高溫酸性脂肪酶產生菌Acinetobacter sp. Lip-55的篩選、鑒定及其酶學性質研究

陳貴元，劉林波，桑鵬，楊力權*

1(大理大學 基礎醫學院，云南 大理,671000)2(云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南 大理,671000)3(大理大學 農學與生物科學學院，云南 大理,671003)

脂肪酶(lipase，E.C3.1.1.3) 全稱為酰基甘油水解酶(triacylglycerol acylhydrolases)，是一類既可水解長鏈脂肪酸甘油酯生成甘油和長鏈脂肪酸又可逆向合成的酶類[1]。脂肪酶還是一類具有多種催化功能的酶，能在油-水界面上(異相系統)催化甘油三酯及不溶于水的酯類進行水解和醇解反應，或是在有機體系(有機相系統)中進行酶促合成和酯交換反應[2]。脂肪酶廣泛分布于動物、植物和微生物體內，其中以微生物類脂肪酶居多。研究發現，產脂肪酶的微生物有熒光假單胞菌、黑曲霉菌、根霉菌、毛霉圓柱假絲酵母菌、圓弧青霉黏質色桿菌和枯草桿菌[3]。脂肪酶可以催化脂水解、醋交換、醋合成等反應，因而在食品、化妝品、皮革、生物柴油等領域均具有廣泛應用。

嗜熱脂肪酶和普通脂肪酶相比具有耐高溫的特點。嗜熱脂肪酶主要分離自一些特殊環境中的微生物，例如熱泉、深海熱液、廢水處理廠等特殊環境微生物。在商業上也因為其在高溫下具有較高的反應效率，可以減少微生物污染的可能性，降低反應溶液的黏度，提高底物的溶解度等特點，受到越來越多的重視，并且已經有很多嗜熱脂肪酶已經被純化、克隆和進行性質的研究，并且被運用于洗滌劑和生活污水等方面[4]。

由于高溫脂肪酶具有重要的作用及價值，篩選產高溫脂肪酶的菌株成了一項重要的工作。本實驗以彌渡熱泉土樣為材料，篩選出產高溫脂肪酶的菌株，并對其分類鑒定及酶學性質進行研究，為脂肪酶的發酵工業新備選菌株的開發應用提供資源，為進一步開發利用該菌株提供基礎，也為進一步獲得產脂肪酶基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土壤樣品

土壤樣品來自大理彌渡縣石夾泉熱泉的底泥，熱泉水溫55℃。

1.1.2 儀器與設備

CX31型顯微鏡，奧林巴斯；754型紫外可見光分光光度計，上海菁華儀器公司；DL-8000C高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器公司；BPH-9052型恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；THZ-82型水浴恒溫搖床，常州國華電器有限公司；YXQ-LS-50II型高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；JJ-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；ABI2720型PCR擴增儀，美國ABI；DYCP-31DN型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.1.3 試劑

酵母抽提物、蛋白胨，英國進口；瓊脂粉，西班牙進口分裝；三丁酸甘油酯、NaCl、結晶紫、碘、乙醇、孔雀綠、番紅，國產分析純試劑。DNA抽提試劑盒、PCR擴增試劑盒、膠回收試劑盒和DNA分子量標準品，北京天根生物技術有限公司。

1.1.4 培養基[5-6]

富集培養基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1；自然pH值。

篩選培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，三丁酸甘油酯2，瓊脂粉20；自然pH值。

LB液體培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10； pH值7.0。

基本發酵培養基(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨20，K2HPO41，(NH4)2SO41，MgSO40.5，橄欖油10，自然pH值。上述培養基均在121 ℃，0.1 MPa下滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株富集

稱取石夾泉熱泉底泥2 g于45 mL的無菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩15 min。在無菌條件下，用移液槍吸取5 mL懸液于50 mL的富集培養基中，將接種好的富集培養基置于43 ℃，轉速為150 r/min的水浴恒溫振蕩培養箱中振蕩培養24 h。

1.2.2 菌株初篩

將富集好的菌液稀釋至10-3、10-6、10-9倍，用移液槍分別吸取稀釋的菌液150 μL接種在篩選培養基平板上，涂布均勻。于37 ℃，倒置培養24 h。觀察菌落周圍若有透明圈出現，說明該菌株能產生脂肪酶。

