秸稈替代全株四棱豆對全混合日糧發酵品質及有氧穩定性的影響

邱小燕，奚愷鋒，謝新輝，田玉橋，伍賢進，曾軍英，邵濤，姚元枝*

1(懷化學院 生物與食品工程學院，湖南 懷化，418008)2(湖南農業大學 園藝園林學院，湖南 長沙，410123)3(民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化，418008)4(湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室,湖南 懷化，418008)5(南京農業大學 飼草調制加工與貯藏研究所，江蘇 南京，210095)

近年來，飼料短缺已成為制約畜牧產業迅速發展的重要因素。發酵全混合日糧(total mixed ration, TMR)是指TMR在厭氧環境下經過乳酸菌發酵，最終配制成營養相對平衡的日糧[1]。近年來，發酵TMR已被廣泛用于奶牛的飼喂，而且將農副產品及食品副產物調制成發酵TMR的趨勢也在逐漸增加[2-3]。TMR經過發酵能產生特別的酸香味，提高奶牛的食欲，有利于奶牛的生長和發育。丁良等[4]用不同比例筍殼逐步替代全株玉米調制成發酵TMR，25%替代組不僅有良好的發酵品質而且有氧穩定性高。WANG等[5-6]將蘑菇渣、綠茶渣等農副產物調制成發酵TMR，獲得了品質優良、營養均衡的全價飼料。WEINBERG等[7]將含有玉米酒糟的發酵TMR保存140 d后，其發酵品質和有氧穩定性均良好。SRITA等[8]用40%的土豆渣和豆腐渣替代精料調配成發酵全混合日糧，發酵品質較好，且采食率沒有顯著變化。王勇等[9]以全株玉米和青稞秸稈為主要粗飼料的TMR配方基礎上，用苜蓿、全株燕麥和小麥秸稈按不同比例替代全株玉米，30%全株玉米替代組可應用于生產實際。因此，推廣發酵TMR技術已成為促進農區畜牧業發展的重要措施。

四棱豆(PsophocarpustetragonolobusL.)為菜豆族四棱豆屬的栽培種，是一種攀援類植物，高度一般在3～4 m。四棱豆不僅蛋白質含量高，且富含必需氨基酸[10]，但四棱豆種植面積較少，作為飼料的精糧成本頗高。中國是農作物秸稈產出大國，年總量達5.2×108t以上[11]，大量秸稈隨地堆棄和任意焚燒對環境造成嚴重污染[12]。因此，秸稈飼料化已成為促進農區畜牧業發展的重要措施，不僅可以減少資源的浪費和環境的污染[13]，還能帶動畜牧經濟的增長。但是秸稈質地粗糙、適口性差，干物質和粗纖維含量高，且可溶性碳水化合物含量低，自然附著的乳酸菌數量少[14]，所以常規青貯很難調制出高品質的青貯飼料。若能用秸稈代替部分四棱豆制成發酵TMR，不僅可以彌補秸稈蛋白質含量不足、適口性差的缺陷，也能降低飼料成本。可見，若將秸稈替代四棱豆，調配成發酵TMR，既可以解決優質飼料資源受限的問題，又能充分利用農副產品，變廢為寶。

本試驗以水稻秸稈、玉米秸稈、全株四棱豆、精料為原料調配成不同比例混合的發酵TMR，研究不同秸稈替代水平對TMR發酵品質及有氧穩定性的影響，旨在篩選出品質較好的發酵TMR，為農區生產優質的發酵TMR提供技術支撐，促進畜牧業的可持續發展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

如表1所示，TMR由水稻秸稈、全株四棱豆、玉米秸稈和精料構成。四棱豆處于結莢期，水稻秸稈和玉米秸稈分別為水稻和玉米去除籽實后的秸稈，精料由玉米粉、豆粕、菜粕、棉粕、酒糟蛋白飼料(distillers dried grains with solubles, DDGS)、麥麩、預混料和食鹽以適當的比例混合而成，玉米粉、豆粕、菜粕、棉粕、麥麩、DDGS從飼料市場采購。

