降解、氧化有關。

酸價是衡量壇子肉中游離脂肪酸總量的重要指標，而游離脂肪酸含量的高低與壇子肉的風味密切相關，某些脂肪酸可直接貢獻壇子肉風味，大部分的脂肪酸則進一步反應生成醛、酮、酸等揮發性物質。由表1可知，壇子肉在發酵過程中的酸價呈上升趨勢，特別是發酵后期，發酵第75天壇子肉酸價顯著高于入壇前壇子肉酸價(P<0.05)，脂質的降解可能與發酵期間微生物數量及其代謝產生的酯酶有密切關系。

由表1可知，入壇前壇子肉POV較高，入壇發酵壇子肉的POV降低了，發酵第75天壇子肉的POV較入壇前極顯著降低(P<0.01)。這是因為壇子肉在入壇前經高溫油炸，導致脂肪酸氧化形成一級氧化產物—氫過氧化物；油炸后的壇子肉入壇發酵，氫過氧化物在微生物等的作用下分解形成低分子二級脂質氧化產物，如醛、酮、酸和羥基酸等(通常稱活性羰基物)[16]。

TBA是用于反映脂肪氧化終產物的指標，其值越高說明脂肪氧化降解程度越大[17]。由表1可知，與壇子肉入壇發酵前比較，發酵壇子肉的TBA均顯著升高(P<0.05)，即發酵促進了壇子肉脂肪的氧化降解，可能與脂肪酸降解產生醛類物質進一步氧化為醇和羥基酸等小分子物質有關。

脂肪酶是一類蛋白質，壇子肉經高溫油炸導致其脂肪酶變性從而喪失其生物活性，故入壇前壇子肉中脂肪酶比活力未檢出。其中，發酵第 20天壇子肉中脂肪酶比活力顯著低于第40天和第60天發酵壇子肉(P<0.05)，結果提示，入壇發酵可促進微生物大量繁殖產生脂肪酶。然而，發酵第75天壇子肉中脂肪酶比活力卻低于第40天和第60天發酵壇子肉(P>0.05)，這可能與發酵后期的溫度升高，微生物數量減少有關。

另外，入壇發酵各階段的壇子肉POV始終低于腌臘肉制品GB/T 2730—2015 規定的限量(0.5 g/100 g)；且始終低于肉類發出腐臭異味的TBA閾值(5 mg MDA/kg)[18]，安岳縣普州壇子肉食品有限公司的企業標準是以此限量做為參考，說明壇子肉具有較好的安全性。

表1 發酵對壇子肉脂肪相關的理化指標影響Table 1 Effects of fermentation on physicochemical indicators related to fat in jar meat

注：同行各組之間相比，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。“-”表示未在對應樣品中檢索到該物質。下同。

2.2 入壇發酵對安岳壇子肉中游離脂肪酸的影響

脂肪酸含量及組成對安岳壇子肉的風味具有重要作用。由表2可知，壇子肉在入壇發酵前以及入壇后各發酵階段的脂肪酸主要以硬脂酸(C18∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1 n7)、油酸(C18∶1 n9c)及亞油酸(C18∶2 n6c)為主，其中硬脂酸和棕櫚酸含量高于其他飽和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)。入壇發酵對壇子肉中游離脂肪酸組成及含量會產生較大影響，這與壇內微生物及其分泌的脂酶分解肉中中性脂肪及磷脂有關[19]。值得注意的是，入壇發酵第75天時，壇子肉中SFA總含量(30.66)較入壇前SFA總含量(38.90)顯著降低(P<0.05)，其中棕櫚酸的含量極顯著降低(P<0.01)，是影響入壇前與入壇發酵第75天壇子肉中SFA總含量的主要脂肪酸，這可能與入壇發酵過程中的微生物促使飽和脂肪酸被分解或去飽和轉化為不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFA)有關[20]。另外，入壇前壇子肉中未檢出丁酸(C4∶0)，而在入壇發酵壇子肉中檢測出丁酸。

棕櫚油酸以及油酸含量高于其他單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)，是影響壇子肉中MUFA含量差異的主要脂肪酸。棕櫚油酸以及油酸是熟豬肉火腿、香腸中的重要風味前體物質，加熱可促進其被氧化、分解為閾值較低的醛類、醇類以及酮類風味物質，例如具有烤肉香味的 2-庚烯醛、青草香味的 1-己醇和油脂香味的 2-癸烯醛[21]。由表2可知，壇子肉中MUFA含量呈波動變化，與入壇前壇子肉比較，差異不顯著(P>0.05)；然而，入壇發酵第75天壇子肉中MUFA含量顯著高于發酵第60天壇子肉(P<0.05)。在發酵過程中，油酸含量呈先降低后升高的變化趨勢，可能與油酸的sn-1和sn-3位置有關，易被微生物分泌的脂肪酶水解[22]；其中，發酵第75天壇子肉中油酸含量顯著高于發酵第60天壇子肉(P<0.05)。另外，入壇發酵第75天壇子肉中檢出芥酸(C22∶1n9)，可能與壇內的腌制蘿卜干有關。

