不同發酵方式下枸杞飲料主要成分及其抗氧化活性

李佩佩，頡向紅，王聰，李冬冬，劉軍，王麗萍，張喜康，馬露，劉敦華

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川，750021)

紅茶菌又稱胃寶，由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌組合而成，原料經發酵，產生蛋白質、維生素、微量元素和茶多酚等營養物質，有降血脂和保肝等保健功能[1]。紅茶菌生長因茶類如紅茶、綠茶茶湯的不同受影響，以發酵液的pH和還原糖含量等指標評估其生長狀況[2]。國內外研究發現大多數乳酸菌和酵母菌混合發酵使產品風味成分更復雜，呈現豐富的口感[3]。但結合乳酸菌和酵母菌制備發酵飲料時，不同的發酵方式是否影響發酵飲料品質的研究，目前還未見報道。本文以pH值和菌膜質量為指標來探討紅茶、綠茶兩種茶湯對紅茶菌生長情況的影響；測定紅茶菌中分離出的酵母菌的生長曲線；采用乳酸菌和酵母菌制備發酵枸杞飲料，比較2種不同發酵方式過程中枸杞飲料的主要成分和抗氧化活性的變化，進而運用SPSS軟件進行抗氧化活性與主要成分的相關性分析，建立回歸模型[4]，旨在為枸杞發酵飲料的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枸杞，市售；紅茶菌，寧夏大學農學院培養；YPD培養基，山東浩中化工科技有限公司；WL培養基，上海信裕生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，北京索萊寶科技有限公司；2,2′-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，上海化成工業發展有限公司；D-酒石酸等標準品，北京索萊寶科技有限公司；甲醇(色譜純)和硝酸鋁等分析純，銀川偉博鑫生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

U3000HPLC色譜儀，ThermoFisher公司；6890-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司； DSX-280B滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；LRH培養箱，廣州航信科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

將大小顏色均一的枸杞在65 ℃浸泡30 min。打漿后加果膠酶和纖維素酶酶解，酶解液經殺菌后冷卻，一組先接種2.5%乳酸菌(嗜熱乳桿菌∶植物乳桿菌∶鼠李乳糖桿菌質量比為1∶2∶1，下同)，在30 ℃下發酵40 h，再接種酵母菌二次發酵；另一組同時接種2.5%乳酸菌和酵母菌在30 ℃發酵40 h。發酵好的枸杞飲料裝罐滅菌。

1.3.2 紅茶湯、綠茶湯對紅茶菌生長的影響

紅茶菌培養液：參考左勇等[5]的方法。

培養紅茶菌：

紅茶/綠茶→浸泡15 min→過濾→冷卻→接菌→發酵(紗布封住容器，30 ℃培養)

紅茶菌菌液pH值和菌膜質量測定：每隔2 d測紅茶和綠茶培養的紅茶菌的pH值和菌膜質量，以探討2種茶湯對紅茶菌生長的影響。

1.3.3 粗分離非釀酒酵母并測定生長曲線

(1) 非釀酒酵母的粗分離

參考分離紅茶菌的文獻[6]和GB 4789.2-2010，符合要求的活菌接到YPD培養液培養，初步粗分離得酵母菌。

用WL培養基對粗分離酵母菌復篩，根據非釀酒酵母能把賴氨酸作為氮源的特性再次篩選，能在含賴氨酸的培養基上生長的為非釀酒酵母[7]。

(2) 測定非釀酒酵母生長曲線

接種1.5%活化菌于YPD培養液，28 ℃恒溫培養，新鮮培養基作對照，每隔2 h測OD600值。

1.3.4 乳酸菌和酵母菌單獨發酵時枸杞飲料有機酸的測定

色譜條件[8]：HypersilC18色譜柱(250 mm×4.6 nm×5 μm)，流動相：0.01 mol/LV(KH2PO4)∶V(甲醇)=98∶2，緩沖溶液(pH 2.8)過0.45 μm水系濾膜，流速：1.0 mL/min，進樣量：10 μL，檢測波長：210 nm，柱溫為室溫。

標準溶液：檸檬酸、D-酒石酸、L-蘋果酸標準品用流動相溶解至2.0 g/L。

試樣：流動相將2 mL枸杞飲料定容至10 mL容量瓶，取2 mL經0.45 μm微孔濾膜過濾到進樣瓶，避光4 ℃保存。

1.3.5 總酚和黃酮含量的測定

參考KOLEY等[9]的方法，采用比色法測定。總酚標準曲線方程：y=0.096 5x+0.022 9(R2=0.999 1)，黃酮標準曲線方程：y=0.008x-0.002 1(R2=0.999 7)。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除率

