酶法轉化精氨酸生產胍基丁胺

張言慧，吉武科，高愛存，孫博通，袁建國*

1(山東國力生物技術研究院，山東 濟南，250101)2(山東國力生物科技有限公司，山東 濟南，250014)

胍基丁胺(agmatine)作為一種重要的生物胺，具有很大的生理功能和醫藥價值。1994年LI等認為CDS物質便是胍基丁胺[1]，從此對該物質的研究逐漸增多。胍基丁胺由精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase,ADC)催化底物精氨酸脫羧產生[2]。血液中胍基丁胺的質量濃度為0.2～0.4 ng/mL，胍基丁胺在體內幾乎分布于所有的器官[3]，在亞細胞水平上，胍基丁胺存在于距內質網和線粒體很近的大密度核心囊泡中[4]。胍基丁胺能抑制細胞內多胺的合成，促進多胺的降解，從而降低細胞內多胺的水平[5]；在中樞神經系統，胍基丁胺可作為一種抗抑郁的藥物，減緩耐藥性的發生和改善急性嗎啡停藥綜合征[6]；此外，胍基丁胺還能促進記憶的鞏固[7]；胍基丁胺能抑制多種細胞的增殖(包括肝癌細胞、血管平滑肌細胞、星型膠質細胞、內皮細胞和腎小管上皮細胞等)[8-9]。在食品、醫藥等領域國內外需求巨大，市場應用前景廣闊。

目前我國胍基丁胺的制備主要來自化學方法，化學法合成胍基丁胺步驟繁瑣、效率低、污染重。利用生物法合成胍基丁胺因具有操作簡便、反應速率快、無污染等優點，受到了人們的關注。AKASAKA等[10]利用米曲霉固態發酵生產胍基丁胺，產量只有8.3 mmol/L，ZHANG等[11]利用固定化基因重組大腸桿菌催化精氨酸合成胍基丁胺，其產量可以達到20 g/L；SUN等[12]利用基因重組大腸桿菌表達ADC，然后利用該酶催化精氨酸反應，使得胍基丁胺的產量提高到69.22 g/L。本文應用構建的1株基因工程菌發酵表達ADC，通過在搖瓶上對最基本的發酵誘導培養溫度、轉化pH、輔酶加量及發酵培養基的優化，ADC酶活水平得到提高。15L發酵罐放大實驗驗證，胍基丁胺產量明顯提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

含有pET-28a(+)質粒的重組大腸桿菌K12(EscherichiacoliK12,E.coliK12)，為本實驗室構建保藏，革蘭氏陰性菌。

1.1.2 培養基

種子培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。pH自然，121 ℃高溫滅菌20min。

初始發酵培養基(g/L)：甘油10(單消)，蛋白胨12，酵母粉8，Na2HPO4·12H2O 15，K2HPO4·3H2O 10，KH2PO43，檸檬酸2，NH4Cl 1，MgSO40.5，NaCl 0.5，檸檬酸鐵銨0.3，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

優化后發酵培養基(g/L)：甘油7(單消)，蛋白胨15，酵母粉5，Na2HPO4·12H2O 18，K2HPO4·3H2O 13，KH2PO45，NaCl 1，MgSO41。pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測方法

1.2.1.1 菌體濃度[13]

取一定量的發酵液用純化水稀釋一定的倍數，用UV-1200分光光度計在600 nm下測定其吸光值OD600。取一定體積發酵液離心去上清并烘干至恒重得菌體干重(dry cell weight,DCW)。

1.2.1.2 胍基丁胺

胍基丁胺含量使用島津LC-20AT高效液相色譜儀測定，色譜柱為Inertsil ODS-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長為210 nm；流動相為0.03 mol/L NaH2PO4，用磷酸調節pH值至3.0；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL；分析時間為20 min。

1.2.1.3 酶活[14]

酶活檢測反應體系組成為：4 mL 0.2 mol/L的KH2PO4緩沖液，200 μLL-Arg母液(125 g/L)，200 μL磷酸吡哆醛(phosphopyridoxal,PLP)母液(4.13 g/L)，200 μL MgSO4母液(25 g/L)。混合后置37 ℃水浴鍋中預熱15 min，再加入200 μL粗酶懸液反應5 min，離心取上清，檢測胍基丁胺濃度計算酶活。

1.2.2 重組菌構建

采用細菌基因組提取試劑盒提取Escherichiacoli的基因組，以其為模板，PCR擴增精氨酸脫羧酶基因。所用脫精氨酸羧基之基因乃adiA非speA[15]，載體pet-28a(+)。所用引物如下：