1.2.3 菌株復篩

將初篩得到的菌株取少量接種于種子瓶(LB液體培養基)，55 ℃，培養24 h后，將種子液按2%的接種量接入到發酵培養基，55 ℃，150 r/min水浴搖床培養1周。離心取上清測酶活。

酶活測定：參照文獻[7]的方法進行。配制對硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)底物溶液(10mmol/L)和對硝基苯酚(p-NP)標準溶液(1 mmol/L)：將p-NP標準溶液用1 mol/L的Na2CO3溶液稀釋成10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μmol/L 10個梯度，分別取1 mL，再分別加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL和0.5 mol/L的NaOH 3 mL，混勻后410 nm處測定吸光度，繪制對硝基苯酚標準曲線。

取20 μLp-NPP底物溶液，加入780 μL Tris-HCl緩沖液，37 ℃預熱5 min后加入200 μL酶液，反應10 min后加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL，混勻后放置5 min終止反應，再加入0.5 mol/L的NaOH 3 mL調pH值，(將200 μL蒸餾水替換200 μL酶液，其他條件不變，即得空白)，于410 nm處測定吸光度。對照標準曲線算出生成的p-NP濃度，進而計算出酶活力。在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmol對硝基苯酚的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

(1)

式中：X為脂肪酶活力，U/mL；c為對硝基苯酚濃度，μmol/L；V為酸堿調節后的反應液終體積，mL；V′為酶液的用量，mL；t為作用時間，min。

1.2.4 菌株鑒定

(1) 形態學、生理生化特征

產酶菌株的形態觀察及生理生化實驗參照文獻[8]的方法進行。

(2) 16S rRNA基因序列測序和分析

根據北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行DNA的提取。使用通用引物 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴增細菌 16S rDNA。擴增條件為：預變性94 ℃，5 min，變性94 ℃，30 s，退火50 ℃，45 s，延伸72 ℃，100 s，最后延伸72 ℃，5 min，循環30次，將PCR產物加入預先制備好的0.8%的瓊脂糖凝膠中，140 V，電泳1 h，瓊脂糖凝膠回收根據北天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行PCR產物回收。將PCR回收產物送廣州英濰捷基(上海)貿易有限公司測序，將獲得的序列提交GenBank (http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov)，根據BLAST數據庫中細菌16S rRNA基因序列進行相似性比較分析，利用MEGA 5.0軟件進行系統進化分析。

1.2.5 菌株最適生長溫度

按接種量為1%的菌種于LB液體培養基中，置于不同的溫度(25、31、37、43、49、55 ℃)下搖床培養24 h，然后在波長600 nm處測定各個溫度下菌株生長的吸光值，以確定菌株的最適生長溫度。

1.2.6 酶學性質

(1)溫度對酶活的影響

將酶液分別在4～75 ℃條件下測定脂肪酶的活力。

(2)pH值對酶活力的影響

在最適酶活溫度下，配制不同pH值的反應緩沖液，檢測不同的pH值對脂肪酶活力的影響。

(3)酶的熱穩定性

將1 mL酶液分別置于不同的溫度(4、25、37、55、75 ℃)下保溫，在保溫15、30、60、90、120 min時測定酶活。以保溫0 min溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比，并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩定性曲線。

(4)金屬離子對酶活力的影響

將1 mL的酶液和10 μL濃度為0.1 mol/L的金屬離子(Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+)混勻，將其放置到4 ℃冰箱過夜，第2天測定各組酶活力。以未加入金屬離子的酶液反應體系作為對照組，測定和觀察金屬離子對酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株的篩選

根據水解圈直徑與菌落直徑比值的大小。篩選出3株產高溫脂肪酶菌株. 其中1號菌株水解圈直徑與菌落直徑比值(R1 /R2)最大。經復篩發現3株菌均為分泌型脂肪酶產生菌，且1號菌株酶活最高，達到46.11 U/mL，與初篩的結果相符。因此，選擇1號菌株作為后續實驗研究菌株，命名為Lip-55，其產生的水解圈如圖1所示。

圖1 Lip-55菌落產生的水解圈Fig.1 The hydrolysate circle produced by Lip-55 colony

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態學、生理生化特征

Lip-55在LB培養基上37 ℃培養72 h后，菌落呈淡黃色，不透明，圓形隆起，黏稠，不易挑取。革蘭氏染色為陽性，菌體呈球桿狀(圖2)，無芽孢。

圖2 Lip-55的革蘭氏染色(100×)Fig.2 The gram staining of Lip-55

對Lip-55的生理生化特性進行研究，發現V-P實驗為弱陽性；甲基紅實驗結果、吲哚實驗、明膠實驗結果均為陰性；乳糖發酵實驗結果為陰性；葡萄糖發酵實驗、蔗糖發酵實驗結果均為能利用糖，但不產氣。

