肝細胞癌中外泌體ncRNAs的研究進展

招文婷，文 彬，孫嘉玲，楊雪梅，陳煒聰，孫海濤，賀松其

(1.南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515；2.中國人民解放軍四五八醫院中醫科，廣東 廣州 510602)

全世界大約75%～85%的肝癌是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，HCC是全球第六大最常見的癌癥，也是全球癌癥相關死亡的第四大常見原因。HCC在我國惡性腫瘤的發病率和病死率分別為第4位和第3位，其預后差且復發風險高[1]。目前，HCC的診斷手段較局限，易遺漏早期小腫瘤；而HCC的傳統治療方法，療效欠佳。因此，HCC患者需要有效的診治及監測腫瘤進展的方法。近年來，研究發現外泌體在各種癌癥，尤其是HCC中，發揮著重要的生物學功能。腫瘤微環境是HCC的重要組成部分，外泌體作為一種膜結合載體，可被受體細胞吸收，在HCC腫瘤微環境中發揮細胞通訊作用，從而調控HCC的發生發展。

1 外泌體ncRNAs的生物學特性

外泌體是由活細胞釋放的直徑為30～100 nm的膜狀細胞外囊泡，存在于血液、尿液和唾液等各種體液中，其內含核酸、蛋白質和脂質等生物活性分子[2]。外泌體可通過細胞間直接接觸、質膜融合或受體介導的內吞作用等方式，發揮細胞通訊作用，將核酸等生物活性成分傳遞到受體細胞中，調節受體細胞的行為，發揮生物學功能。外泌體中的非編碼RNA(no coding RNA,ncRNA)是一類沒有蛋白編碼能力的RNA，如微小RNA(micro RNA，miRNA)，長鏈非編碼RNA(long no coding RNA，lncRNA)，環狀RNA(circular RNA，circRNA)。ncRNAs通過與DNA、RNA或蛋白質相互作用，可以調節基因的轉錄表達，轉錄后表觀遺傳水平和調節細胞進程。其中，miRNA是由20～24個核苷酸RNA組成的小RNA，成熟的miRNA通過與靶mRNA的3′非翻譯區(3′-UTR)結合，從而在轉錄后水平調控靶基因的表達，進而導致mRNA降解或靶mRNA的翻譯抑制[3]。lncRNA是一類分子大于200 bp的轉錄物，通過與DNA、RNA或蛋白質相互作用，參與腫瘤的發生發展等一系列生物學過程。circRNA與線性RNA不同，是無5′帽和3′尾多腺苷酸化特殊的共價閉合連續環，這種結構使得其較線性mRNA對RNA酶具有更高的耐受力，可充當miRNA的海綿體起到調節基因表達的作用，是腫瘤發生發展的關鍵因子[4]。

2 外泌體ncRNAs調節腫瘤微環境，促進HCC進展

腫瘤微環境由腫瘤細胞、成纖維細胞、免疫細胞、內皮細胞等細胞成分，以及細胞外基質、生長因子、炎性細胞因子、蛋白水解酶和其抑制劑等非細胞成分組成[5]。腫瘤細胞的惡性行為不僅取決于自身，還受到腫瘤細胞與腫瘤微環境相互作用的調節，外泌體可發揮其細胞間通訊作用，充當腫瘤微環境中細胞間通訊的關鍵介質，介導腫瘤細胞與其微環境之間相互作用。越來越多的研究發現，ncRNAs作為外泌體內重要的生物活性分子，可有效調控HCC腫瘤微環境，包括參與HCC腫瘤生長、促進腫瘤侵襲轉移、誘導血管形成、調節免疫反應等過程，從而影響HCC發生發展進程。

