產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)初步研究

陳成，寧喜斌,2,3,4*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)4(國(guó)家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海)，上海，201306)

《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)β-內(nèi)酰胺酶定義為：能裂解青霉素和頭孢菌素類(lèi)抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使其滅活的水解酶稱(chēng)為β-內(nèi)酰胺酶[1]。1929年β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素——青霉素的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)里程碑，它在20世紀(jì)40年代被廣泛使用，徹底改變了人們治療細(xì)菌感染的能力，但也極大地刺激了細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的能力[2]。隨著核苷酸序列信息的增多，已鑒定的β-內(nèi)酰胺酶的數(shù)量已接近指數(shù)增長(zhǎng)，β-內(nèi)酰胺酶數(shù)據(jù)庫(kù)含有超過(guò)4 300種經(jīng)過(guò)不同程度表征的酶[3-4]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的研究主要針對(duì)醫(yī)學(xué)方面，即應(yīng)用抗生素產(chǎn)生的耐藥性，臨床耐藥菌株的分離、表型篩選及基因的分析，新型β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究等方面，在β-內(nèi)酰胺酶的分離純化、酶學(xué)特性、毒理學(xué)危害，產(chǎn)酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化，以及β-內(nèi)酰胺酶應(yīng)用方面的研究報(bào)道還是很少[5-8]。β-內(nèi)酰胺酶因其具有水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中β-內(nèi)酰胺環(huán)的特點(diǎn)不僅應(yīng)用在醫(yī)療器械、環(huán)境中抗生素的消除，前藥的開(kāi)發(fā)與抗體定向酶前藥治療領(lǐng)域，也可與生物傳感器、ELISA檢測(cè)等結(jié)合運(yùn)用檢測(cè)乳及乳制品中殘留的抗生素[9-11]。在食品安全的檢測(cè)中，抗生素殘留是國(guó)內(nèi)外極為重視的內(nèi)容，特別是牛乳及乳制品，歐洲每個(gè)成員國(guó)都實(shí)施了國(guó)家監(jiān)測(cè)和控制計(jì)劃，以監(jiān)測(cè)食品中的抗生素殘留[12-13]。

本研究從上海臨港地區(qū)分離、篩選產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株，對(duì)其中1株酶活力較高的菌株運(yùn)用分子生物學(xué)方法和生理生化試驗(yàn)鑒定其種屬，并進(jìn)一步研究酶學(xué)性質(zhì)，以期為進(jìn)一步工業(yè)化開(kāi)發(fā)利用性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株提供借鑒，為工業(yè)生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶及其應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來(lái)源

2018年8～10月于上海市第六人民醫(yī)院東院(臨港地區(qū))采集樣品，用無(wú)菌采樣器采集水面下30～100 cm的水樣品及3～10 cm深的土壤樣品(三點(diǎn)采樣法)，樣品采集后2 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室處理分析。

1.1.2 試劑

青霉素G鈉(USP級(jí) 1 603 u/mg)，上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、PCR擴(kuò)增試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O及其他實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離純化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，牛肉粉 3，NaCl 5，瓊脂 15，調(diào)pH 7.2～7.4。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 10，酵母浸粉 5，NaCl 5，調(diào)pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 5，酵母浸粉 10，NaCl 2，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 4，調(diào)pH 7.5。

1.2 儀器與設(shè)備

AC2-S超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司；GHP-9 270隔水式恒溫培養(yǎng)箱、THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HWT-20C恒溫水浴箱，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；DGG-9 203AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；pH730臺(tái)式pH精密測(cè)試儀，德國(guó)WTW；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；AL204精密電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；CX41RF顯微鏡，東京奧林匹斯公司；PTC-200 PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的初步篩選

取土樣10 g或水樣10 mL加入到90 mL含有玻璃珠的無(wú)菌水中，振搖10 min使樣品充分分散。吸取1 mL接種到裝有99 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃，160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h。取0.2 mL(500單位)青霉素于培養(yǎng)皿中，將適當(dāng)稀釋后的培養(yǎng)液吸取0.1 mL接入含有青霉素的培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至50 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。篩選平板上的單菌落菌株，經(jīng)過(guò)3～5次平板劃線(xiàn)純化，最后將得到的單菌落菌株轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基并編號(hào)于4 ℃保藏，即為所需的抗青霉素菌株。

1.3.2 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株的鑒定(碘量法)

取新鮮配制濃度為6 000 μg/mL的青霉素0.1 mL 于一小試管中，加入培養(yǎng)18～24 h的菌液制成濃厚菌懸液(109CFU/mL)于37 ℃恒溫水浴中放置30 min，不時(shí)搖動(dòng)。再加入新鮮配制的10 g/L可溶性淀粉溶液500 μL，搖勻。再加入碘液20 μL并在37 ℃恒溫水浴中放置10 min，不斷搖晃，在10 min內(nèi)能使藍(lán)色完全消退的菌株即為β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，不消退者為陰性[14]。

