耐高糖產香酵母菌的分離鑒定及其應用

李夢琦，趙一凡，鄭飛云，鈕成拓，劉春鳳，李崎，王金晶*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫，214122)2(江南大學，釀酒科學與工程研究室， 江蘇 無錫，214122)

食品中常添加酵母以增加食品的香氣及特殊風味。在葡萄酒發酵中，添加膠紅酵母提高糖苷酶活性以增加香氣[1]。釀酒酵母和畢赤酵母混合發酵增加花香果香[2]，尤其熱帶水果香氣。白酒酒糟中分離得到的高產酯的畢赤酵母高產乙酸乙酯也用于發酵食品的增香[3]。球擬酵母加入醬醪中使醬油酯香更濃郁。食用酵母對人體的健康有益。酵母本身富含多種營養物質，如VB族；部分酵母還富含微量元素，如硒等[4]。此外，氨基酸、多糖等也是酵母中對人體健康有益的成分，如酵母多糖是一種天然高效的活性調控劑，可調節腸道菌群平衡，維持腸道健康和增強機體免疫力，減少疾病發生，增強消化吸收功能[5]。因此在食品中直接添加酵母在增加食品風味的同時也增加了食品的營養。食品中也常添加酵母抽提物，它具有核苷酸、多肽、氨基酸等風味物質，是繼味精、水解蛋白、呈味核苷酸后的第4代富含營養物質的天然調味料。

魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)是常見的耐高滲透壓酵母菌，在含食鹽質量分數為5%～8%的培養基中生長良好，能在一定濃度的葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘油為碳源的培養基上生長[6-7]，耐高糖的魯氏酵母有利于促進甜醬醬油等食品的發酵。魯氏酵母主要作為發酵食品的生產菌，常應用于生產醬油[8]、醬[9]、甜醬、日本味增和泰國發酵魚制品、面包[10]等發酵制品。魯氏酵母在醬油發酵中主要作用為產生乙醇、高級醇，如異戊醇、異丁醇等醇類物質、芳香雜醇類物質(如乙醇、3-甲硫基丙醇、異戊醇)[11]。此外，魯氏酵母可以增加醬油中的琥珀酸含量使醬油的滋味得到改進。從糠醛生成糠醇也是魯氏酵母的重要作用。魯氏酵母在醬中發酵產生類似焦糖味的呋喃酮類風味物質，可以提高醬中的總氨基酸含量，增加甜醬的鮮味，增加醬的香味，并且提高總抗氧化活性[12]。醬、醬油等食品的高糖和高鹽的特性使獲得1株耐高糖的魯氏酵母具有重要的意義[13]。我國關于魯氏酵母的研究多集中于在發酵食品中的應用，比如在香腸的發酵中添加魯氏酵母提高發酵香腸品質[14]，添加在醬和醬油等制品中使其有更好的風味及揮發性香氣等[11-13]。國外對于魯氏酵母的研究除了在食品中的應用，還對魯氏酵母耐高滲等特性的的機理進行研究[15-16]。甜醬、醬油等食品中糖度高，若能在醬中進行發酵的耐高糖魯氏酵母菌株更有生存優勢，為醬帶來更好的風味。不僅如此，魯氏酵母本身具有鮮味，加入醬中也可以明顯提升醬的鮮味。

柿子餅又稱柿餅，天然曬制而成，是我國的傳統特色小吃。柿餅富含果糖、葡萄糖、天然有機酸、錳、鈣、維生素等[17]，營養價值高，所含維生素和糖分比一般水果高1～2倍。在曬制過程中，柿子汁液中的糖分得到了濃縮，柿子表面存在的細菌和真菌大都已經凋亡，僅有一些耐高滲的菌株存活下來。同時，由于柿餅的風味獨特，柿餅表面存活的菌株可能會存在特殊風味。本研究從柿餅表面篩選耐高糖的酵母菌株，在不同碳源、不同濃度的固體培養基上點樣確定該菌株不同碳源的耐受性，在液體培養基中發酵6 d對發酵液風味物質進行測定，并將其加入醬、醬油等發酵食品中，品評得到該菌發酵食品的影響，以期獲得較好的增香效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

