碳源對凝結芽孢桿菌耐酸特性的影響及其機制研究

李長福，吳影,2,3，周子呂，曹力,3，王大紅,2，古紹彬,2,3*

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)2(河南省食品微生物工程技術研究中心，河南 洛陽，471023)3(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽，471023)

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一種能產乳酸的革蘭氏陽性菌，生長繁殖迅速，兼具乳酸菌和芽孢桿菌的諸多益生特性[1]。凝結芽孢桿菌芽孢具有的優良抗逆性使其可廣泛應用于食品加工中，并能簡化益生菌產品的存儲運輸條件以及延長貨架期[2]。益生菌要發揮其益生功能須能經過極端酸環境的胃部到達弱酸環境(pH 4～6)的腸道內進行生長繁殖，并保持足夠的活菌數[3]。人體胃液主要成分為胃酸，pH受個人身體狀況和飲食習慣影響，其空腹pH值約為2，進食后由于稀釋作用可升至3.5[4]。食物進入胃部后停留時間為1～3 h，只有極少部分能夠抵抗極端酸環境的微生物才能通過胃部發揮益生作用[5]。絕大多數的微生物因為缺乏耐受低pH環境的相關調節機制，在經胃部酸環境時大量H+進入菌體細胞，引起細胞酸化，進而影響細菌正常生長與代謝，導致菌體死亡。

研究發現，營養組成和培養條件對微生物的耐酸能力有顯著影響[6]。菌體細胞在酸性環境下保持胞內pH穩態的一個重要調節途徑是細胞膜對H+的低透過性。細菌受到酸環境刺激后細胞膜脂成分會發生相應變化以抵御不良環境造成的影響。吳重德等[7]發現細胞膜中不飽和脂肪酸比例增加以及平均碳鏈增長會降低細胞膜的流動性，有利于細胞將過多的H+阻擋在胞外，維持胞內pH穩態，從而誘發干酪乳桿菌耐酸能力的變化。陳霞等[8]研究發現H+-ATPase與干酪乳桿菌耐酸性有關，一些陽離子轉運ATP酶(如K+-ATP酶)可通過細胞H+和K+的交換，維持細胞內pH的穩定[9]。谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、γ-氨基丁酸(GABA)、鳥氨酸(Orn)、天冬氨酸(Asp)、賴氨酸(Lys)等胞內氨基酸水平發生變化，被認為是微生物耐酸能力變化的主要代謝表征[3, 10-12]。

碳水化合物(碳源)是食物中三大營養成分之一，其進入腸道后也是腸道微生物生長代謝過程中合成細胞碳架及為細胞生命活動提供能量的重要營養物質[13]。不同的碳水化合物及其分解產物，在腸道中與益生菌等腸道微生物接觸時，是否影響微生物生長代謝行為及益生特性呢？眾所周知，由于基質不同，所誘導微生物產生的代謝酶系也存在顯著差異，形成的代謝產物也可能存在較大差異，進而誘發菌體呈現出不同的生理及代謝特征。本研究旨在通過實施胞外碳源擾動實驗，分析凝結芽孢桿菌在酸脅迫下生理代謝的響應情況及耐酸能力變化情況，初步揭示碳源變化與菌體耐酸性能間的關系。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

凝結芽孢桿菌(BacilluscoagulansCGMCC 9951)，實驗室分離保藏菌株。

液體培養基(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨15，酵母粉10，MgSO45，pH 8.0。固體培養基再添加20 g/L的瓊脂粉。

不同碳源酸性培養基：以液體培養基為基礎將葡萄糖替換為其他相同質量體積比(g∶L)的碳源(蔗糖、乳糖、麥芽糖、檸檬酸、果糖)，用稀鹽酸將pH調至pH 3.5。

ATP含量試劑盒、總蛋白定量測試盒(BCA法)：南京建成生物工程研究所；37種脂肪酸混標：上海安譜實驗科技股份有限公司；42種游離氨基酸混標：德國曼默博爾公司。

1.2 儀器與設備

7890A型氣相色譜儀(配FID氫火焰檢測器)，美國安捷倫科技有限公司；A300型全自動氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；UV2100型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 凝結芽孢桿菌CGMCC9951的培養