1.3.3 β-內(nèi)酰胺酶活力測(cè)定方法

β-內(nèi)酰胺酶活力測(cè)定：參考《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年第四版)；1個(gè)酶活力單位定義為：在37 ℃條件下，1 mL發(fā)酵酶液每小時(shí)分解青霉素活性單位的量，用U表示[1]。

粗酶液制備：發(fā)酵液經(jīng)高速離心機(jī)以9 000 r/min離心10 min，所得上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，其過(guò)濾液即為無(wú)菌粗酶液。酶活測(cè)定如公式(1)所示：

E=(B-A)×M×F×D×100

(1)

式中：E，青霉素酶活力，單位U/(mL·h)；B，空白滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量(mL)；A，樣品滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量(mL)；M，硫代硫酸鈉滴定液的濃度(mol/L)；F，相同條件下，每1 mL的硫代硫酸鈉滴定液(0.01 mol/L)，相當(dāng)于青霉素的單位數(shù)，其值為742；D，青霉素酶稀釋的倍數(shù)。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將活化后的菌種經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取適量稀釋液涂布到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。

1.4.2 生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)(第九版)》[15]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]對(duì)所篩出的菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

根據(jù)細(xì)菌總DNA提取試劑盒說(shuō)明提取目標(biāo)菌株的DNA，采用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′)進(jìn)行PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果登入NCBI(national center for biotechnology information)進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲取16S rRNA基因序列同源性較高的相關(guān)菌株并在GenBank庫(kù)中下載其模式菌株，用MEGA-X軟件中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)[17]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)其分析鑒定。將菌株B03鑒定的16S rRNA基因的部分序列通過(guò)Bankit向GenBank申請(qǐng)登錄號(hào)(GenBank accession)。

1.5 酶學(xué)性質(zhì)初步研究

1.5.1 酶最適作用溫度及熱穩(wěn)定性影響

酶最適作用溫度：用配制好的pH 7.0的PBS緩沖液稀釋粗酶液及配制青霉素鈉溶液，設(shè)定20、30、40、50、60、70、80 ℃，7個(gè)溫度梯度。按照1.3.3酶活力測(cè)定方法測(cè)定上述不同溫度下β-內(nèi)酰胺酶活力，以酶活力最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定酶最適作用溫度。

酶的熱穩(wěn)定性：取適量無(wú)菌粗酶液分裝于EP管中，分別在4、20、40、50、70 ℃，5個(gè)溫度條件下保溫2～5 d，分別定點(diǎn)取樣進(jìn)行酶活力測(cè)定，以未保溫處理的酶活值為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.5.2 酶最適作用pH及pH穩(wěn)定性影響

酶最適作用pH值：分別配制50 mmol/L pH 3.0～5.0 的檸檬酸鹽緩沖液、pH 6.0～7.5的PBS緩沖液、pH 8.0～9.0的Tris-HCl緩沖液，并用不同pH值的緩沖液稀釋粗酶液及配制青霉素鈉溶液，于最適溫度下處理30 min，按照1.3.3酶活力測(cè)定方法測(cè)定上述不同pH下β-內(nèi)酰胺酶活力，以酶活力最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定酶最適作用pH。

酶的pH穩(wěn)定性：將用不同pH值(3.0～9.0)的緩沖液稀釋的粗酶液于最適溫度下處理1、2 h，按照1.3.3酶活力測(cè)定方法分別測(cè)定不同pH下β-內(nèi)酰胺酶活力，以酶活力最高者為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定性。

1.5.3 金屬離子對(duì)酶活力的影響

配制濃度50 mmol/L的不同金屬離子(K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+)溶液，分別取適量與粗酶液混勻，于最適反應(yīng)條件下處理30 min，按照1.3.3酶活力測(cè)定方法測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶活力，以未添加金屬離子的酶液為對(duì)照組，定義酶活力為100%，計(jì)算不同金屬離子影響下的相對(duì)酶活力。

1.5.4 β-內(nèi)酰胺酶酶液保存穩(wěn)定性研究

分別配置質(zhì)量濃度為20、50、100 g/L的NaCl溶液和50、100、150 g/L的甘油，與適量的粗酶液1∶1(體積比)混勻經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除菌后分裝于EP管中，另以不加輔料的無(wú)菌粗酶液為對(duì)照，一同放置于4 ℃冰箱中保存，每隔5 d取樣測(cè)1次酶活力，以未進(jìn)行保溫處理的酶液為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