2.2.2 16S rRNA基因序列及系統發育分析

16S rRNA基因測序，所獲得的序列長度為1 439bp，將Lip-55的16S rRNA基因序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，發現Lip-55與不動桿菌屬的16S rRNA基因序列自然聚類，Lip-55的16S rRNA基因序列與15條相似性較高的序列構建系統發育樹見圖3，從圖中可以看出Lip-55與Acinetobactersp. strain W1(KX622562.1)的菌株聚為一群，相似性也最高，為99.82%，表明Lip-55與Acinetobactersp.的親緣關系最近。

圖3 基于16S rRNA基因序列相似性的菌株Lip-55與15株細菌的系統進化樹Fig.3 The Phylogenetic tree of Lip-55 and other 15 strains based on 16S rRNA

根據Lip-55的形態學及生理生化特征觀察，結合《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第八版)[9]，以及Lip-55 16S rRNA基因序列及系統發育樹，將Lip-55初步鑒定為不動桿菌屬(Acinetobactersp.)的1株菌，命名為Acinetobactersp. Lip-55。

2.3 菌種的最適生長溫度

按照實驗方法，在波長600 nm處測定不同溫度培養下LB培養基的吸光值，以600 nm處的吸光值為縱坐標，溫度為橫坐標做溫度—吸光值關系曲線，結果如圖4所示。

圖4 Lip-55菌株生長曲線Fig.4 The growth curve of Lip-55 strain

由圖4可知，25～37 ℃菌體的生長量隨著溫度的升高而增加，37 ℃時，LB培養基在600 nm處的吸光值最高，表明37 ℃是菌株的最適生長溫度。37 ℃以后，菌體生長量隨著溫度的升高而下降，菌株在55 ℃下菌體還能生長，表明菌株屬于典型的耐高溫菌。

中國食品工業協會常務副會長劉治曾公開表示，對食品工業而言，精準的政策和制度安排、有效市場機制的構建，將最大程度地激發出食品企業的活力，加快淘汰落后產能，擴大優質產能，改善有效供給和中高端供給，實現產業結構的優化升級。

2.4 菌株Lip-55的脂肪酶性質

2.4.1 對硝基苯酚標準曲線

根據制作對硝基苯酚標準曲線的方法，制作出的對硝基苯酚標準曲線線性回歸方程為y=0.003 6X+0.000 6，線性相關系數R2=0.990 5，表明線性比較好，可供后續酶活測定使用。

2.4.2 溫度對酶活的影響

按照實驗方法，在不同溫度下測定酶的活性，以酶活力為縱坐標，溫度為橫坐標做溫度—酶活關系曲線(圖5)。

圖5 溫度對Lip-55脂肪酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the activity of Lip-55 lipase

由圖5可知，低溫能抑制酶的活性，但不能使酶失活，在4 ℃的條件下，脂肪酶仍具有活性，但活性較低。4～55 ℃，隨著溫度升高，酶活力增加，在55 ℃時，酶活力達到最大值46.1 U/mL。在55 ℃之后，隨著溫度升高，脂肪酶活力反而降低。酶在其最適溫度范圍內，活性最高、酶促反應速率最大。超過最適酶活溫度，反應速度反而下降[10-11]。表明該脂肪酶的最適反應溫度為55 ℃，屬于典型的耐熱脂肪酶，脂肪酶的最適反應溫度一般在30～50 ℃[12]，許多利用脂肪酶的工業催化過程都要求較高的反應溫度，如紙漿脫脂脫墨、皮革脫脂、牛奶脫脂生產等，本研究獲得的脂肪酶最適催化溫度為55 ℃，表明該脂肪酶具有潛在的工業應用價值。

2.4.3 脂肪酶的最適反應pH

由圖6可知，酶活隨著反應液pH的增大呈現先增大后減小的趨勢，在pH 5.5附近達到最大值，繼續增大反應體系pH，該脂肪酶活力反而下降，可能是堿性條件影響了酶與底物的結合，或者是堿性環境下，脂肪酶蛋白質的結構和穩定性都遭到了破壞。因此該酶的最適反應pH值為5.5，屬于酸性脂肪酶。酸性脂肪酶可作為飼用酶制劑應用于飼料工業，還可作為藥物治療消化功能不足的疾病[13]。該酶的最適反應pH值為5.5，表明該脂肪酶具有潛在的飼料加工及藥用價值。

