釀酒專用糧基地釀酒玉米生長過程穩定同位素研究

張倩，謝正敏*，安明哲，魏金萍，葉華夏，黃箭

1(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)2(中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室，四川 宜賓，644000)

釀酒原料的品質是白酒品質的基礎，對白酒原料的控制直接影響到白酒成品的最終品質。釀酒生產通過長期經驗發現，當地釀酒原料品種釀造的白酒具有獨特的風味組成，使白酒成品截然不同于其他品牌產品。白酒公司通過建立“釀酒專用糧”種植基地對釀酒原料進行規模化統一種植，以加強對白酒原料的控制來提升保證公司白酒產品的品質[1]。玉米既是世界上人類栽種的重要糧飼兼用作物之一，也是五糧濃香型白酒的重要原料之一。研究者們對影響玉米生長、產量、品質的多方面因素都進行了深入研究[2-7]，但對釀酒專用玉米生長過程各部位碳、氮穩定同位素特征的研究卻少有全面提及。分餾是穩定同位素的自然屬性，同一植物不同生長時期不同部位之間的穩定同位素特征也會存在一定差異。近年來，隨著穩定同位素技術的快速發展，該技術在各種植物不同部位的穩定同位素特征、植物是否有機種植等研究領域都有廣泛應用[8-13]。而在玉米上，以往利用該技術的研究多只提到玉米某生長階段一部分組織的穩定同位素特征[14-16]。本文利用該技術對“釀酒專用糧”種植基地釀酒玉米進行了不同生長階段各部位碳、氮穩定同位素特征的跟蹤分析，以加強對釀酒玉米生長過程的監控，進一步加強對釀酒原料品質的控制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

IAEA-600(咖啡因，國際原子能機構IAEA，基于V-PDB計算δ13C = -27.771 ‰，基于air N2計算δ15N =1.0 ‰)；錫盒(Thermo Fisher公司PN 24 006 400)；肥料(不同肥料δ15N差異大，范圍廣，本文所用肥料信息列于表1)。

GT200球磨儀，格瑞德曼；Delta V Advantage穩定同位素比質譜儀、Flash 2000-HT元素分析儀，Thermo Fisher公司。

樣品：為跟蹤檢測釀酒玉米的生長過程，對“釀酒專用糧”種植基地的釀酒玉米(正紅311)進行了植物不同生長時期的整株(包括根、莖、葉、果實等)取樣，以進行穩定同位素研究，具體取樣情況如下：

(1)標記位置不同的3塊地，每個生長時期的釀酒玉米均在這3塊地內取樣，這3塊地分別位于山頂、山中、山底，海拔總差值不超過200 m；山地區，地塊面積小，每塊地分別取3個不同點的土壤樣(地面下10～20 cm取120～150 g)，分別充分混合，并標記為XJ-T-1，XJ-T-2，XJ-T-3；

(2)收集純營養生長的3葉一心期(未移栽)玉米幼苗3份，編號XJ-1-1，XJ-1-2，XJ-1-3；

(3)在3個地點采集生長發育最旺盛的拔節孕穗期釀酒玉米(長出8～12片葉)各1株，編號XJ-2-1，XJ-2-2，XJ-2-3；

(4)在3個地點采集以生殖生長為中心的開花抽絲期釀酒玉米(雄穗抽出，雌穗苞葉中開始長出花絲)各1株，編號XJ-3-1，XJ-3-2，XJ-3-3；

(5)在3個地點采集生長發育完全結束的成熟釀酒玉米(可收割)各1株，編號XJ-4-1，XJ-4-2，XJ-4-3。

1.2 實驗方法

對以上所取樣品進行多部位取樣、前處理，具體情況如下：

玉米植株取樣分為：A根；B底莖(出土莖取3～5 cm)；C底葉(玉米莖最底1～2片老葉)；D中葉(玉米莖中葉片或玉米苞葉)；E頂莖(取頂葉下莖5～10 cm)；F頂葉(玉米莖頂的葉片或穗位葉)；G雄穗；H果實：I果穗；