將凍存于-80 ℃的凝結芽孢桿菌CGMCC 9951接種到培養基中，37 ℃振蕩培養16～20 h，活化傳代2次，備用。

1.3.2 不同碳源耐酸性能檢測

取活化好的菌液，離心洗滌3次后用相同體積生理鹽水重懸。按3 %接種量分別接種于不同碳源的酸性培養基中，培養3 h，然后取樣采用平板稀釋涂布法進行涂布計數。

1.3.3 胞內氨基酸測定

取20 mL活化好的菌液，離心洗滌后加入不同碳源的酸性培養基中培養3 h，然后用磷酸緩沖液離心洗滌(3 000 r/min，4 ℃，5 min)3次，棄上清重懸于1 mL相同緩沖液中。沸水浴15 min，離心(112 40 r/min,4 ℃,10 min)，取上清800 μL，加200 μL 100 g/L磺基水楊酸，混合均勻。4 ℃靜置60 min，14 500 r/min冷凍離心15 min，取上清相同操作離心5 min，用樣品稀釋液等比例稀釋后經0.22 μm過濾器過濾后上機分析。氨基酸含量表示為每克細胞(干重)所含氨基酸數，μg/g。

1.3.4 ATP含量測定

根據ATP含量測定試劑盒所提供的試驗方法和步驟測定凝結芽孢桿菌酸培養3 h后胞內ATP的含量。ATP含量表示為μmol/g prot。

1.3.5 細胞膜脂肪酸測定前處理

取20 mL活化好的菌體，加入不同碳源酸性培養基中培養3 h，然后用超純水離心洗滌(10 000 r/min，4 ℃，5 min)3次，棄上清后向沉淀中加入1.5 mL 1 mol/L 甲醇鈉振蕩1.5 min，4 ℃靜置10 min，加入1 mL 正己烷，振蕩1 min，靜置5 min，取上層有機相過膜后上機測定細胞膜脂肪酸。碳鏈長度參考文獻[7]的方法進行。

1.3.6 氣相色譜檢測

采用安捷倫7890A型氣相色譜儀。色譜柱：HP-88毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.20 μm)；升溫程序：程序升溫至140 ℃保持5 min，以2.5 ℃/min速率升至180 ℃保持3 min，然后1 ℃/min升至196 ℃保持10 min，最后5 ℃/min升至240 ℃保持10 min；載氣N2，進樣量1 μL。定性采用標準品對照法，定量采用面積歸一化法。

1.4 數據處理

圖表采用OriginPro 2017軟件繪制，數據采用IBM SPSS Statistics 22軟件進行統計分析，多重比較采用Duncan新復極差法分析。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌存活的影響

如圖1所示，酸脅迫下，添加不同碳源的凝結芽孢桿菌耐酸能力依次是：果糖>葡萄糖>蔗糖>麥芽糖>檸檬酸>乳糖。其中，以果糖作為碳源時，菌體的耐酸能力與對照組相比提高了21%，是蔗糖組的1.69倍，檸檬酸組的27.84倍，乳糖組的35.63倍。楊郁等[6]研究發現，在人工胃液中添加葡萄糖后，干酪乳桿菌T-32的存活率比未添加葡萄糖的對照組提高了118.10倍。郭澤鑌[14]研究發現，在pH 2.5酸性處理3 h 的條件下，超高壓處理后的蓮子淀粉可使雙歧桿菌存活率由葡萄糖組的61.31%提高至72.84%。由此可見，碳源種類對菌體的耐酸能力有直接影響。可能由于不同碳源進入細胞后誘導微生物產生的代謝酶系存在顯著差異，其在胞內的代謝途徑及形成的代謝產物也存在較大差異，引起與酸耐受直接相關的能量代謝水平，細胞膜脂組成，胞內氨基酸代謝等的顯著變化，從而使菌體酸耐受能力發生改變。