圖6 pH對Lip-55脂肪酶活性的影響Fig.6 Effects of pH on the activity of Lip-55lipase

2.4.4 脂肪酶熱穩定性

按照實驗方法進行實驗，測定其各個溫度下不同時間點脂肪酶的酶活，以保溫0 min溫度下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩定性曲線，結果如圖7所示。

圖7 Lip-55脂肪酶的熱穩定性Fig.7 Thermostability of Lip-55 lipase

由圖7可知，脂肪酶在25 ℃以下，Lip-55脂肪酶能夠在長時間內保持相對穩定的酶活。表明該酶可在較低的溫度下保存，酶在75 ℃保溫120 min，相對酶活損失近90%，菌株產生的酶雖然是高溫脂肪酶，但酶在較高的溫度下，酶活性隨著保溫的時間延長而降低，可能是高溫使酶蛋白的分子結構遭到破壞，酶表現出熱穩定性較差的特性。

2.4.5 金屬離子對酶活力的影響

本實驗中將加有金屬離子的稀釋酶液在4℃保溫過夜，以未加入金屬離子的酶液反應體系作為對照組，測定各種金屬離子對酶活力的影響結果，如表1所示。

表1 金屬離子對Lip-55纖維素酶活的影響Table 1 The effect of metal ions on Lip-55 Lipase activity

由表1可知，Ca2+、Zn2+和Mg2+對脂肪酶的活力有一定的抑制作用，Ca2+、Zn2+和Mg2+可能與該脂肪酶的活性中心基團相結合，抑制酶的活性中心與底物結合，使酶活性降低。K+、Mn2+、Fe2+、Cu2+均對該脂肪酶有一定的促進作用，其中Fe2+對Lip-55脂肪酶酶活促進作用較為明顯，因此，該脂肪酶在應用過程中，可以根據需要在反應體系中添加K+、Mn2+、Fe2+、Cu2+提高酶活力。

3 結論

脂肪酶是一類廣泛應用于工業領域的生物催化劑，具有重要的應用價值。脂類水解酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，由于動植物脂肪酶作用底物的范圍窄，體外活性和產量都很低，所以現在工業上所用的脂肪酶都來源于微生物[13-17]。本實驗采用傳統鑒定方法結合分子生物學技術對菌株進行鑒定，最終確定該菌株在分類和進化中的地位。在工業生產中，耐熱酶與常溫酶相比具有諸多優勢：(1)工業生產中，能降低系統冷卻要求，減少能耗；(2)可通過熱處理簡化酶的提純，降低制備酶的成本；(3)使酶便于運輸和儲藏。因此，廣泛開展細菌脂肪酶，特別是嗜熱細菌脂肪酶的研究具有重要意義。嗜熱細菌(Thermophilicbacteria)通常指能在55℃以上生長的細菌，主要分布于火山口、堆肥、溫泉和工廠廢水排放口附近。嗜熱細菌所產的酶往往具有極強的耐熱性，在工業生產中具有巨大的應用價值[18]。本實驗從大理彌渡白總旗熱泉篩選到1株能向胞外分泌高溫脂肪酶的菌株，經初步鑒定為不動桿菌，命名為Acinetobactersp.Lip-55。菌株最適生長溫度為37 ℃，菌株在55℃仍能生長。酶學性質研究表明，最適作用溫度為55℃，與沈曉莉等報道的嗜熱脂肪酶S3具有相似的酶學特性[19]，最適pH值為5.0，為酸性脂肪酶。酶在25 ℃以下能在較長時間內保持穩定，Ca2+、Zn2+和Mg2+對Lip-55脂肪酶的活力有一定的抑制作用，Mn2+、K+、Fe2+、Cu2+均對Lip-55脂肪酶活力起促進作用，其中Fe2+的促進效果最為明顯。該脂肪酶在大多數金屬離子存在下均展現出較好的催化活性，表明該脂肪酶在處理含有金屬離子的制革廢水方面具有潛在的應用價值。本研究可為脂肪酶發酵工業新型菌種資源的篩選和開發應用提供基礎。