富集培養基(g/L)：氨芐青霉素0.1，酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20；YPD培養基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20；高葡萄糖培養基(g/L)：葡萄糖，酵母粉10，蛋白胨20；高葡萄糖固體培養基(g/L)：葡萄糖，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂20；高蔗糖固體培養基(g/L)：蔗糖，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂20；高果糖固體培養基(g/L)：果糖，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂20；高麥芽糖固體培養基(g/L)：麥芽糖，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂20；淀粉固體培養基(g/L)：淀粉，酵母粉10，蛋白胨20，瓊脂20；高鹽固體培養基(g/L)：NaCl，酵母粉10，葡萄糖20，蛋白胨20，瓊脂20。

1.2 儀器與設備

PL2002電子天平、AL204分析天平，梅特勒-托多儀器有限公司；BSP-250生化培養箱，上海博訊公司；氣相色譜串聯質譜聯用儀，美國瓦里安公司；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；TC5000 PCR儀，英國TECHNE公司；GelDoc-ItTM凝膠成像系統，美國UVP公司；GC-2010頂空氣相色譜儀，日本島津公司；顯微鏡，日本Olympus公司；UV1102可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

從柿餅表面采用隨機取樣的原則收集樣品，裝入滅菌袋，于冰箱中貯藏備用。

1.3.2 菌種的分離與篩選

將樣品過濾除雜后取適量加入有100 mg/L的氨芐青霉素的富集培養基中28 ℃培養24 h，取鏡檢后有活菌存在的培養液1 mL接入含有葡萄糖400 g/L的高糖固體培養基中。28 ℃培養72 h待長出菌落后，選長勢良好，且具有典型酵母菌落特征單菌落進行劃線分離，經鏡檢為純種后分別轉入YPD固體斜面，低溫保存。

1.3.2.1 菌株耐受性分析

對分離獲得的菌株進行耐受性分析，評價菌株在不同碳源及不同濃度的NaCl平板上的生長狀況。取1環酵母在不同濃度不同碳源(葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉)的平板培養基上由外至圓心進行扇形劃線，28 ℃培養48 h，測定所篩酵母對于不同碳源的耐受性。取一環酵母在不同濃度NaCl的平板培養基上由外至圓心進行扇形劃線，28 ℃培養48 h，測定所篩酵母對于NaCl耐受度。

1.3.2.2 菌株生長曲線的測定

酵母菌株以1%的接種量接種入YPD培養基中，28 ℃，180 r/min搖床培養12 h，再以10%接種量接入YPD培養基，200 g/L高葡萄糖培養基，400 g/L高葡萄糖培養基。從接入時計為0 h，0～46 h內定點取樣。無菌水清洗1次，酶標儀測定600 nm處分光光度值。

1.3.3 菌種鑒定

挑取斜面保藏的菌株1～7號于10 mL YPD培養基中，28 ℃、180 r/min培養24 h。取適量培養液離心1 min(12 000 r/min)，棄上清，采用酵母DNA提取試劑盒提取菌體DNA，用酵母ITS通用引物(引物序列見表1)擴增基因組DNA，PCR產物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行測序。采用BLAST方式將測定的18S rDNA序列與GenBank中酵母菌的序列進行比對，構建菌株系統發育樹。

表1 酵母ITS通用引物序列Table 1 Common primer sequences of yeast

1.3.4 菌株發酵實驗及基本風味物質測定

1.3.4.1 菌株發酵實驗

取1環酵母接種入10 mL的YPD培養基中，28 ℃，180 r/min過夜活化。在400 g/L葡萄糖含量的高糖培養基中以107CFU/mL接種量接種，在28 ℃靜置發酵6 d。發酵完成后，以GB/T 4928—2008中方法對發酵液酒精含量及總浸出物含量進行測定[18]。

1.3.4.2 發酵液風味物質含量測定

酵母菌株發酵液主要醇酯類風味物質含量采用頂空氣相色譜法進行測定。發酵結束后，取酵母發酵液樣品過濾除氣。添加1.8 g無水NaCl到5 mL除氣之后的發酵液樣品，置于頂空進樣瓶中并蓋好橡膠蓋，振蕩溶解。氣相色譜條件如下：

色譜柱采用PEG-20M石英毛細管柱(30 m，I.D. 0.32 mm)，檢測頂空平衡溫度70 ℃下平衡30 min。130 ℃傳輸線溫度，200 ℃進樣口溫度，進樣時間為0.04 min。柱流量為1.2 mL/min，載氣(N2)流量為30 mL/min，燃氣采用H2流量為47 mL/min，助燃氣流量400 mL/min。檢測器采用氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度為250 ℃，程序升溫(10 ℃/min)：40～180 ℃。