與入壇前壇子肉比較，發酵壇子肉中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)的種類以及含量均有變化。入壇前壇子肉中未檢出二十碳五烯酸(C20∶5n3)、花生四烯酸(C20∶4n6)以及二十二碳六烯酸甲酯(C22∶6n3)，入壇發酵促進了此 3種PUFA的形成。入壇后特別是入壇發酵第75天時，壇子肉中的PUFA含量顯著高于入壇前壇子肉(P<0.05)，特別是亞油酸和γ-亞麻酸(C18∶3n6)的含量均有極顯著上升(P<0.01)；亞油酸和γ-亞麻酸作為風味前體物質，可在不同斷裂位點降解氧化為丙酸、癸醛、烯醛和二烯醛及酮類等羰基類風味物質[23]，說明微生物對壇子肉中PUFA釋放起主要作用，這一結果與江玉霞[11]、沈清武等[20]研究相一致。

2.3 入壇發酵對安岳壇子肉風味物質形成的影響

由表3可知，入壇前壇子肉與入壇發酵壇子肉中的揮發性物質種類存在較大差異，揮發性物質含量差異不顯著(P>0.05)。壇子肉發酵第40天時，揮發性物質種類達到最大值，共檢出63種揮發性物質，揮發性物質總數較入壇前多24種；隨著發酵時間延長，壇子肉中檢出的揮發性物質的種類在逐步減少，然而，發酵第60天壇子肉中揮發性物質的相對含量卻達到最大值85.89%。壇子肉中揮發性物質種類和含量的變化與其發酵過程密不可分，微生物代謝分泌脂肪酶、蛋白酶、酯酶等，從而促進壇子肉中脂肪、蛋白質、碳水化合物等大分子物質降解形成醛類、酮類、酯類等風味物質[19]，然而關于壇子肉發酵過程中的微生態系統及其作用機理暫不明確，本課題組將在后續試驗中深入研究。

表2 入壇發酵對安岳壇子肉中游離脂肪酸的影響 單位：g/100g

表3 不同發酵時間壇子肉中揮發性風味物質歸類分析Table 3 Classification analysis of volatile flavor compounds in jar meat with different fermentation time

由表3、表4可知，發酵第60天壇子肉中醛類物質的相對含量極顯著高于入壇前和發酵第40天壇子肉(P<0.01)，其余組間差異不顯著(P>0.05)。在發酵肉制品中，醛類物質是被分離鑒定出的含量最豐富種類最多的揮發性風味物質之一[24]，具有較低閾值和良好香氣，是肉制品中重要揮發性風味物質[25]。然而，壇子肉中醛類物質的種類和相對含量卻是較低的，如表4所示，入壇前壇子肉中檢出 3種醛類物質，分別是 2-甲基丁醛、戊醛以及正己醛，戊醛具有果香和面包香，正己醛具有青草味；發酵壇子肉中醛類物質減少，第20天和第75天發酵壇子肉中未檢出醛類物質，第40天和第60天發酵壇子肉中各檢出 2種醛類物質，分別是巴豆醛、正己醛以及乙醛、正己醛。發酵導致壇子肉中醛類物質減少，可能與醛類物質在發酵過程中參與美拉德反應生成相應的羧酸并進一步形成酯有關。

與醛類物質比較，醇類物質的種類和相對含量在壇子肉風味物質中占據絕對優勢，入壇發酵促進壇子肉中醇類物質相對含量極顯著增加(P<0.01)。壇子肉發酵第20天時其相對含量達到最高值，為46.76%；發酵第40天時其種類達到最高值，為 24 種。入壇發酵改變了壇子肉中醇類物質的種類和相對含量，這與發酵過程中某些化合物的降解以及脂肪酸氫過氧化物次級物的分解有關[26]。醇類具有較高的風味閾值，其香味對肉制品風味的影響并不顯著[4]，但對肉制品的風味有關鍵作用。乙醇在壇子肉中的相對含量最高，入壇前的相對含量為16.72%，可能與壇子肉使用白酒碼味腌制有關；隨后發酵過程中，乙醇相對含量升高，可能與壇內微生物分解蘿卜絲中的碳水化合物進行乙醇發酵有關。在發酵第20、40、60天的壇子肉中檢出了具有濃郁蘑菇香味的 1- 辛烯-3-醇，主要來源于花生四烯酸和亞油酸的脂質氧化，且發酵第40天時其相對含量高達 0.34%。另外，發酵壇子肉中檢出具有芳香氣味的苯乙醇、苯甲醇、正庚醇、辛醇以及己醇，這可能對壇子肉風味的形成具有一定作用。