土壤：自然風干3個地塊的土壤樣品，球磨儀研磨后待用。

玉米植株：分別摘取玉米植株各部位，蒸餾水清洗后，于烘箱60 ℃烘至恒重，球磨儀研磨后待用。

肥料：于烘箱50 ℃烘至恒重，球磨儀研磨后待用。

用錫盒包裹適量樣品粉末，以IAEA-600為標準品、穩定尿素為質控樣，采用元素分析-穩定同位素比質譜聯用技術(EA-IRMS)檢測樣品；所述元素分析條件為：進樣器He吹掃流量200 mL/min，氧化爐溫度為960 ℃，柱溫60 ℃，載氣He,流量110 mL/min；穩定同位素比質譜條件如下：離子源真空為1.3×10-6mbar，電壓為3.06 kV。

1.3 數據分析

在自然界中，13C/12C、15N/14N變化微小，難以測得其真實值，故采用相對測量法表示樣品中13C/12C、15N/14N，結果以δ(千分差，‰)表示，如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

式中：Rsample C、Rsample N表示樣品中13C/12C、15N/14N值；RV-PDB表示國際基準物質V-PDB的13C/12C值，13C/12C = (11 237.2 ± 90)×10-6；Rair N2表示空氣氮庫的15N/14N值，15N/14N = 0.003 68。本項目中所有數據均基于V-PDB、air N2計算。

2 結果與分析

2.1 釀酒玉米幼苗穩定同位素

釀酒玉米幼苗(未移栽)穩定同位素結果如圖1所示：3個樣品根、莖、葉的δ13C、δ15N均值并不完全相同，有細微區別，但因是在相同條件下、同一地塊內進行的集體育苗，故均集中于-11.7‰～-13.2‰、3.4‰～5.7‰；對于碳穩定同位素，3個樣品均表現出根>莖> 葉δ13C的趨勢，這可能是因為在幼苗期，玉米主要是生根發芽，根部生長很快，地表部分發育速度緩慢，使得根部更有利于富集13C，符合C-4植物的碳穩定同位素特征；而氮穩定同位素不同于碳，表現出莖>葉> 根δ15N的趨勢，這主要是因為植物通過根吸收的氮素一部分被根同化，由于14N活性優于15N，植物進行生命活動時會優先同化14N，使植物根氮穩定同位素偏負，剩余部分氮穩定同位素偏正[14]。

a-δ13C；b-δ15N圖1 玉米幼苗穩定同位素Fig.1 The stable isotope ratios of maize seedlings

2.2 拔節孕穗期釀酒玉米穩定同位素

將集體育苗的釀酒玉米幼苗分別移栽，移栽土壤、施肥信息如表1所示。3個不同地塊的土壤樣各為每塊地內3個不同點的土壤，各自擁有不同性狀，每個樣平行測量3次，取平均值。對拔節孕穗期釀酒玉米穩定同位素進行檢測，3組樣品每組平行測量3次，取平均值，檢測結果列于圖2。

表1 釀酒玉米移栽土壤、施肥信息Table 1 The soil and fertilization informations of liquor-making maize transplantation

移栽到3個不同土壤的拔節孕穗期釀酒玉米各部位δ13C均集中在-11.2‰～-13.7‰，與移栽前幼苗期相比并無明顯差異，與3塊地土壤δ13C(<-21‰)相比差異顯著，這是因為植物δ13C受其光合碳代謝途徑和環境因子共同影響[17]，以C-4循環為光合碳代謝途徑的植物δ13C多集中于-11‰～-15 ‰，土壤碳穩定同位素組成對其不具顯著性影響。圖2顯示3株釀酒玉米各部位δ13C均值的表現并不完全一致，底莖δ13C、根δ13C、中葉δ13C趨勢不明顯，但總的來說拔節孕穗期玉米葉、莖生長迅速，使得頂葉、頂莖更易富集13C，形成頂葉>頂莖>底莖、中葉、根>底葉δ13C的規律。

圖2顯示移栽后，3株拔節孕穗期釀酒玉米各部位δ15N分別處于-1.5‰～4 ‰、2.9‰～6‰、-2.8‰～0‰，與幼苗期(3.4‰～5.7‰)相比，各具差異；對比相應土壤及肥料δ15N均值，發現此時期釀酒玉米δ15N更受肥料影響；除了底葉δ15N規律不明顯外，其他部位δ15N均表現出底莖>頂莖>頂葉>中葉>根δ15N的趨勢。

a-δ13C；b-δ15N圖2 釀酒玉米拔節孕穗期穩定同位素Fig.2 The stable isotope ratios of liquor-making maize at jointing-booting stage