將富集后的菌液稀釋混合傾注于添加適當(dāng)單位濃度抗生素的平板上培養(yǎng)18～24 h，通過(guò)抗生素平板篩選得到60株單菌落菌株，再通過(guò)碘量法鑒定所篩選得到的菌株，在10 min內(nèi)能使藍(lán)色完全消退的菌株得到8株，即為β-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性。將酶活較高的菌株B03(見(jiàn)表1)作為目標(biāo)菌株，做進(jìn)一步研究。

表1 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株篩選結(jié)果Table 1 The screening results of β-lactamase producing strains

注：小寫(xiě)和大寫(xiě)字母分別表示在0.05和0.01水平下Duncan新復(fù)級(jí)差檢測(cè)結(jié)果。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌種形態(tài)觀察

菌株B03經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察結(jié)果如圖1所示。染色結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性，菌體成桿狀，以成對(duì)或鏈狀堆積排列，判定為桿菌。菌株B03形態(tài)特征見(jiàn)表2。菌株B03于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)菌落呈灰白色，不透明，表面不光滑，干燥，邊緣不整齊。

圖1 菌株B03在油鏡下的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 The cell morphology of strain B03 under oil immersion lens

2.2.2 生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株B03進(jìn)行生理生化特征鑒定。生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。菌株B03為革蘭氏陽(yáng)性菌，并且有芽孢，過(guò)氧化氫酶、V-P反應(yīng)、M.R反應(yīng)呈陽(yáng)性，可水解淀粉、明膠，但不產(chǎn)生吲哚，利用檸檬酸鹽，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，據(jù)此確定該菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表2 菌株B03的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of strain B03

注：“+”表示陽(yáng)性，“G+”表示革蘭氏陽(yáng)性。

表3 菌株B03的生理生化特征Table 3 Biochemical characteristics of strain B03

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

2.2.3 16S rRNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2所示。PCR擴(kuò)增出的條帶大小約1 500 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序得到的16S rRNA序列為1 479 bp。PCR產(chǎn)物序列通過(guò)NCBI中的BLAST程序比對(duì)后，得到Ident值97%以上的菌株近100株，說(shuō)明與此菌株序列相似的菌株較多。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載8個(gè)與菌株B03同源性較高且已定名的模式菌株的16S rRNA基因序列，進(jìn)行序列比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過(guò)MEGA-X的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(見(jiàn)圖3)[18-19]。由圖3可知，菌株B03和Bacilluscereus(AY138 275)在同一分支上，說(shuō)明兩者同為芽孢桿菌屬(Bacillus)。Bootstrap檢驗(yàn)值為99，說(shuō)明發(fā)育樹(shù)所表示的兩種菌株之間的進(jìn)化關(guān)系可信[20]。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定可確定菌株B03為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。將菌株B03的核酸序列通過(guò)Bankit向GenBank申請(qǐng)的登錄號(hào)(GenBank Accession)為MK568 460。

圖2 菌株B03的16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoresis result of 16S rRNA PCR products of strain B03

圖3 基于16S rRNA序列分析的菌株B03的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain B03 based on 16S rRNA sequence analysis注：節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字為1 000次重復(fù)的支持率；標(biāo)尺0.010所示長(zhǎng)度為1%核苷酸置換率。

2.3 菌株B03酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.3.1 酶最適作用溫度及熱穩(wěn)定性影響

溫度對(duì)B03所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶活力的影響結(jié)果如圖4-a所示，在40 ℃時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到最高，即酶的最適作用溫度為40 ℃。40～50 ℃相對(duì)酶活力皆保持在90%以上，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，酶活力急劇下降，80 ℃時(shí)僅保留最大酶活力的10%。酶活熱穩(wěn)定性如圖4-b所示，溫度70、50 ℃時(shí)，酶活力下降很快。溫度40 ℃時(shí)，保溫48 h，酶活力下降一半多。溫度20 ℃時(shí)，保溫24 h，依然有90%左右的酶活力，120 h后剩余60%以上的酶活力。4 ℃條件下，保存120 h酶活力還能剩余93%左右。所以，在4～20 ℃酶活熱穩(wěn)定性較好。

a-酶活力；b-穩(wěn)定性圖4 溫度對(duì)B03所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of temperature on the activity and stability of β-lactamase produced by B03

2.3.2 酶最適作用pH及pH穩(wěn)定性影響

由圖5-a可知，β-內(nèi)酰胺酶的最適作用pH為7.0，該酶屬于中性酶。在pH 4.0～7.5能保持較高酶活力，皆在最高酶活力的60%以上，pH低于4.0 或高于7.5以后，酶活力迅速下降。由圖5-b可知，在pH 5.0～7.5，處理2 h相對(duì)酶活力保持在50%以上，穩(wěn)定性較好。當(dāng)pH低于5.0或高于7.5時(shí)，酶活穩(wěn)定性明顯下降，pH 3.0和pH 9.0處理2 h后相對(duì)酶活力分別約為17%和28%。

a-酶活力；b-穩(wěn)定性圖5 pH對(duì)B03所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of pH on the activity and stability ofβ-lactamase produced by B03