1.3.4.3 菌體揮發性物質測定

將酵母菌活化后按1%接種量接種入YPD培養基，28℃，180 r/min搖床培養24 h后，無菌水清洗，離心取菌泥。

樣品前處理萃取條件：20 mL頂空瓶中，加入2 g酵母菌泥樣品，10 μL、10 280 μg/L 2-辛醇，在45 ℃預熱5 min，萃取60 min。萃取完成后，將萃取頭插入進樣口，解吸附5 min，進行GC-MS分析，實驗以2-辛醇為內標作半定量分析。

GC分析條件為：PEG-20 M彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 m×0.25 μm)；載氣為高純氦氣，恒定流量為0.8 mL/min；升溫程序：從180 ℃開始，保持2 min，以3 ℃/min升溫到230 ℃，保持10 min；進樣口溫度250 ℃，出樣口溫度200 ℃；檢測電壓350 V。MS條件：EI離子源，發射電流200 μA，電子能量70 eV，掃描范圍20～550 U。

1.3.5 菌株JNBZR01的應用

菌株于YPD培養基中培養后收集菌泥，冷凍干燥后添加于食品中：將凍干得到的菌粉取0.5 g添加到100 g食醋1，食醋2，黃豆醬1，黃豆醬2，醬油中，即添加量均為0.5 %(質量分數)。攪拌均勻。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選及鑒定

柿餅表面存在大量的微生物，且由于其含糖量極高，非常適于篩選耐高滲透壓的微生物。本研究在柿餅表面篩選獲得了具有耐高滲、耐高糖特性的酵母菌，能夠在具有高滲透壓的環境中生長發酵，其發酵液有特殊香氣，有利于其在工業中的應用。

2.1.1 菌種的分離篩選

在柿餅表面隨機取樣并在含有氨芐青霉素的富集培養基培養，之后于含有400 g/L葡萄糖的高糖YPD平板上分離獲得了7株菌株。菌落菌體特征如表2所示，菌落均呈乳白色且表面光滑，5號菌細胞為橢圓形，其余6株為圓形。

表2 菌落菌體特征Table 2 Colony and bacte1ial characteristics

2.1.2 碳源及滲透壓耐受性分析

將分離獲得的7株菌在不同濃度不同碳源的高糖培養基上進行扇形劃線，以菌株是否生長確定出每一株菌對不同碳源的最高耐受濃度。結果如圖1所示，1號和6號菌株對于蔗糖的耐受性在7株菌中最高，達到600 g/L，對NaCl的耐受性在7株中最高，達到120 g/L。2號、3號、4號、5號菌株對于葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖的耐受性相同，但對蔗糖耐受性低于1號、6號、7號菌株，對于NaCl的耐受性略有差異，分別為80、80、70、90 g/L。7號菌株對于葡萄糖的最高耐受濃度為540 g/L，耐受性略高于其他6株，對蔗糖及麥芽糖的最高耐受濃度均為600 g/L，對NaCl的最高耐受濃度為120 g/L。7株菌對果糖的最高耐受均為600 g/L，對淀粉的最高耐受濃度均為100 g/L。

由圖1可知7株菌株對不同的碳源有著不同的利用偏好，1號菌株及6號菌株對于蔗糖的耐受性及滲透壓耐受性更好。2號、3號、4號、5號菌株更偏愛利用葡萄糖，果糖，麥芽糖，對于滲透壓耐受性相較其他菌株較差。7號菌株更喜愛利用蔗糖和果糖，有較高的滲透壓的耐受性。總體而言，7株菌株對于葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖這幾種碳源都有良好的耐受性，一定的淀粉酶活性和較好的滲透壓耐受性，7株菌株之間差距雖較小，但1號菌株和6號菌株的綜合耐受性更優。

圖1 菌株對不同碳源及NaCl的耐受性分析Fig.1 Tolerance analysis of different strains against different carbon sources and NaCl

2.1.3 菌種鑒定

7株菌的基因組DNA用酵母ITS通用引物進行PCR擴增(圖2)，將產物進行測序，結果與Genbank中酵母菌的18S rDNA序列進行比對，結果均為魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)，其中1號和6號為同一株菌，2號、3號、4號、5號菌株為同一株菌。選取1號、5號和7號進行進一步研究。

