基于PLFA分析不同地域濃香型大曲及曲房空氣細菌群落相關性

車路萍，鄧杰，衛春會，任志強，郭燕，鄧波，杜禮泉，黃治國*

1(四川輕化工大學，釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓, 644000)2(瀘州老窖有限公司，四川 瀘州, 646000)3(四川省綿陽市豐谷酒業有限責任公司，四川 綿陽, 621000)

中國白酒按香型主要分為13種，每種香型都有著其獨特的風味。濃香型白酒窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協調、尾凈余長，是最受消費者喜愛的白酒之一，市場占有率長期保持在70%以上[1]。濃香型白酒以谷物為原料，大曲為糖化發酵劑，經窖池密封自然發酵后蒸餾而得。其白酒風味形成與大曲質量息息相關，在釀造過程中，大曲為白酒發酵提供大量的細菌、酵母菌和霉菌等原核、真核微生物，這些菌群是白酒發酵過程中降解大分子物質和生成發酵產物的重要生力軍[2-3]。大曲制作發酵采用自然發酵，所含微生物很大部分取決于自然環境，不同地域環境微生物不同，最終生產的大曲質量也不同。

譚崇堯等利用高通量測序法對不同地域濃香型大曲微生物的結構進行分析，發現不同區域濃香型大曲優勢菌群存有差別[4]；施思等利用高通量測序法對濃香型大曲貯藏過程中糖化力發酵力變化及真菌多樣性分析，發現大曲在儲藏過程真菌群落結構不斷調整，且隨著時間的推移，大曲發酵力逐漸升高，糖化力由高變低再升高[5]，羅惠波等采用PCR-SSCP技術對濃香型大曲不同發酵階段原核微生物群落變化進行研究，發現不同階段大曲原核微生物群落相似，不同菌群間具有復雜的協調和制約作用[2]。目前對于濃香型大曲的研究多集中在大曲的工藝、微生物群落結構變化等研究[6-9]，而對不同區域大曲生產的環境微生態研究依然較少。

PLFA圖譜分析法是近幾年來發展的研究微生物群落結構的一種新方法，它可定量分析微生物群落的生物量和群落結構。PLFA作為活體微生物質膜重要的組成成分，具有很高的生物學特異性[10-14]，其數量和種類隨微生物的改變而變化，并且在自然生理條件下相對恒定；但在微生物細胞死亡后磷脂脂肪酸會迅速代謝降解[14-15]。因此相對于目前流行的高通量測序技術，PLFA圖譜分析法檢測微生物群落結構變化不僅操作簡單快捷，同時還能對樣品中微生物群落結構變化進行很好的跟蹤[16-18]，具有時效性的優勢；此外，采用PLFA分析法研究微生物群落能避免植物DNA的干擾和微量微生物DNA的丟失。

本文采用Corolis μ空氣生物采樣器采集曲房空氣微生物，采用PLFA圖譜分析法，以四川綿陽市和瀘州市兩不同區域的濃香型大曲及其對應曲房空氣為研究對象，探索不同地域濃香型大曲及曲房空氣微生物群落的相關性，同時也為研究不同地域同種香型白酒風味差異提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：分別采自四川綿陽和四川瀘州兩家濃香型酒廠不同發酵階段的大曲及其對應曲房空氣為樣品。同一生產階段大曲及對應曲房空氣采取3個平行，利用Corolis μ空氣生物采樣器采集曲房空氣，再將其轉入裝有無菌水的玻璃瓶中；無菌采集大曲后裝入無菌的自封袋中，置于冰盒中迅速運回，粉碎后混勻，用于PLFA分析。各階段樣品取樣環境參數如表1、表2所示。

表1 綿陽濃香型大曲樣品編號Table 1 Sample lable of Luzhou-flavour Daqu in Mianyang

表2 瀘州濃香型大曲樣品編號Table 2 Sample lable of Luzhou-flavour Daqu in Luzhou

實驗試劑：甲基叔丁基醚(色譜純)，Telia Company；正己烷(色譜純)，Fisher Scientific Company；甲醇(色譜純)，Darmstadt Germany；三氯甲烷、甲苯、醋酸和丙酮(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

恒溫培養振蕩器，中國上海智城公司；GC6890氣相色譜儀，美國Agilent公司；微生物鑒定系統，美國MIDI公司；高速離心機，德國Eppendorf公司；空氣生物采樣器，法國Bertin公司；超低溫冰箱，美國Thermo公司；氮氣吹干儀，中國北京八方公司。