2.3.3 金屬離子對(duì)酶活的影響

由圖6可知，Mg2+、Fe2+和Mn2+對(duì)酶有不同程度的激活作用，其中Mg2+對(duì)酶的激活作用最強(qiáng)，相對(duì)酶活約為對(duì)照組的1.3倍。Cu2+、Al3+和Fe3+對(duì)酶有不同程度的抑制作用，其中Al3+對(duì)酶的抑制作用最強(qiáng)，抑制了60%左右的酶活性。可能是Cu2+、Al3+和Fe3+等離子與蛋白的作用區(qū)域結(jié)合導(dǎo)致酶活受到抑制[21]。K+、Ca2+、Zn2+對(duì)酶活力的影響作用不是很明顯。

圖6 金屬離子對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活力的影響Fig.6 Effects of metal ions on the β-lactamase activity

2.3.4 β-內(nèi)酰胺酶酶液保存穩(wěn)定性

經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌得到的無(wú)菌粗酶液，對(duì)其不同的保存方法進(jìn)行研究以提高保存穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，4 ℃條件下，未添加任何輔料的酶液保存5 d后酶活力能保留93%左右，30 d后酶活力僅余60.8%。添加20、50、100 g/L NaCl的酶液保存30 d基本上依然都保留90%以上的酶活力，從表中可以看出，穩(wěn)定性效果由高到底依次為：50 g/L NaCl>100 g/L NaCl>20 g/L NaCl。同期添加50、100、150 g/L甘油的酶液保存30 d皆都保留90%以上的酶活力，穩(wěn)定性效果由高到底依次為：100 g/L甘油>50 g/L甘油>150 g/L甘油。綜上，由原液的保存5 d剩余93%左右的酶活力向其中添加50 g/L NaCl或100 g/L甘油后延長(zhǎng)到了30 d，穩(wěn)定性效果提升了6倍，因此向酶液中添加50 g/L NaCl或100 g/L甘油可以更好地提高酶液保存的穩(wěn)定性。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用抗生素平板法和碘量法(定性)從上海臨港地區(qū)分離出1株高產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株B03，對(duì)此菌株進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析，將其基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)確定該菌株為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，命名為BacilluscereusB03。1999年，中國(guó)藥品生物制品檢定所在我國(guó)最先分離出1株能產(chǎn)生青霉素酶的蠟狀芽孢桿菌CMCC (B) 63 301，此菌已被收入《中華人民共和國(guó)藥典》[22]。將菌株B03的核酸序列通過(guò)Bankit向GenBank申請(qǐng)的登錄號(hào)(GenBank Accession)為MK568 460。

表4 無(wú)菌粗酶液保存穩(wěn)定性研究Table 4 The storage stability of sterile crude enzyme solution

酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適反應(yīng)pH為7.0，該酶在4～20 ℃、pH 5.0～7.5穩(wěn)定性較好。本研究中該酶的最適反應(yīng)溫度高于戚薇等[23]、劉翔[24]所研究的酶的最適反應(yīng)溫度(37 ℃)，該酶50 ℃剩余相對(duì)酶活力90%左右也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于他們所研究的70%、40%左右的剩余相對(duì)酶活力，說(shuō)明此酶有更好的溫度耐受性，可能由酶的基因表型不同造成的，但皆屬于中溫酶的范疇[25]。Mg2+、Fe2+和Mn2+對(duì)酶有不同程度的激活作用，Cu2+、Al3+和Fe3+對(duì)酶有不同程度的抑制作用。在β-內(nèi)酰胺酶酶液保存穩(wěn)定性研究中，向無(wú)菌粗酶液中添加50 g/L NaCl或100 g/L甘油后，由原酶液的保存5 d剩余相對(duì)酶活力93%左右延長(zhǎng)到了30 d，穩(wěn)定性效果提升了6倍。

中國(guó)是生產(chǎn)和使用抗生素的大國(guó)，每年生產(chǎn)抗生素的總量可達(dá)到21萬(wàn)t，使用量可達(dá)到18.9萬(wàn)t[26]。目前，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素由于藥效快、作用范圍廣、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在食品加工、畜牧飼養(yǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等與人類(lèi)生活息息相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域。β-內(nèi)酰胺酶不僅可以清除環(huán)境中抗生素的殘留，也用于食品(特別是乳及乳制品)、飲用水和環(huán)境中殘留抗生素的檢測(cè)，為食品安全及公眾健康提供重要的保障。因此，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的分離純化及酶學(xué)特性的研究具有重要意義，本研究分離得到的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株B03，下一步將研究此產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化，以期為進(jìn)一步工業(yè)化開(kāi)發(fā)利用性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株提供借鑒，為工業(yè)生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶及其應(yīng)用提供參考依據(jù)。