2.2 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌胞內ATP含量的影響

碳源為微生物的生命活動提供所需的能量。有報道指出乳酸菌在酸性環境中可利用質子泵F0F1-ATPase消耗能量ATP排出胞內H+，維持胞質pH正常[11]。酸脅迫下，不同碳源對凝結芽孢桿菌胞ATP含量的影響如圖2所示，以蔗糖和果糖作為碳源時，胞內ATP含量較高，分別達到了6.925 0 μmol/g prot

圖1 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌存活的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on the survivalof Bacillus coagulans under acids tress注：“*”代表差異顯著.P<0.05；“**”代表差異極顯著，P<0.01。

和5.818 1 μmol/g prot，檸檬酸組ATP含量最低，為0.828 2 μmol/g prot。其中果糖組ATP含量是葡萄糖組1.95倍，是檸檬酸組7.02倍。由于蔗糖水解為葡萄糖和果糖后分別進入葡萄糖代謝途徑和果糖代謝途徑，果糖代謝不經過糖酵解途徑中由磷酸果糖激酶(EC∶2.7.1.11)催化的限速反應步驟，同時1-磷酸果糖是丙酮酸激酶(EC∶2.7.1.40)的激動劑，產生大量的ATP[15]。半乳糖則需經5步反應才能生成葡萄糖-6-磷酸，產生ATP，因此ATP生成速率受到一定影響。盡管檸檬酸是三羧酸循環中的中間物質，但實驗結果顯示，在所有碳源中檸檬酸所產生的ATP含量最低，主要是高濃度的檸檬酸對菌體產生明顯的抑菌作用[16]。KOPONEN等[11]研究發現，在酸脅迫下，乳酸菌F0F1-ATPase酶中F1復合體的全部或部分亞單位表達均上調。KULLEN等[17]證實，pH 3.5的酸脅迫處理嗜熱乳桿菌60 min，可使嗜熱乳桿菌F0F1-ATPase轉錄水平提高約2倍。因此，酸脅迫下，高水平的F0F1-ATPase表達量和高濃度的ATP能量水平對維持胞內穩定的pH環境，提高菌體耐酸能力具有重要作用；不同碳源由于其代謝方式不同，產生ATP的含量和速率有一定差異，進而影響菌體對酸脅迫的耐受能力。

圖2 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌胞內ATP含量的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on intracellularATP content of Bacillus coagulans under acid stress注：圖中不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05。

2.3 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌膜脂組成的影響

脂肪酸是細胞膜的重要組成成分，脂肪酸的比例以及飽和程度等對細胞膜的流動性和通透性具有顯著影響[18]，而細胞膜的流動性和通透性對細胞的新陳代謝和維持細胞穩定的內環境發揮著至關重要的作用。表1為酸脅迫下不同碳源對凝結芽孢桿菌細胞膜脂肪酸組成及百分含量，與正常培養(pH 8.0)的對照組相比，酸脅迫組的脂肪酸組成發生了較大變化，其中以果糖、乳糖等為碳源時，十七烷酸百分含量分別增加至61.87%和61.70%，總飽和脂肪酸(SFA)百分含量分別下降為73.51%和73.67%，總不飽和脂肪酸(UFA)百分含量分別上升至26.49%和26.33%，SFA/UFA比值下降至2.77和2.80，平均碳鏈長度分別增長至16.18和16.17。BROWN和楊揚等[19-20]發現,十七烷酸含量的顯著增加能夠提高大腸桿菌耐酸能力及抗高密度二氧化碳(DPCD)脅迫。吳重德等[7]證實酸脅迫干酪乳桿菌45 min后，細胞膜脂碳鏈長度由15.55增加至16.53。SCHOUG等[21]觀察到棒狀乳桿菌pH值從5.5降至4.5后，SFA/UFA比值由0.86下降至0.51，可減少由酸脅迫引起的氧應激對細胞產生的損傷[7]。楊旭[22]研究發現，脂肪酸平均碳鏈長度增長將有助于雙歧桿菌提高酸抵抗能力，主要是由于長鏈更容易跨越磷脂雙分子層使膜趨于凝膠狀，從而促使細胞膜流動性降低。因此，酸脅迫后細菌凝結芽孢桿菌細胞膜SFA/UFA比值下降及平均碳鏈長度增長，都導致細胞膜的流動性降低，從而有利于細胞將過多的H+阻擋在胞外，維持胞內pH穩態。