根據BOLLING等[10]的方法作修改，甲醇稀釋枸杞飲料，甲醇配0.04 mg DPPH/mL的溶液，在517 nm測處吸光度。DPPH自由基清除率按公式(1)計算：

(1)

式中：A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度。

(2)ABTS自由基清除率

(2)

式中：A0為空白組吸光度，A1為樣品吸光度。

(3)羥自由基清除率

根據YANG等[12]的方法。羥自由基清除率按公式(3)計算：

(3)

式中：Ax為試樣吸光度，A0為空白對照樣品吸光度，Ax0為水替代 H2O2的本底吸光度。

(4)超氧自由基清除率

根據蘭永麗等[13]的方法作修改。取1 mL試樣和0.4 mL鄰苯三酚(25 mmol/L),反應25 min加1 mL 8 mmol/L的HCl，在299 nm處測的吸光值，空白為蒸餾水。超氧自由基清除率按公式(4)計算：

(4)

式中：Ax為試樣吸光度，A0為空白對照樣品吸光度，Ax0為水替代鄰苯三酚的本底吸光度。

1.3.7 測定揮發性物質

采用頂空-固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用技術。萃取條件：萃取頭插入含3 mL試樣的萃取瓶，推出100 μm PDMS萃取頭。50 ℃水浴20 min，萃取15 min。再插入進樣器250 ℃解吸5 min。GC和MS條件：參照林曉姿等[14]的方法。定性分析用NIST 11譜庫檢索結合人工譜圖解析確定化合物；定量分析參照束文秀等[15]方法用峰面積歸一化法。

1.3.8 數據處理

Origin 9.0繪圖、Excel 2016統計數據并繪表、SPSS 20.0分析顯著性和相關性并作多模型曲線擬合圖。

2 結果與分析

2.1 紅茶菌的培養情況

如圖1所示，培養紅茶菌的紅茶和綠茶中pH都趨于快速下降且變化趨勢在整個過程基本一致，說明兩種茶中有機酸的積累速度和含量基本相同。綠茶中菌膜生成量明顯大于紅茶，可能因為綠茶沒經過發酵，保留了茶葉的營養物質如茶多酚、碳水化合物、氨基酸、維生素和脂多糖等，能促進醋酸菌生長繁殖，利于形成菌膜[16]。綜合pH值和菌膜量2個參數，采用綠茶湯培養紅茶菌。

圖1 對紅茶菌發酵液菌膜生成量和發酵pH值的影響Fig.1 Effects of fermentation liquid of tea fungus on the production of membrane and fermentation pH

2.2 非釀酒酵母生長曲線的測定結果

如圖2所示，非釀酒酵母在10～18 h進入對數期，20 h后進入穩定期。區別于釀酒酵母，非釀酒酵母在發酵時產生酯酶、糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶和纖維素酶等。這些酶與特定底物結合，酶解未加工汁液中的大分子物質(果膠、纖維素、蛋白質、半纖維素和木質素等)，促進汁液的澄清，有利于發酵過程中風味物質的釋放，改善飲料的口感、風味和香氣[17]。

圖2 酵母菌生長曲線Fig.2 Yeast growth curve

2.3 乳酸菌和酵母菌單獨發酵枸杞飲料時產物含量對比

與未發酵的枸杞飲料進行對比，經乳酸菌、酵母菌發酵后飲料的有機酸、總酸含量都顯著提高，pH值降低，還原糖含量減少。對比乳酸菌和酵母菌單獨發酵液，發現檸檬酸和總酸含量在乳酸菌發酵液中明顯多于酵母菌發酵液，而酵母菌發酵后D-酒石酸和L-蘋果酸含量明顯更多。總體顯示乳酸菌產酸能力更強(表1、表2和圖3)。

表1 有機酸標準曲線方程Table 1 Standard curve equation for organic acids

注：x表示有機酸,mg/g，y表示峰面積。

表2 枸杞飲料中乳酸菌和酵母菌發酵后產物含量Table 2 Content of lactic acid bacteria and yeast fermented products in Lycium barbarum beverage

注:數據為平均數±標準差。表中*代表差異顯著(P<0.05)；**代表差異極顯著(P<0.01)。下同。

圖3 乳酸菌和酵母菌發酵后有機酸的含量Fig.3 Organic acid content after fermentation of lactic acid bacteria and yeast