表1 TMR原材料營養成分Table 1 Chemical composition of original material of TMR

注:FW: fresh weight，鮮重; DM:dry matter，干重；精料：質量分數30%玉米粉，4%豆粕，12%菜粕，8%棉粕，15%DDGS，20%麥麩，9%預混料，2%食鹽(DM)。

1.2 實驗設計

秸稈按照設定比例逐步替代全株四棱豆，與精料調配成發酵TMR，其中秸稈所占TMR的質量分數依次為10%(A)、20%(B)、30%(C)、40%(D)，如表2所示。對每個處理進行營養特性、發酵品質及有氧穩定性的研究，共4個處理，每個處理設置3個重復。發酵35 d后打開青貯袋，分別在第0、3、6、9、12、15天測定有氧穩定性，并測定相應指標變化。

表2 TMR的組成 單位：%DM(質量分數)

1.3 發酵TMR調制

將水稻秸稈、玉米秸稈和全株四棱豆用鍘刀切割至1～2 cm，并按照設定的配方配比混合均勻，裝入8 kg TMR于青貯袋中，同一個處理5個重復，抽真空發酵。

1.4 樣品預處理

在預定的青貯發酵天數打開青貯袋，取出發酵TMR并混勻，樣品分為3份，一份用于浸提，得到的浸提液置于-20 ℃冰柜中保存待測；一份樣品烘干粉碎保存待測；一份用于微生物計數。

1.5 感官評分

青貯飼料的發酵品質評定選用V-Score[15]評價體系，以青貯飼料中所含的氨態氮/總氮(NH3-N/TN)和揮發性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量來評定發酵品質的優劣，并將各項得分相加獲得最終評價分數，根據這個評價體系，將青貯飼料品質分為滿分(100分)、良好(>80分)、中(60～80分)、差(<60分)4個等級，具體評分標準見表3。

表3 青貯飼料V-Score評分體系Table 3 V-Score evaluation for silage

注：NH3-N:氨態氮；TN:總氮。下同。

1.6 測定指標及方法

干物質采用65 ℃，48 h干燥法測定[16]；pH值用雷諾精密pH計測定；乳酸和揮發性脂肪酸采用GC-2014氣相色譜儀測定；粗蛋白采用凱氏定氮法測定[17]；氨態氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[18]；水溶性碳水化合物含量采用硫酸-蒽酮比色法測定[18]；粗脂肪含量采用殘余法測定[16]；粗灰分采用灼燒法測定[16]；乳酸菌采用瓊脂培養基培養、好氧性細菌采用營養瓊脂培養基培養、酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養，乳酸菌在37 ℃厭氧條件下培養2～3 d；好氧性細菌和酵母菌用生化培養箱37 ℃分別培養1～3 d，計數。

1.7 有氧穩定性測定

青貯35 d后，進行有氧穩定性測定，青貯袋打開后，放置于25 ℃恒溫室內，用ZDR溫濕度記錄儀測定青貯飼料中心處溫度，利用熱點偶原理，每30 min自動記錄青貯飼料中心處的溫度[19]，同時相應的取樣測定青貯飼料的pH值，乳酸碳水化合物、乙酸、丙酸、丁酸含量及微生物數量的變化。

1.8 數據處理方法

試驗數據先用Excel軟件處理，再用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 TMR營養及微生物成分

如表1所示，水稻秸稈及玉米秸稈的粗蛋白及水溶性碳水化合物含量都較低，粗灰分含量較高，四棱豆的粗蛋白含量較高。發酵前不同TMR組的營養及微生物成分如表4所示，隨著秸稈替代水平的增加，發酵TMR的干物質和粗蛋白含量呈下降的趨勢，水溶性碳水化合物含量則顯著(P<0.05)降低。各組粗脂肪和粗灰分含量無顯著性差異。各組乳酸菌(>4.0 lg CFU/g FW)和好氧性細菌數量無顯著性差異，C組的酵母菌數量顯著(P<0.05)高于A組和B組，其他3組酵母菌數量沒有顯著性(P>0.05)差異。