2.3 開花抽絲期釀酒玉米穩定同位素

收集開花抽絲期釀酒玉米樣品，對其各部位δ13C，δ15N進行檢測，每個樣品平行檢測3次，取平均值，結果如圖3所示。此階段釀酒玉米各部位δ13C均集中在-11.0‰～-13.2‰，與前兩時期相比并無明顯差異。

a-δ13C；b-δ15N圖3 釀酒玉米開花抽絲期穩定同位素Fig.3 The stable isotope ratios of liquor-making maize at flowering-silking stage

開花抽絲期釀酒玉米，所有葉片均已展開，植株定長，營養生長基本停止，進入以生殖生長為中心的階段，此段時間營養集中累積到玉米植株的生殖器官(果穗、雄穗)上，使之快速生長。由圖3可知，此時期釀酒玉米各部位δ13C均值均表現出果穗>雄穗>頂莖>頂葉>根> 底莖>中葉>底葉δ13C的趨勢，說明處于快速生長狀態的果穗、雄穗更易富集13C，形成穗>莖、葉、根δ13C的規律。不同于δ13C規律，開花抽絲期釀酒玉米各部位δ15N均值均表現出底莖>底葉、中葉>頂莖、果穗>頂葉>雄穗>根δ15N的趨勢，總的來說呈現莖、葉>穗> 根δ15N的規律。

2.4 成熟期釀酒玉米穩定同位素

收集了成熟釀酒玉米樣品，此階段底葉、中葉均已干枯掉落，故沒收集底葉、中葉數據。成熟期釀酒玉米干物質積累已停止，植株主要是脫水，可觀察到收集到的樣品多部位已干枯發黃，但籽粒生長狀況比較好。對樣品其余各部位δ13C、δ15N進行檢測，每個樣品平行檢測3次，取平均值，結果示于圖4。此階段釀酒玉米各部位δ13C均集中在-11.3‰～-13.0‰，與前三時期相比并無明顯差異。圖4顯示，山頂、山中、山底3塊地上的成熟期釀酒玉米各部位δ13C均值均表現出果實>雄穗>頂莖>根>底莖>頂葉δ13C的趨勢，說明經過整個生命過程后，釀酒玉米的果實富集到最多13C，形成果實>莖、根、葉δ13C的規律。而釀酒玉米各部位δ15N均值，除了根δ15N規律不明顯外，其他部位表現出底莖>果實>頂葉>頂莖>雄穗δ15N的趨勢。

a-δ13C；b-δ15N圖4 成熟期釀酒玉米穩定同位素Fig.4 The stable isotope ratios of liquor-making maize at maturity stage

另外，采集了3塊地上其他釀酒玉米植株的果實樣品各2個，平行檢測3次，取平均值，檢測結果列于圖5。由圖5可知，山頂、山中、山底釀酒玉米果實δ13C 波動不大，均集中于-11.9‰～-11.2‰；而果實δ15N顯示出不同現象：同一塊地內，3個果實δ15N波動不大，但不同地內，果實δ15N差距明顯；山頂、山中地內釀酒玉米果實δ15N均大于+2.0 ‰，而山底地內釀酒玉米果實δ15N均小于-1.5 ‰。這是因為山頂、山中田地施有機肥，而山底田地施非有機肥；研究表明非有機肥δ15N約為-2‰～2‰，有機肥δ15N約為0.6‰～36.7 ‰[18]，過多使用非有機肥會使植物δ15N貧化，而有機肥對15N有富集作用，植物利用后，15N會進一步富集，造成3塊地內釀酒玉米果實δ15N表現不同。

a-δ13C；b-δ15N圖5 釀酒玉米果實穩定同位素Fig.5 The stable isotope ratios of liquor-making maize fruits