1.3 方法

1.3.1 PLFA提取及甲基化

將空氣濾膜或稱取8 g的大曲樣品于50 mL的離心管中，參照文獻[18]進行PLFA的提取及甲基化。

1.3.2 PLFA命名及微生物群落的表征[18-19]

磷脂脂肪酸分析主要檢測碳鏈長度C9～C24的PLFA，一般將這些PLFA分為直鏈脂肪酸(straight)、支鏈飽和脂肪酸(branched)、單不飽和脂肪酸(PUFA)、多不飽和脂肪酸(MUFA)、環化脂肪酸(cyclo)、羥基脂肪酸(hydroxy)、10-甲基脂肪酸(10-methyl)以及二甲縮醛化脂肪酸(DMA)。不同磷脂脂肪酸所表征微生物見表3。

表3 微生物種群PLFA標記物Table 3 The PLFA biomarkers of microbial populations

1.3.3 PLFA氣相色譜分析

氣相色譜儀,配備分流進樣口，Agilent GC6890氣相色譜化學工作站和氫火焰離子化檢測器(FID);進樣口溫度為250 ℃；分流比為10∶1；進樣量為1 μL；初始柱溫40 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持9 min。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 大曲及曲房空氣細菌群落PLFA種類變化規律

采用PLFA圖譜分析法分對四川綿陽、瀘州兩地區酒廠不同發酵時間的濃香型大曲及其曲房空氣細菌群落的PLFA種類進行研究。結果表明，在整個發酵過程中，大曲與對應曲房空氣細菌群落PLFA種類數變化相反，且大曲PLFA種類數高于對應曲房空氣(圖1)。這可能是由于大曲營養豐富且菌種來源廣泛，使得大曲富集的細菌微生物種類多于曲房空氣，且隨著發酵時間的延長，大曲營養成分、理化性質發生改變，部分微生物種類可能無法適應大曲當前環境而遷移至曲房空氣中，當大曲環境適合于微生物生長時，空氣微生物再次被富集于大曲中，導致大曲與其曲房空氣微生物種類存在一種此消彼長的變化趨勢。

圖1 不同區域大曲及其曲房空氣細菌PLFA種類數變化Fig.1 Changes in the number of bacteria PLFA species in Daqu and its air of stacking workshop in different regions注：圖中不同字母代表差異顯著。下同。

兩地大曲細菌種類數在23～39，低溫前期變化較大且變化趨勢相反，發酵后期細菌PLFA種類趨于穩定。綿陽大曲細菌群落PLFA種類數在低溫期增至最大值37，顯著高于發酵0天(P<0.05)，后期趨于穩定。瀘州大曲在低溫期細菌PLFA種類數顯著降低(P<0.05)，高溫期迅速增至最大值(39)，顯著高于低溫期(P<0.05)，后期趨于穩定。這可能是由于兩地制曲所用的原料、水、母曲以及制曲工藝、環境因素等的不同，使得兩地大曲微生物消長有其特殊性[20]。兩地曲房空氣細菌PLFA種類數在9～22，綿陽曲房空氣細菌PLFA種類在發酵前期持續上升，高溫期達到最大值(20種)，后期迅速降低，且顯著低于高溫期(P<0.05)；瀘州曲房空氣細菌PLFA種類數在高溫期前趨于穩定，高溫期后顯著上升(P<0.05)，后火期達到最大值(22種)，貯存期開始下降。這可能與曲房空氣溫度有關，綿陽地區曲房溫度在高溫期達到最大值，瀘州地區曲房溫度在低溫期就已經達到最大值，發酵前期大曲營養豐富，生長溫度適宜，多種微生物種類生長繁殖使曲房微生物種類增加，曲房空氣溫度升高后，不適合高溫的微生物被淘汰導致曲房細菌群落種類降低[21]。

2.2 不同地區大曲及曲房空氣細菌群落PLFA種類組成分析

采用PLFA圖譜分析法對綿陽和瀘州兩地區酒廠濃香型大曲及其廠房空氣細菌群落的磷脂脂肪酸種類組成進行分析(圖2～圖4)。結果表明，兩地大曲及曲房空氣以革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌為主要菌群，且曲房空氣中檢測到的PLFA種類在對應大曲中大致都能被檢測。此外，不同區域大曲及曲房空氣的PLFA種類具有差異性，皆含有其特有微生物種類。瀘州大曲特有PLFA種類包括表征革蘭氏陰性菌的13∶1ω4、22∶1ω9和表征革蘭氏陽性菌的a17∶1ω7；綿陽大曲特有PLFA種類為表征革蘭氏陰性菌的14∶0 20H、15∶1ω8、21∶1ω5、22∶1ω3和表征厭氧菌的18∶1ω9DMA。瀘州曲房空氣特有PLFA種類為表征革蘭氏陰性菌的10∶0 20H、18∶1ω8、18∶1ω9，綿陽曲房空氣特有PLFA為表征革蘭氏陰性菌的17∶1ω4和表征革蘭氏陽性菌的a12∶0以及表征厭氧菌的18∶1ω7 DMA、18∶1ω9 DMA。此外，磷脂脂肪酸c17∶0ω9、17∶1ω8、c20∶0ω6、20∶1ω9、22∶1ω5、16∶1ω7(均表征革蘭氏陰性菌)；a13∶0、a14∶0、a15∶0、a17∶0、i15∶0、i16∶0、i17∶0、i18∶0(表征革蘭氏陽性菌)；18∶0DMA、20∶1ω9(表征厭氧菌)、18∶0(表征嗜熱芽孢桿菌)代表的微生物種類為兩地大曲及曲房空氣共有微生物種類，這些微生物種類可能是影響濃香型大曲風格的重要菌種，其結果與趙金松等[22]的研究結果相似。