表4 TMR的營養和微生物成分Table 4 The chemical and microorganism composition of TMR

2.2 TMR的發酵品質

各組TMR的V-Score評分結果如圖1所示，C和D組的品質得分顯著(P<0.05)高于A組，B組與其他3組間品質得分無顯著性差異(P>0.05)。由表5可知，發酵35 d以后，C和D組的pH值顯著(P<0.05)低于B和A組，相應的C和D組的乳酸含量顯著(P<0.05)高于B和A組。4組的乙酸、丙酸和丁酸含量都較低，A組的氨態氮/總氮顯著(P<0.05)高于各替代組，B和D組氨態氮/總氮顯著(P<0.05)低于C組，D組的水溶性碳水化合物含量最高，顯著(P<0.05)高于B和C組。

圖1 不同處理對TMR發酵品質得分的影響Fig 1 Effects of different treatment on the fermentation quality score of TMR

表5 青貯35 d后TMR發酵品質Table 5 The fermentation quality of TMR after 35 days of fermentation

注：不同小寫字母表示不同處理組間的差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 有氧暴露階段發酵TMR pH值、乳酸、水溶性碳水化合物、乙酸、丙酸和丁酸含量的變化

不同替代比例的TMR有氧穩定性如圖2所示。D組的有氧穩定性顯著(P<0.05)高于A和C組，與B組無顯著(P>0.05)性差異，達到360 h，A組有氧穩定性最低。

圖2 青貯35 d后不同處理對TMR有氧穩定性的影響Fig 2 Effect of different treatment on the aerobic stability of TMR after 35 d of ensiling

如表6所示，B和D組pH值在整個有氧暴露過程中沒有明顯的變化，A組和C組的pH值在有氧暴露第9天顯著(P<0.05)上升，顯著(P<0.05)高于B和D組。在TMR發酵產酸方面，A、C和D組乳酸含量在有氧暴露第15天顯著(P<0.05)下降到最低值，B組乳酸含量呈下降的趨勢(P>0.05)，有氧暴露9 d后，A組的乳酸含量在整個有氧暴露階段均低于其他各組。A和C組水溶性碳水化合物含量在有氧暴露第9天均顯著(P<0.05)下降，D組在第12天顯著(P<0.05)下降，B組呈下降(P>0.05)的趨勢，D組水溶性碳水化合物含量在整個有氧暴露階段均高于其他3組。各組間乙酸含量都呈先下降后上升的變化趨勢，其中A組乙酸產量最少，在有氧暴露第9 d后B組乙酸含量顯著(P<0.05)高于其他3組；只有D組的丙酸含量呈先上升后下降的趨勢，其他組均為下降的變化趨勢；A組和B組丁酸含量在整個有氧暴露過程中無顯著性變化(P>0.05)，D組丁酸含量在有氧暴露第15天顯著(P<0.05)上升，并顯著(P<0.05)高于其他3組。

表6 有氧暴露階段發酵TMR pH值、乳酸、水溶性碳水化合物、乙酸、丙酸及丁酸含量的變化Table 6 Changes of pH value, lactic acid, water soluble carbohydrate, acetic acid, propionic acid, butyric acid contents in TMR during aerobic exposure stage

注：不同大寫字母表示相同有氧暴露時間不同處理組間的差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4 有氧暴露階段發酵TMR微生物數量的變化

如表7所示，各組的好氧性微生物數量隨著有氧暴露時間的增加均呈上升的變化趨勢，在有氧暴露第15天各組好氧性微生物數量最高，其中C組好氧性微生物數量在有氧暴露第0天顯著(P<0.05)低于A組，D組在有氧暴露第12天顯著(P<0.05)高于其他3組。各組酵母菌的數量隨著有氧暴露天數的延長均呈先上升后下降的趨勢，其中B組在有氧暴露第0天及第12天分別顯著(P<0.05)低于C組及A組。在剛拆袋(0 d)打破厭氧環境時，各組乳酸菌數量均處于較高水平(>6 lg CFU/g)。除D組呈先上升再下降的趨勢外，其他3組乳酸菌數量隨著有氧暴露天數的延長一直下降。