M-Maker；1-1號菌株；2-2號菌株；3-3號菌株；4-4號菌株；5-5號菌株；6-6號菌株；7-7號菌株圖2 七株菌18S rDNA PCR產物電泳圖Fig.2 PCR results of 18S rDNA of 7 strains

2.1.4 發酵液主要風味物質分析

對1號、5號、7號菌的發酵液進行風味物質組成分析，結果如表3所示，發現1號菌株的酯類物質含量最高，其發酵液醬香、酯香等香氣明顯。因此確定1號菌株為目的菌株，對其進行保藏，命名為JNBZR01。

表3 酵母菌株1號、5號、7號發酵液風味物質組成 單位：mg/L

將菌株JNBZR01測序結果在NCBI中使用BLAST進行同源性比較，與ZygosaccharomycesRouxiiAB302829.1 同源性最高，為98.21 %，系統發育樹如圖3所示。篩選獲得的菌株JNBZR01為魯氏結合酵母Zygosaccharomycesrouxii，已于2018年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No 16547，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

圖3 菌株JNBZR01系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of JNBZR01

2.2 魯氏酵母JNBZR01的理化性質分析

2.2.1 魯氏酵母JNBZR01的生長曲線測定

對菌株JNBZR01進行理化性質的分析，將其置于含糖量不同的培養基中培養，測定其生長曲線。如圖4所示，在3種葡萄糖濃度的培養基中，對數期生長速度并沒有明顯區別，在26 h左右進入穩定期。200 g/L高葡萄糖培養基中，JNBZR01穩定期的生物量約為2%葡萄糖培養基的2倍。而在400 g/L高葡萄糖培養基中，穩定期時的生物量比2%葡萄糖為碳源的培養基高，但遠不如200 g/L高葡萄糖培養基中的生物量。從生長曲線上可以看出400 g/L的高濃度葡萄糖對JNBZR01的生長產生了一定的抑制作用。

圖4 JNBZR01在不同質量濃度葡萄糖YPD培養基中生長曲線Fig.4 Growth curve of JNBZR01 in different cincentrationglucose YPD medium

2.2.2 魯氏酵母JNBZR01的揮發性物質分析

魯氏酵母為常見的傳統發酵食品發酵菌株，其發酵過程能夠明顯增加傳統發酵食品特殊的風味。酵母常常以抽提物的形式添加到醬類食品中增加食品風味和香氣，其香氣明顯，并且可以抑制醬的不愉快氣味，有增加鮮味、緩和酸味、淡鹽、降低苦澀味等矯味作用，賦予醬濃郁香味，提高醬醇厚味的表現力，延長醬味道的持續時間，使之更加美味可口[19]。

菌株JNBZR01菌體自身整體香氣酯香濃郁，有明顯的醬香。因此對該菌菌泥進行GC-MS分析，菌體揮發性物質如表4所示。其中苯乙醇含量較高，苯乙醇在蘋果、杏仁、香蕉、桃子、梨子、草莓、可可、蜂蜜等天然植物中發現，因為有清甜的玫瑰樣花香而常用于蜂蜜、面包、蘋果、玫瑰花香型香精等中。苯乙醇是白酒、黃酒、葡萄酒、醬油、饅頭、面包等傳統發酵食品中重要的風味物質，具有柔和、淡雅細膩的玫瑰氣味[20]。苯乙醛具有類似風信子的香氣，稀釋后具有水果的甜香氣，天然存在于雞肉、西紅柿、面包、玫瑰油、柑橘油里，是常用的花香型香精的調和香料的合成中，其香氣清香透發。3-甲基丁醛帶有蘋果香氣。2-甲基丙醇和3-甲基-1-丁醇具有辛辣的刺激性氣味，而酯類物質中乙酸甲酯的香氣為令人感到愉悅的果香，乙酸乙酯為微帶果香的酒香氣味。這些成分是該菌株菌泥有濃郁香氣的主要原因。這些物質使得該菌適合加入甜醬、醬油、味增等醬類產品和其他食品中增加產品的香氣，對產品的特殊風味有所貢獻。