圖2 不同區域大曲和曲房空氣革蘭氏陰性菌PLFA組成Fig.2 PLFA composition of Gram-negative bacteria in the Daqu and the air of stacking room in different regions

圖3 不同區域大曲和曲房空氣革蘭氏陽性菌PLFA組成Fig.3 PLFA composition of Gram-positive bacteria in the Daqu and the air of stacking room in different regions

圖4 不同區域大曲和曲房空氣厭氧菌及嗜熱芽孢桿菌PLFA組成Fig.4 PLFA composition of anaerobic bacteria and Bacillus thermophilus in the Daqu and the air of stacking room in different regions

2.3 大曲及曲房空氣細菌群落生物量變化趨勢

采用PLFA法分別對綿陽、瀘州地區不同發酵階段的濃香型大曲及廠房空氣細菌群落生物量變化趨勢進行研究。結果表明,在發酵過程中，綿陽、瀘州大曲及其曲房空氣細菌生物量均呈先上升、后降低的趨勢變化，且大曲生物量高于對應曲房空氣生物量(圖5)，這說明大曲與曲房微生物具有一定的相關性，曲房環境對大曲細菌群落影響巨大。綿陽、瀘州兩地大曲及曲房空氣細菌生物量均在后火期達到最大值，其綿陽大曲為94.18 nmol/m3、瀘州大曲為78.09 nmol/m3、綿陽曲房空氣為54.58 nmol/m3以及瀘州曲房空氣為6.24 nmol/m3。綿陽大曲細菌生物量在發酵前期保持穩定(P>0.05)，后火期迅速增加，顯著高于其他發酵階段(P<0.05)，貯存期開始下降；曲房空氣細菌生物量在發酵前期持續上升，后火期達到最大值(P<0.05)，貯存期生物量有所降低。瀘州大曲細菌生物量變化趨勢與綿陽曲房空氣變化一致，后火期顯著高于其他發酵階段；曲房空氣細菌生物量在高溫期前緩慢降低，高溫期達到最低值，后火期迅速上升達到最大值(P<0.05)，顯著高于其他各階段，貯存期生物量降低。兩地大曲及曲房細菌微生物群落均在后火期達到最大值，這可能是由于濃香型大曲及其曲房空氣在發酵過程中升溫速度較緩慢，未被淘汰的耐高溫微生物能快速適應高溫環境成為優勢菌群，在高溫階段也能生長繁殖[23]，直至后火期生物量達到頂峰，進入貯藏期后大曲及曲房空氣中微生物生長所需的水、營養物質等降低導致細菌生物量降低。

a-綿陽和瀘州大曲細菌生物量；b-綿陽和瀘州曲房空氣細菌生物量圖5 大曲及曲房空氣細菌生物量隨發酵時間的變化趨勢圖Fig.5 The trend of bacterial biomass in Daqu and air as a function of fermentation time

2.4 大曲及曲房空氣細菌群落變化趨勢

對綿陽、瀘州不同地區的濃香型大曲及其廠房空氣的細菌群落結構進行研究分析(如圖6)。結果表明，兩地大曲優勢菌群主要為嗜熱解氫桿菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，曲房空氣優勢菌群主要為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，其結果與譚崇堯等、陳玲等利用高通量測序法測得的川派濃香型大曲結果較為相同[4，24]。瀘州大曲在退火期前以革蘭氏陰性菌為優勢菌群，革蘭氏陽性菌群豐富度總體呈遞增趨勢，嗜熱芽孢桿菌和厭氧菌豐富度保持相對穩定，進入貯藏期，以嗜熱芽孢桿菌為優勢菌群；其曲房空氣在發酵0 d以革蘭氏陽性菌為優勢菌群，低溫期和后火期相對豐度降低以厭氧菌為優勢菌群，進入貯藏期，革蘭氏陰性菌豐度增加成為優勢菌群。綿陽大曲發酵初期以革蘭氏陰性菌為優勢菌群，低溫期轉為革蘭氏陽性菌，中后期嗜熱解氫桿菌、革蘭氏陰性菌豐富度增加，貯藏期后以革蘭氏陰性菌為優勢菌群；其曲房空氣在發酵0 d以革蘭氏陽性菌為優勢菌群，后期以革蘭氏陰性菌為優勢菌群，在整個發酵過程中只有在低溫期檢測到少量厭氧菌。這可能是由于綿陽豐谷大曲的并曲工藝使曲房空氣的含氧量增加，使得厭氧菌無法生長[18]。