酮類一般由氨基酸Strecker降解或是脂肪降解、氧化以及微生物分解代謝產生，具有花香、果實的香味、油味、脂肪味或奶酪味，碳鏈越長風味越濃郁[27]。入壇前壇子肉中僅檢出 1種酮類物質，入壇發酵壇子肉中檢出 6種，可能正是它們對發酵壇子肉的特征風味形成有一定影響。3-羥基-2-丁酮具有清香、奶香味，在發酵第40天壇子肉中相對含量最高，為 0.45%，而在入壇前壇子肉中未檢出，說明發酵過程中的微生物有助于代謝檸檬酸生成二乙酸最終轉化為3-羥基-2-丁酮[28]。

入壇前與入壇發酵壇子肉中檢出的酸類物質共4種，入壇前壇子肉中僅檢出胱氨酸和乙酸，丙酸和丁酸未檢出；入壇前壇子肉中乙酸相對含量僅為 0.53%，發酵第40天時達到最高值，為 2.32%，可見發酵促進了乙酸的生成，而乙酸可以賦予壇子肉酸醋味。

壇子肉在發酵過程中其酯類物質的相對含量和種類是波動變化的，發酵第40天壇子肉中酯類物質種類(14 種)及相對含量(14.92%)最高。酯類的形成與游離脂肪酸和脂類氧化產生的醇的酯化作用有關；此外，醛類會被氧化生成酸類進而發生酯化反應，因此，醛類的變化也可影響酯類的生成。酯類通常閾值較低，短鏈酯具有愉快的水果甜味，長鏈酯具有油脂味，有甲基支鏈的短鏈酯與成熟肉的風味特征有關[29]。發酵壇子肉中含量較高的乙酸乙酯、丙酸乙酯、正己酸乙酯以及入壇前壇子肉中未檢出的辛酸乙酯、庚酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乳酸乙酯可能賦予了壇子肉特殊的風味。

入壇前壇子肉中檢出 15 種碳氫化合物質，相對含量高達 29.94%，這可能與高溫油炸過程中氫過氧化物裂解生成烴類物質有關；發酵壇子肉中碳氫化合物的種類及含量是波動變化的，但其含量卻均低于入壇前，可能是碳氫化合物在發酵過程中進一步反應生成其他物質而導致的相對含量顯著下降(P<0.05)。2,2,4,6,6-五甲基庚烷在壇子肉中相對含量最高的，發酵第20天壇子肉中的相對含量為 11.19%，發酵第40天時為 9.09%，發酵第60天時為 11.91%，第75天時的相對含量為9.17%；在發酵壇子肉中相對含量較高且未在入壇前壇子肉中檢出的碳氫化合物是正辛烷，發酵第40天時的相對含量最高，為 2.29%。碳氫化合物閾值較高，一般認為對肉類風味的貢獻不明顯，但是含量較高的 2,2,4,6,6-五甲基庚烷可能會對壇子肉的風味產生影響。

發酵壇子肉中檢出 2種雜環化合物，分別是2-甲基戊酸酐和2-正戊基呋喃，其中的 2-正戊基呋喃是亞油酸的一種氧化產物，具有類火腿香味。含硫化合物檢出 4種，包括3,4-雙(甲硫基)喹啉、二甲基硫、二甲基二硫和二甲基三硫，其中二甲基二硫在入壇發酵過程中的含量呈上升趨勢，其表現出一種類似臟襪子味的不愉快的風味，是由含硫氨基酸經Strecker降解形成硫醇并進一步氧化形成的，還可進一步形成二甲基三硫[30]。雜環化合物和含硫化合物閾值很低，可能對壇子肉特殊風味有影響。含氮化合物是由氨基酸降解而形成的，僅在發酵第20天的壇子肉中檢測出4,6-二甲基嘧啶，在發酵第40天的壇子肉中檢出N-乙基丙酰胺，其形成以及分解的具體途徑有待進一步研究。

壇子肉發酵第 40天時檢出 4-乙基苯酚，相對百分含量為 0.05%，由于酚類化合物閾值較高，對風味影響較弱。

表4 入壇發酵對安岳壇子肉風味組成及含量的影響Table 4 Effect of fermentation on flavor composition and content of jar meat