表4 魯氏酵母JNBZR01菌體揮發性物質分析Table 4 Analysis of Volatile Substances in the JNBZR01

2.3 菌株JNBZR01在食品中的應用

魯氏酵母菌株JNBZR01菌泥冷凍干燥后的干酵母粉0.5 g加入100 mL食醋1、食醋2、黃豆醬1、黃豆醬2、醬油5個樣品中。(-)為未添加干酵母粉，(+)為添加了酵母粉，對10個樣品進行感官品評，感官品評結果的平均值作雷達圖。表5為感官分析評分尺度表。圖5、圖6分別為JNBZR01干酵母粉添加入食醋1，食醋2感官品評雷達圖和JNBZR01干酵母粉添加入黃豆醬1，黃豆醬2，醬油感官品評雷達圖。

表5 感官分析評分尺度表Table 5 Sensory analysis scale scale

圖5 添加JNBZR01干酵母粉的食醋的感官品評雷達圖Fig.5 Sensory evaluation radar chart of vinegar with JNBZR01 added

由圖5和圖6可看出，在醬、醋類食品中添加該菌在香氣和風味上都有較為明顯的改變。如圖5所示，在2種食醋中加入酵母粉后，酯香均明顯提升，甜味及口感協調性略微增加，醋香略微減少，同時也減少了食醋的刺激性氣味，使其變得更為柔和。如圖6所示，在2種黃豆醬及一種醬油中加入酵母粉后，酯香味明顯增加，醬香也略微提升，在風味方面，酵母粉有明顯的增加鮮味的作用，口感協調性也均有提升。因此，JNBZR01可作為一種安全健康的食品提鮮劑加入發酵食品中，尤其是醬類食品，有明顯的增加酯香和鮮味的作用。

在食品加工中，添加酵母抽提物為常見的增加食品鮮味的方法，不僅增加了食品的風味和香氣，也因氨基酸、多肽、VB族含量增加使得食品更加營養健康[21]。酵母中的氨基酸如天冬氨酸及谷氨酸有較強的鮮味特性；絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸有鮮味、甜味；甘氨酸呈海鮮味；肌苷酸(IMP,I)呈雞肉鮮味；鳥苷酸(GMP,G)呈鮮菇味[22]。酵母抽提物中天然谷氨酸含量為8%左右、呈味核苷酸(I+G)含量可高達5%[23]，其他成分為游離氨基酸、小分子肽，所以其有風味獨特的鮮味和肉香味。產品富含多種維生素和多種礦物質等。由于酵母抽提物營養豐富，人體腸胃易于吸收，生產工藝較為簡單成熟，食品加工中不僅起到有效增強產品所需的特殊風味，還能夠緩和甚至除去產品本身的辛咸味和酸苦味，從而更加迎合消費者的口味及香氣需求。酵母抽提物在生活中得到許多應用，如方便面、雞精、食用香精、肉制品、醬鹵制品、餐飲火鍋、烘焙食品、膨化食品、醬油及養殖業等，可提升產品風味及口感[24]。

圖6 添加JNBZR01干酵母粉的醬類產品的感官品評雷達圖Fig.6 Sensory evaluation radar chart of soy sauce with JNBZR01 added

本研究中篩選得到的魯氏酵母菌株JNBZR01,以干酵母粉的形式加入傳統發酵食品中，如食醋，醬油，黃豆醬食品中，風味及香氣有明顯的提升，可作為提鮮劑，在改善食品風味的同時增加食品的營養。

3 結論

魯氏酵母由于其耐高滲的特性在醬等傳統發酵食品中發酵，并且改善發酵食品的風味而受到關注。從柿餅表面篩選酵母菌株經過菌種鑒定確定為魯氏酵母菌株，命名該菌株為JNBZR01，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。JNBZR01具有高糖及高滲耐受性，對的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、NaCl的耐受性分別達到550、600、600、650、120 g/L。JNBZR01的發酵液及菌體自身均具有明顯的香氣，如玫瑰花香、風信子花香及水果的甜香氣等，將菌體添加于甜醬、豆醬、醬油等醬類食品或其他食品中可明顯增加酯香、醬香氣味，提高食品鮮味，增強口感協調性，可作為食品提鮮劑。因此篩選的到的魯氏酵母菌株JNBZR01由于其耐高糖的特性和能夠提升醬等發酵食品的鮮味的特點，在食品方面有著重要的應用前景，但能夠耐受高糖的具體原因及機理還需進一步研究。