在發酵前期，綿陽大曲和其曲房空氣中革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及嗜熱解氫桿菌的相對豐度呈相反的趨勢變化；瀘州大曲中厭氧菌和革蘭氏陽性菌的相對豐度變化趨勢與曲房空氣相反。這可能是因為大曲和曲房空氣中的微生物相互遷移所造成的，微生物在空氣中因為營養物質和水分的缺乏不能較好地繁殖，但卻棲息著大量的孢子，大曲剛放入曲房、并曲、翻曲以及移庫均會增加空氣中的流動性，此時孢子會隨著空氣的流動四處傳播，在適宜的條件下生長繁殖，隨后又被卷入空氣中，如此循環、交替[25]。

a-瀘州大曲與曲房空氣細菌群落；b-綿陽大曲與曲房空氣細菌群落圖6 大曲及曲房空氣中細菌群落的分布Fig.6 Distribution of bacterial community in Daqu and air

2.5 大曲及曲房空氣細菌群落結構的主成分分析

采用主成分分析法(PCA)對綿陽、瀘州兩區域濃香型大曲及其曲房空氣不同發酵階段的微生物PLFA種類進行分析。結果表明，綿陽地區各階段大曲及其曲房空氣細菌群落在發酵0 d、低溫期和退火期組成相似，與高溫期和儲藏期大曲細菌群落組成差異較大(圖7)，這表明綿陽大曲與曲房空氣細菌群落存在相互影響，且高溫期的高溫和儲存期的低水分對細菌群落結構組成可能有較大影響。瀘州地區濃香型大曲及其曲房空氣細菌群落組成在整個發酵過程中對應組成相似，其中L1-K、L1-D、L2-K、L2-D、L3-K、L3-D在PC1上距離接近，L4-K、L4-D、L5-K、L5-D在PC2上距離接近(圖8)，表明瀘州大曲與曲房空氣在整個發酵過程中存在重要相互作用。兩地大曲及其曲房空氣細菌群落微生物皆在發酵0 d、低溫期組成相似，大曲前期是大曲經過微生物自然接種后進行培菌的重要時期之一，這說明曲房空氣細菌的群落對大曲的發酵有著重要的影響，與羅惠波等[26]研究的結果基本一致。

圖7 綿陽大曲及其曲房空氣PLFA的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of PLFA in the Daqu and air of stacking room of Mianyang

圖8 瀘州大曲及其曲房空氣PLFA的主成分分析Fig.8 Principal component analysis of PLFA in the Daqu and the air of stacking room of Luzhou

3 結論

利用磷脂脂肪酸(PLFA)技術對綿陽、瀘州兩地大曲及曲房空氣在發酵過程中的微生物群落進行研究，并對兩者之間細菌群落結構的差異進行分析，結果如下：(1)兩地大曲及其曲房空氣微生物PLFA種類呈現此消彼長的變化趨勢，且大曲各階段的微生物PLFA種類數高于對應空氣中PLFA種類數，在曲房中能檢測到PLFA種類在對應階段大曲中大致都能檢測到。(2)兩地大曲及其曲房空氣的細菌生物量均呈先升高后降低的趨勢變化，在后火期達到最高值，綿陽大曲曲房空氣細菌生物量在整個發酵過程中均高于瀘州曲房空氣。(3)通過相對豐度比較和主成分分析發現，兩地大曲的優勢菌群表現為嗜熱解氫桿菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，曲房空氣優勢菌群表現為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，且瀘州地區曲房空氣在發酵過程中厭氧菌相對含量較高；綿陽地區濃香型大曲及曲房空氣細菌群落在發酵前期對應組成相似，瀘州地區濃香型大曲及其曲房空氣在整個發酵階段對應組成相似，表明濃香型大曲及其曲房空氣細菌群落存在重要相互影響，且主要發生在發酵前期。

綜合研究結果可得，曲房空氣微生物與大曲微生物在整個發酵過程中處于一種相互轉移的狀態，且可能主要發生在大曲發酵前期，轉移微生物主要表現為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。此外，不同區域濃香型大曲曲房空氣微生物群落組成變化具有其特殊性，這可能是兩地濃香型白酒口感差異的原因之一。曲房空氣微生物對大曲微生物的多樣性具有重要影響，深入研究曲房空氣微生物和對提升大曲質量具有重大意義。