2.4 不同發酵方式對枸杞飲料的主要成分和抗氧化活性變化分析

2.4.1 枸杞飲料發酵過程中pH值和還原糖的變化

pH是發酵過程影響風味的重要參數，其變化可能是發酵時有機酸濃度增加所致[18]。由圖4可知，pH值在0～84 h總體呈下降趨勢，0～36 h下降較快，36 h 后趨于平緩。這與MENEZES等[19]研究的益生菌酵母和乳酸菌組合起始培養物生產玉米飲料的pH有相似的變化趨勢。2種不同發酵方式下枸杞飲料還原糖含量都顯著性降低，但先乳酸菌發酵再酵母發酵還原糖含量下降更顯著。

1LAB,2SB-先乳酸菌發酵，再酵母發酵；LAB+SB-乳酸菌和酵母菌同時發酵圖4 發酵枸杞飲料過程中pH值和還原糖的變化Fig.4 Changes of pH and reducing sugar during fermentationof lycium barbarum juice注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，反之不顯著。下同。

2.4.2 枸杞飲料發酵過程中總酚和總黃酮的變化

酚類影響枸杞飲料的色澤和香味，在抗氧化功能中也發揮重要作用[20]。由圖5可知，2種發酵方式下枸杞飲料的總酚和總黃酮含量在0～84 h均呈升高趨勢，且先乳酸菌發酵再酵母菌發酵枸杞飲料的總酚和總黃酮含量均高于混合發酵。未發酵時，可溶性結合酚羥基與長鏈醇類結合，Folin-酚法不能與其反應，故總酚含量整體偏低；而發酵后，微生物將可溶性結合酚分解成小分子酚釋放出來，故發酵后總酚含量增加[21]。發酵過程中黃酮會隨發酵周期的增加被溶解，含量顯著增加[22]。

圖5 枸杞飲料發酵過程中總酚和總黃酮的變化Fig.5 Changes of total phenols and total flavonoids during the fermentation of lycium barbarum beverage

2.4.3 不同發酵方式過程中枸杞飲料抗氧化活性變化

用4種抗氧化方法評價不同發酵方式下枸杞飲料的抗氧化活性。總酚和總黃酮決定DPPH自由基清除率的變化[23]。在2種發酵方式下枸杞飲料DPPH自由基清除率變化趨勢相反，相對于混合發酵時DPPH清除率先增加后減少，先乳酸菌發酵再酵母菌發酵時始終增加；ABTS自由基清除率均有所增加，但先乳酸菌發酵再酵母菌發酵時增加更顯著，增加了26.663%；超氧自由基清除率均降低，羥自由基清除率則均顯著升高。可能由于氧化反應不能被超氧自由基阻止，反而有助于形成羥自由基[24]。又因酚類和黃酮類物質都有較強的自由基，且發酵過程生成有抗氧化性的產物，故枸杞發酵飲料的抗氧化活性總體顯著增高[25]。

表3 發酵枸杞飲料的抗氧化活性變化 單位：%

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 主要成分與抗氧化活性的相關性分析

2.5.1 Pearson相關性分析

依據2.4結果，選擇先乳酸菌發酵、再酵母菌發酵的方式制備枸杞飲料，測定其主要成分與抗氧化活性，并分析相關性。

由表4可知，總酚與DPPH自由基清除率(r=0.918，P<0.01)、ABTS自由基清除率(r=0.79，P<0.05)、羥自由基清除率(r=0.925，P<0.01)呈顯著性正相關，與超氧自由基清除率(r=-0.931，P<0.01)呈顯著性負相關。總黃酮與DPPH自由基清除率(r=0.896，P<0.01)、羥自由基清除率(r=0.851，P<0.01)呈顯著性正相關，與超氧自由基清除率(r=-0.862，P<0.01)呈顯著性負相關。與任紅等[26]關于黃酮抗氧化性和CHAILLOU等[27]關于多酚抗氧化性的研究結論相似，本研究發現總黃酮、總酚對發酵枸杞飲料抗氧化活性起決定性作用，但在不同抗氧化體系中它們的影響程度不完全一致。由相關系數得枸杞飲料中不僅黃酮和多酚有抗氧化性，其他如類胡蘿卜素、活性多糖等也有抗氧化能力。這與YANG等[28]關于枸杞汁抗氧化活性還與其他成分如還原糖等有關的研究結論相似。