續表4

種類化合物名稱化學式相對含量/%入壇前發酵第20天發酵第40天發酵第60天發酵第75天1,3-丙二醇單乙醚C5H12O2----0.03±0.014-烯丙基苯甲醚C10H12O----0.16±0.07八甘醇單正十二烷基醚C28H58O90.06±0.01----醚類18-冠醚-6H12H24O60.03±0.01----六乙二醇單甲醚C13H28O7---0.07±0.02-壬乙二醇單甲醚C19H40O10---0.11±0.03-15-冠醚-5C10H20O50.09±0.02----六乙二醇單十二醚C24H50O7---0.18±0.07-18-冠醚-6H12H24O6---0.13±0.04-12-冠醚-4C8H16O4---0.15±0.06-十甘醇單甲醚C21H44O11----0.09±0.02乙醛C2H4O---2.67±0.69-2-甲基丁醛C5H10O0.31±0.14----醛類戊醛C5H10O0.34±0.13----巴豆醛C4H6O--0.33±0.17--正己醛C6H12O0.39±0.18-0.09±0.030.05±0.02-含硫化合物二甲基硫C2H6S3.84±1.36--1.39±0.680.64±0.243,4-雙(甲硫基)喹啉C9H7N0.14±0.07----二甲基二硫C2H6S20.06±0.010.08±0.020.10±0.010.24±0.060.25±0.05二甲基三硫C2H6S3--0.09±0.02--4-羥基-2-丁酮C4H8O2---5.16±1.06-3-辛酮C8H16O-0.21±0.080.37±0.120.07±0.020.19±0.043-羥基-2-丁酮C4H8O2-0.15±0.060.45±0.130.34±0.12-酮類4-壬酮C9H18O0.28±0.06----2,3-辛二酮C8H14O2--0.48±0.10--1,3,3-三甲基-二環[2.2.1]庚-2-酮C10H16O---0.04±0.01-2-壬酮C9H18O--0.05±0.01--乙酸乙酯C4H8O28.18±2.364.36±1.834.97±1.525.02±2.285.37±2.35丙酸乙酯C5H10O20.85±0.262.58±0.744.00±1.063.89±1.274.22±1.73乙酸異丁酯C6H12O2-0.05±0.010.07±0.02--丁酸乙酯C6H12O20.37±0.050.24±0.080.66±0.140.26±0.070.50±0.132-甲基丁酸乙酯C7H14O2-0.05±0.010.18±0.060.35±0.140.13±0.04異戊酸乙酯C7H14O2--0.06±0.010.09±0.020.05±0.01乙酸異戊酯C7H14O2--0.22±0.050.43±0.130.24±0.07酯類正己酸乙酯C8H16O20.15±0.061.36±0.542.35±0.730.60±0.151.36±0.83六-5-烯酸乙酯C18H34O2--0.15±0.06--庚酸乙酯C9H18O2-0.47±0.130.60±0.240.23±0.070.34±0.13乳酸乙酯C5H10O3--0.87±0.250.92±0.270.95±0.31L(-)-乳酸乙酯C5H10O3-0.88±0.24-0.70±0.16-辛酸乙酯C10H20O2-0.26±0.050.54±0.120.44±0.150.49±0.07癸酸乙酯H12H24O2-0.19±0.070.16±0.040.23±0.080.17±0.05四乙基乙二醇單甲酯C9H20O5--0.09±0.01--酚類4-乙基苯酚C8H10O--0.05±0.01--雜環類2-甲基戊酸酐H12H22O3---0.31±0.12-化合物2-正戊基呋喃C9H14O----0.22±0.07含氮N-乙基丙酰胺C5H11NO--1.76±0.53--化合物4,6-二甲基嘧啶C6H8N2-0.08±0.03---

3 結論

安岳壇子肉是四川省資陽市安岳縣特有的傳統發酵肉制品，關于安岳壇子肉典型品質及特征風味形成機理的研究鮮有報道。為了全面了解入壇發酵對壇子肉脂質分解及風味物質形成的影響，本試驗對發酵過程中的壇子肉脂質分解以及揮發性風味物質進行檢測，結果發現入壇發酵可促進壇子肉脂質降解、氧化，特別是對PUFA釋放起到關鍵作用。入壇發酵可提高壇子肉中風味物質種類和相對含量。總之，入壇發酵有助于提高壇子肉中PUFA相對含量，促進脂肪酸氧化分解為壇子肉中的特征風味物質——正己醛、乙醇、1- 辛烯-3-醇、3-羥基-2-丁酮、乙酸、乙酸乙酯、丙酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乳酸乙酯、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、2-正戊基呋喃、二甲基二硫。