3 討論

檀文炳等[19]發現北京東靈山(海拔400～2 300 m)C-4植物葉片δ13C隨海拔高度的增加逐漸變重，釀酒玉米屬于C-4植物，在圖2拔節孕穗期中也表現出相似的規律：各部位δ13C均隨著海拔高度的增加(從山底XJ-2-3到山頂XJ-2-1)逐漸變重，這可能是因為隨著海拔高度的增加，環境大氣壓下降，植物葉片內外CO2的分壓差異變小，造成植物體內碳穩定同位素的分餾作用變小，最終造成這一規律[20]。然而這一規律并未在圖3開花抽絲期和圖4成熟期中出現，這可能是因為除了海拔高度，植物δ13C還受到壓力、光照、可利用水量、溫度等因素影響[20]，雖然3個取樣地點沒變，但隨著取樣時間從初春逐步過渡到夏天，3個取樣地點的其他環境因素出現了不一樣的變化，使得海拔高度因素在這2個生長時期未對釀酒玉米δ13C造成顯著影響?？傊０胃叨仍诒疚闹形磳︶劸朴衩爪?3C產生顯著影響。

表2顯示不同生長時期釀酒玉米擁有不同穩定同位素規律，總的來說，13C最易富集在生長旺盛的部位；而15N/14N最易在莖部(特別是底莖)富集(與以往研究[14-15]的結果一致)，在根部貧化。

表2 不同生長時期釀酒玉米穩定同位素規律Table 2 The stable isotope ratio regularities of liquor-makingmaize at different growth stages

釀酒玉米移栽不同土地、施不同肥后底莖、底葉δ15N的情況如圖6所示。縱觀釀酒玉米整個生長過程，發現在集體育苗的幼苗期，釀酒玉米莖、葉δ15N分布集中，無明顯區別；移栽到不同土地、施不同肥后，各部位δ15N出現了不同分化：其他部位δ15N分化不具明顯趨勢，而底莖、底葉δ15N，無論是在拔節孕穗期，還是在開花抽絲期，施有機肥的山頂、山中地內，其都如果實δ15N一般大于+2.0 ‰，施非有機肥的山底地內，其均小于0 ‰。綜合圖5、圖6結果，說明釀酒玉米底莖、底葉和果實δ15N對施肥情況比較依賴：多施有機肥，有利于釀酒玉米富集15N/14N，使底莖、底葉、果實δ15N偏高；多施非有機肥，不利于釀酒玉米富集15N/14N，使底莖、底葉、果實δ15N偏低。這與CHOI等[15]的研究結果“種植70 d后，施有機肥(豬糞肥)的玉米葉片δ15N和玉米粒δ15N明顯高于施非有機肥(尿素)；施不同肥的玉米根δ15N、莖δ15N的差異不顯著”不完全一致。造成本文與CHOI等[15]在玉米莖δ15N結論上不一致的可能原因有：種植環境條件不一樣，本文是在多變的實際種植環境中進行的，CHOI等[15]是在穩定的實驗室種植環境中進行的；取玉米莖的位置可能不一樣，本文在頂莖δ15N和底莖δ15N上的結論就不同。

a-釀酒玉米底莖δ15N;b-釀酒玉米底葉δ15N圖6 釀酒玉米底莖、底葉δ15NFig.6 The δ15N in bottom stem and bottom leaf of liquor-making maize

4 結論

隨著消費者對濃香型白酒品質要求的提高，研究者們不斷地深入對濃香型白酒原料和生產工藝的研究，釀酒原料的品質直接影響著濃香型白酒的品質。肥料的差異導致了釀酒玉米底莖、底葉、果實δ15N的表現不同；生長過程中的同位素自然分餾效應導致了釀酒玉米各部位δ13C在不同生長時期的不同差異。本文在對釀酒專用糧食基地玉米生長過程的監控中，提供了初步理論數據；并在加強對白酒原料品質的控制，進而加強對濃香型白酒品質的控制中，貢獻了一份力量。鑒于本文是在釀酒玉米單次施肥條件下得到的結果，故要實現這個監控可能性還需收集更多更細致的實驗數據，如釀酒玉米植株在不同生長時期施不同肥后，不同部位δ15N的表現以及土壤硝態氮δ15N、銨態氮δ15N、有機氮δ15N、營養物質含量的變化等。