正向引物F：5′-CGGGATCCCGTACTTTCATAATTAACAAC-3′；反向引物R：5′-CGAGCTCGAATGCGA-AAGTGCGTGTATTG-3′。

PCR反應體系和條件如下：

(1)PCR擴增體系：DNA聚合酶 25 μL；正向引物 2.0 μL；反向引物 2.0 μL；模板DNA 2.0 μL；dd H2O 19 μL。

(2)PCR擴增條件：預變性：95℃，3min；變性：95℃，15s；退火：55℃，15s；延伸：72℃，15 s；循環30次；延伸：72℃，10min；4℃保存。

載體與脫羧基基因所連接處，用BamHI與SacI限制性內切酶處理6 h，用T4DNA連接酶將二者于16℃條件下過夜連接。然后將重組質粒導入感受態E.coliK12細胞中，隨之將其涂布于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板培養基上過夜培養。挑取單菌落，由通用生物進行基因序列的測定以驗證其正確性，從而獲得正確構建的工程菌株。

1.2.3 搖瓶試驗

1.2.3.1 發酵培養與誘導

甘油管保藏菌接種于平板進行活化，37 ℃倒置培養24 h，置4 ℃冰箱保存備用。從平板挑取一環菌苔入搖瓶種子培養基中(50 mL/250 mL錐形瓶)，37 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床中培養16 h得到種子培養液，以3%接種量接種于發酵培養基中(50 mL/500 mL錐形瓶)，同時添加體積分數為50%的甘油，在37 ℃、180 r/min恒溫氣浴搖床中培養6 h，再加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG開始誘導，并補加甘油，30 ℃培養16 h后結束發酵。

1.2.3.2 酶轉化

轉化體系組成為100 g/LL-Arg，8 g/L輔酶PLP，5 g/L MgSO4。轉化溫度37℃，轉化pH 5.0，轉化時間：5 h。

1.2.3.3 培養基優化

利用SAS JMP軟件對重組菌發酵培養基各成分(A-甘油、B-蛋白胨、C-酵母粉、D-Na2HPO4、E-K2HPO4、F-KH2PO4、G-NaCl、H-NH4Cl、I檸檬酸、J-檸檬酸鐵銨、K-MgSO4)進行定制實驗設計，實驗選取11因素2水平進行。

1.2.4 放大實驗

1.2.4.1 發酵

采用上海保興BIOTECH 15L發酵罐進行補料分批發酵[16]，當罐內底料中碳源與氮源耗盡后，開始流加甘油與氨水，流加速率vC、vN見圖1。

圖1 甘油與氨水流加曲線Fig.1 The flow curve of glycerol and ammonia

1.2.4.2 酶轉化

發酵結束后用50 nm陶瓷膜對發酵液進行濃縮和洗滌，收集菌體濃縮液，并加入L-Arg、PLP及MgSO4，然后加水定容至原發酵液體積，制得轉化液，稀H2SO4調節pH至5.0開始反應，反應期間補加L-Arg以提高產物濃度。

2 結果與分析

2.1 ADC發酵誘導溫度的選擇[17]

為了確定重組E.coliK12發酵的最佳誘導培養溫度，本文在搖瓶培養條件下考察了4種不同溫度對菌體細胞生長和酶活的影響，實驗結果見圖2，所用發酵培養基為1.1.2中的初始發酵培養基，IPTG誘導之前的培養方法見1.2.3.1。

圖2 不同的誘導培養溫度對生物量和酶活的影響Fig.2 The effect of different temperature to the biomass and enzyme activity

由圖2可知，不同的誘導培養溫度，對菌體生長和ADC的活性大小有一定影響，30 ℃為最適誘導培養溫度，此溫度有利于酶蛋白形成正確的空間構象，提高了酶活；25 ℃時酶活與OD600值均低，這是因為低溫下參與重組蛋白表達的各種酶的活性有所降低，減緩了ADC的表達速率，低溫不利于菌體生長，使得產生酶蛋白的數量不足而影響酶活。37 ℃對OD600值影響雖然較小，但對重組蛋白表達速率影響較大，因而酶活較低。

2.2 不同pH條件下ADC對轉化效果的影響

轉化時pH控制在5個范圍(如圖3所示)。由于胍基丁胺是精氨酸在ADC催化下脫掉羧基生成的，隨著反應的進行，轉化體系的pH會隨之升高，需要不斷調節pH以維持酶的高轉化活性。反應結束后檢測胍基丁胺與精氨酸濃度計算出酶活與轉化率。由圖3可以看出pH控制在5.0時胍基丁胺濃度最高，相應的轉化率也最高。