表4 主要成分與抗氧化活性的Pearson相關性分析結果Table 4 Pearson correlation analysis of main components and antioxidant activity

注：**表示P<0.01，呈顯著性相關。下同。

2.5.2 回歸模型分析

由2.5.1的分析結果，對和抗氧化活性相關系數最大的成分進行多模型曲線擬合，建立回歸方程，見表5和圖6-a～圖6-d。由表5可知，DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、超氧自由基清除率的二次項曲線決定系數R2最高，建立回歸方程分別為：y=38.220-2.257x+2.355x2(y-DPPH自由基清除率)、y=-428.218+258.236x-32.166x2(y-ABTS自由基清除率)、y=195.193-60.371x+6.602x2(y-超氧自由基清除率)，x均表示總酚含量,mg/L。

羥自由基清除率的對數曲線決定系數R2最高，建立回歸方程：y=43.657+26.868lnx(x-總酚含量，mg/L;y-羥自由基清除率)。

表5 抗氧化活性試驗的多模型擬合結果Table 5 Multi-model fitting result of antioxidant activity test

a-DPPH自由基；b-ABTS自由基；c-羥自由基；d-超氧自由基圖6 自由基清除率與總酚的曲線擬合圖Fig.6 Curve fitting of free radical scavenging rate and total phenol

2.5.3 揮發性成分的分析

發酵過程產生的次生代謝產物影響飲料的香氣，其中揮發性物質決定飲料的品質[29]。由表6和圖7可知，發酵后揮發性物質有顯著變化，先乳酸菌發酵再酵母菌發酵枸杞飲料產生的揮發性物質種類最多，包括醇類6種、烷烴類7種、酯類8種。

如圖8所示，發酵枸杞飲料生成的主要風味物質是醇類、烷烴類、酯類。枸杞汁含少量醇類，發酵是產生醇類的主要來源，醇類均有香氣，如3-辛烯-1-醇散發藥草味，類似薰衣草的味道[30]。酯類主要由醇和酸的縮合反應和微生物代謝產生，其中甲酸辛酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯產生果香和酒香，可增加飲料的香氣[31-32]。一些酮類化合物包括有豆香和果香的2,3-二氫香豆酮等可通過發酵、熏焙過程、脂質降解和氧化產生，賦予飲料花香、果香的香氣[33]。

a-未發酵;b-LAB+SB;c-LAB,2SB圖7 揮發性成分的總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagram of volatile components

3 結論

對比紅茶和綠茶中紅茶菌的菌膜質量和pH，發現綠茶更有利于紅茶菌生長。從紅茶菌中分離酵母菌，接種酵母菌和乳酸菌單獨發酵枸杞飲料，結果顯示，乳酸菌單獨發酵枸杞飲料時檸檬酸和總酸含量較高，而酵母菌發酵枸杞飲料D-酒石酸和L-蘋果酸含量更高。

枸杞汁為原料，接種2.5%乳酸菌和酵母菌(紅茶菌中分離出的)，采用混合發酵和先乳酸發酵再酵母發酵2種不同發酵方式在30 ℃制備發酵枸杞飲料。結果顯示，2種不同發酵方式下枸杞飲料的pH、還原糖、總黃酮、總酚含量和抗氧化活性的變化趨勢基本一致。與乳酸菌和酵母菌混合發酵相比，先乳酸菌發酵后再酵母菌發酵枸杞飲料的總黃酮、總酚含量較高，抗氧化活性更強；且生成6種醇類、7種烷烴類和8種酯類的揮發性風味物質。相關性分析表明，先乳酸菌發酵后再酵母菌發酵枸杞飲料的總酚和總黃酮含量與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、羥自由基清除率均呈顯著性正相關，與超氧自由基清除率呈顯著性負相關。

表6 揮發性物質分析 單位：%(相對含量)

續表6

種類名稱未發酵LAB+SBLAB,2SB酯類(9種)辛酸乙酯-2.2022.96癸酸乙酯-3.664.87乙酸異戊酯--1.542,2,4-三甲基-1,3-戊二醇單異丁酸酯-10.426.53十二酸乙酯-1.65-己酸乙酯--2.37甲酸辛酯--1.52乙酸2-苯乙酯--1.26十三烷酸乙酯--6.99

注：“-”表示未檢出物質。

a-相對含量;b-種類圖8 揮發性物質種類及相對含量Fig.8 Types and relative content of volatile substances