2.4 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌胞內氨基酸含量的影響

研究發現，胞內較高的Glu、Gln、Arg、Orn等氨基酸水平對提高微生物抵御環境脅迫的能力及調控胞內pH穩定等具有重要作用[23]。酸脅迫下，不同碳源對凝結芽孢桿菌胞內氨基酸水平的影響如表2所示，以果糖為碳源時，與酸耐受性相關的6種氨基酸Glu、Gln、Arg、Orn、Asp和Lys的含量均顯著高于其他5組(P<0.05)，分別達到了597.23、44.30、167.16、127.98、178.46和409.05 μg/g。蔗糖組中，上述6種氨基酸含量均顯著高于麥芽糖、檸檬酸和乳糖組。而當以乳糖為碳源時，Asp、Arg、Lys含量最低，僅為54.94、69.24和158.75 μg/g。結合圖1結果分析，不難發現，不同碳源條件下，菌體耐酸能力與上述氨基酸的胞內水平呈現明顯相關性。

表1 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌膜脂組成的影響Table 1 Effects of different carbon sources on membrane lipid composition of Bacillus coagulans under acid stress

注：C6∶0，己酸；C8∶0，辛酸；C14∶0，肉豆蔻酸；C14∶1，肉豆蔻烯酸；C15∶1，十五碳烯酸；C16∶0，棕櫚酸；C16∶1，棕櫚油酸；C17∶0，十七烷酸；C18∶0，硬脂酯酸；C18∶1T，反油酸；C18∶1，油酸；SFA，飽和脂肪酸；UFA，不飽和脂肪酸；“-”表示未檢出；同行不同字母表示差異顯著水平(P<0.05)。下同。

表2 不同碳源對酸脅迫下凝結芽孢桿菌胞內氨基酸含量的影響Table 2 Effects of different carbon sources on intracellular amino acid content of Bacillus coagulans under acid stress

3 結論

研究發現，在酸性環境下，不同碳源可通過影響凝結芽孢桿菌CGMCC9951細胞膜成分及組成比例，增加十七烷酸和總不飽和脂肪酸含量，提高胞內ATP含量，產生更高水平的與耐酸相關氨基酸(如Glu、Arg、Asp、Lys)等方式提高凝結芽孢桿菌耐酸能力。同時還發現，由于果糖代謝可不經過磷酸果糖激酶催化的限速反應，且1-磷酸果糖是丙酮酸激酶的激動劑，從而加速果糖在體內的代謝速率，這對提高菌體的耐酸能力具有重要作用。因此，在使用凝結芽孢桿菌時，輔以果糖或含有果糖的食物可大幅度提高凝結芽孢的酸抵抗能力，這將有利于其進入腸道發揮益生作用。

此外，大量實驗研究證實酸脅迫使菌體產生應激蛋白，同時菌體通過質子泵排出H+和產生堿性物質中和胞內過多的H+過程均需要特定酶的參與來完成；有關凝結芽孢桿菌在酸性環境下哪種應激蛋白、伴侶蛋白和產堿酶參與耐酸調控，這都將是本研究在后續工作中持續關注的問題。