3 討論

青貯是指水溶性碳水化合物被乳酸菌利用，代謝產生有機酸(主要是乳酸)降低pH值，從而抑制有害微生物活性使飼料能夠長期貯藏[20]。因此，pH成為判斷青貯后青貯飼料品質優劣的重要指標，水溶性碳水化合物含量及乳酸菌數量成為影響青貯品質的重要因素。一般認為，青貯原料的乳酸菌數量達到5 lg CFU/g FW，水溶性碳水化合物含量超過25～35 g/kg DM，才能獲得優質青貯飼料[21]。許能祥等[22]通過添加米糠以補充稻草中可溶性碳水化合物的不足，增加發酵底物，獲得品質較好的混合青貯飼料。本試驗各組TMR原料水溶性化合物含量均在45 g/kg DM以上，乳酸菌數量均接近5 lg CFU/g FW，各組TMR發酵品質均屬良好，也可以從較低的pH、丁酸和氨態氮的含量得以體現，丁酸和氨態氮濃度的高低直接反應青貯過程中腐敗菌的活動情況[23]，一般認為優質青貯飼料的丁酸含量和氨態氮含量應低于10 g/kg DM和100 g/kg TN[24]，本試驗中，各組TMR氨態氮和丁酸含量都較低，表明整個青貯過程沒有發生腐敗尤其是蛋白質的大量分解[24]，這可能與水溶性碳水化合物充足，乳酸菌數量較高，整個青貯過程快速進入乳酸發酵期，乳酸增多，pH值降低，有害微生物活性被抑制，從而保證了青貯質量。開袋后各組TMR的pH值都要高于4.2，這可能與青貯的材料的干物質含量較高有關，原現軍等[25]的研究表明青貯飼料干物質含量較高時，pH值在4.5左右，也能使飼料良好保存。

表7 有氧暴露階段發酵TMR微生物數量變化Table 7 Changes in microbial biomass of TMR during aerobic exposure stage

有氧暴露后，厭氧環境被打破，好養性微生物和酵母菌大量繁殖，水溶性碳水化合物和乳酸被分解成有機酸，且釋放熱量導致飼料內部溫度上升，從而加快腐敗的速度，本試驗各組TMR水溶性碳水化合物及乳酸在整個有氧暴露階段均呈下降的趨勢，其中，10%和30%替代組下降的幅度較大。TMR開袋后，直接接觸空氣，pH值的變化可以直觀地反映其腐敗速度和程度，pH值較低，蛋白質降解可以被有效地抑制[26]。10%和30%替代組的pH值在有氧暴露9 d后，分別顯著上升至5.82和4.83，20%和40%替代組pH值在整個有氧暴露過程中沒有明顯的變化。大量研究表明酵母菌是引起青貯飼料有氧腐敗的主要微生物，HAO等[27]研究發現，Zygosaccharomycesbailii數量的增加會引起TMR在有氧暴露期間有氧變質，CARVAIHO等[28]研究表明，Candida、Schizosaccharomycespombe和Zygosaccharomycesbailii，是降低青貯飼料有氧穩定性的主要微生物。本試驗10%替代組的酵母菌數量在有氧暴露第12天顯著上升，這表明10%替代組和30%替代組在有氧暴露第9天開始腐敗，這可能與20%和40%替代組的乙酸含量較高有關，乙酸是一種主要揮發性脂肪酸，含量多少反映醋酸菌的活動情況，乙酸含量是預測發酵TMR有氧穩定優劣的重要指標，乙酸的解離程度低，會以被動運輸的形式進入微生物細胞內，降低其胞內pH值，破壞細胞的酸堿平衡，從而殺死細胞，抑制酵母、好養性微生物的生長繁殖[29]。邱小燕等[30]在研究糖蜜和乙酸對發酵TMR品質及有氧穩定性影響時表明乙酸濃度越高，有氧腐敗的時間會相應的延長。SCHMIDT等[29]的研究亦表明，乙酸含量越高，青貯飼料有氧腐敗的時間相應延長。

4 結論

綜上所述，30%和40%替代組發酵35 d后顯示良好的發酵品質，pH值較低(4.2左右)，乳酸含量較高，氨態氮/總氮值低于對照組，但30%替代組的有氧穩定性較低，而40%的有氧穩定性較高，同時從秸稈最大化利用角度出發，用40%的秸稈替代發酵TMR中四棱豆最為適宜。本研究中發酵TMR的有氧穩定性并沒有隨著秸稈替代比例的升高而降低，40%替代組仍保持了較高的有氧穩定性的機理還有待進一步研究。