圖3 不同酸堿性條件對轉化效果的影響Fig.3 The effect of acid-base condition to the conversion

2.3 重組菌發酵培養基優化

實驗設計及響應值見表1，根據結果篩選出影響ADC活性的顯著性因素，得到酶活的預測表達式。從表1中可以看出,在誤差允許范圍內，酶活實測值與預測值是相符的。

表1 實驗設計與結果Table 1 The design of experiment and response values

回歸參數及效應檢驗見表2，在P值為0.1的條件下進行參數分析，結果表明，因素K、I、C、E是顯著性影響因子，在實驗范圍內對ADC的活性影響最大[18]。通過影響因素篩選，得到以ADC活性Y為響應值的回歸方程：

該模型的R2=0.997，一般認為，R2至少應該為0.80[19]，說明實測值和預測值之間的相關性很好。在表1高低水平之間，將Y最大化，得到最優培養基(g/L)：甘油7，蛋白胨15，酵母粉5，Na2HPO4·12H2O 18，K2HPO4·3H2O 13，KH2PO45，NaCl 1，MgSO41。

2.4 最優發酵培養基驗證

將上述優化培養基與表1中的4號、11號培養基和初始培養基進行對比實驗[20]，結果顯示最優培養基酶活達到3 552.99 IU，是優化前的2.23倍(圖4)。

表2 回歸參數及效應檢驗Table 2 Regression parameter and effect test

圖4 不同培養基的酶活水平Fig.4 The enzyme activity of different medium

2.5 PLP濃度對轉化產物的影響

選取了6個梯度對輔酶PLP的用量進行優化(見圖5)。經過試驗將PLP的用量由原來的8 g/L減少至1 g/L，仍可以達到相同的轉化效果。當PLP的質量濃度降至1g/L以下時胍基丁胺的濃度明顯降低，即輔酶質量濃度為1 g/L時ADC與PLP的結合位點已經飽和，無需再增加輔酶用量。

圖5 PLP濃度對轉化液中胍基丁胺產量的影響Fig.5 The effect of PLP on the amount of agmatine in conversion liguid

2.6 重組菌發酵與胍基丁胺轉化放大實驗

發酵過程中隨著碳源的消耗會產生大量的CO2及有機酸，這時發酵液的pH值會降低，從而帶動了氮源的補入及消耗，維持了菌體生長及目的蛋白表達所需的碳氮比。由圖6可知，發酵過程中隨著菌體的生長，溶氧逐漸降低，當溶氧降低至20%以下時，體系pH急速下降，重組蛋白表達停止，這是由于菌體產生的大量乙酸產生抑制作用造成[21]。當溶氧穩定在20%的水平時，抑制作用解除，菌體恢復正常。當菌體干重達到5.68 g/L時，將37 ℃培養溫度降為30 ℃誘導溫度，并加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導。

由圖6可知，發酵時間5～8 h，μ(比生長速率)開始回升，vX(生長速率)達到整個發酵周期的最大值，表明此時處于對數生長期。至24 h發酵結束時，DCW為33.44 g/L，菌體的vX維持在1 g/(L·h)左右，表明該重組菌具有高密度培養的潛力。

圖6 發酵過程菌體生長曲線Fig.6 The curve of bacterial growth during fermentation

經檢測最終轉化液中胍基丁胺的濃度為279.21 g/L，精氨酸轉化率98%(胍基丁胺HPLC檢測圖譜見圖7)。為下一步濃縮結晶工藝奠定了基礎。

圖7 胍基丁胺HPLC檢測圖譜Fig.7 The detection chromatogram of agmatine

3 結論

本研究以重組E.coli發酵表達ADC，經過實驗，確定了該酶在30 ℃誘導培養優于在其他溫度條件下誘導培養表達效果，該酶的最適pH在弱酸性范圍內。通過實驗設計確定了最優的發酵培養基組成，優化后的發酵培養基ADC活性是優化前的2.23倍。PLP價格較貴，經優化后用量減少數倍，可使生產成本明顯降低。發酵與轉化放大實驗結果表明，最終胍基丁胺質量濃度為279.21 g/L，轉化率達到了98%，相較資料報道達到了較高水平。該研究結果對于酶法制備胍基丁胺的產業化具有重要指導作用。