2.1 外泌體ncRNAs促進HCC生長既往對細胞間通訊的研究主要是聚焦在信號蛋白分子，但目前核酸分子作為細胞間的信使被越來越多的關注。然而RNA釋放在細胞外容易被RNA酶降解，因此，外泌體作為RNA的轉運載體，可有效防止RNA降解，更好發揮細胞間通訊作用。腫瘤細胞在進化過程中通過外泌體將致癌的ncRNAs轉移至受體細胞，穩定傳遞生物信號，促進腫瘤生長。來自人肝星狀細胞LX2的外泌體過表達的miR-335-5p可被受體HCC細胞吸收，在體外抑制HCC細胞增殖并抑制體內腫瘤生長；但進一步的研究發現，當LX2分別與4種HCC細胞系(MHCC97L，MHCC97H，Huh7和HepG2細胞)中的任何一種共培養時，觀察到這些成纖維細胞以及HCC細胞中miR-335-5p的下調，從而促進HCC的增殖和生長[6]。此外，對來自HCC患者的癌相關成纖維細胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)和相應的癌旁成纖維細胞的外泌體進行miRNA測序，發現CAF衍生的外泌體中miR-320a水平顯著降低，體內外研究表明，miR-320a可通過直接與下游靶標PBX3結合，上調細胞周期蛋白依賴性激酶2，從而抑制HCC細胞增殖生長[7]。Zhang等[8]發現，脂肪細胞分泌的circRNA可調節HCC中的去泛素化，從而促進HCC細胞生長。研究發現，外泌體與泛素化相關的環狀RNA circ-DB在體脂高的HCC患者上調，circ-DB通過抑制miR-34a并激活與去泛素化相關的USP7 / Cyclin A2信號通路促進肝癌細胞生長，減少DNA損傷。這些研究結果表明，外泌體ncRNAs可通過細胞通訊作用促進HCC細胞的生長。

2.2 外泌體ncRNAs促進HCC轉移HCC轉移是HCC發展進程中的重要環節，外泌體ncRNAs可通過介導上皮間質轉化、細胞外基質降解和血管滲漏等生物過程促進HCC侵襲轉移。外泌體ncRNAs可介導HCC細胞上皮間質轉化，即使腫瘤細胞失去上皮表型獲得間質表型，導致細胞間粘附減少，運動性增強，最終引起腫瘤侵襲轉移。lncRNA FAL1在HCC來源的外泌體中上調，而lncRNA FAL1可以充當miR-1236的海綿體，增加EMT中的關鍵轉錄因子ZEB1的表達，促進HCC轉移[9]。Han等[10]發現外泌體的關鍵調節因子Vps4A在HCC組織中經常被下調，而Vps4A可促進細胞內抑制腫瘤的miRNA的積累和攝取。進一步研究發現，Vps4A通過與CHMP4B和β-連環蛋白的相互作用，促進β-連環蛋白的質膜定位和外泌體釋放，降低β-catenin在細胞核內的表達，抑制HCC細胞上皮間質轉化。Zhang等[7]發現，miR-320a過表達可降低PBX3和磷酸化ERK1/2的水平，并同時增強E-鈣粘蛋白的表達和降低N-鈣粘蛋白的表達，而HCC患者中CAFs衍生的外泌體中miR-320a水平顯著降低，最終通過以上機制促進HCC上皮間質轉化。高轉移特性的肝癌細胞LM3細胞衍生的外泌體傳遞circPTGR1，通過circPTGR1-miR449a-MET途徑增強HepG2細胞(非轉移性細胞系)和97 L細胞(低轉移細胞系)遷移和侵襲能力[11]。

外泌體可以通過介導細胞外基質的降解，最終促進HCC侵襲轉移。高度轉移性HCC細胞系的外泌體中內含met、caveolin和S100等蛋白質，通過共培養，正常肝細胞系MIHC攝入外泌體后，增強了MIHC的遷移和侵襲潛能，并且發現MIHC細胞內Akt，磷酸化的MEK1/2和金屬蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的表達亦顯著增加[12]。腫瘤轉移的發生需要腫瘤細胞穿越內皮屏障，從血管滲漏，進入循環系統，到達靶器官中生長。外泌體ncRNAs可通過靶向調節基因表達，破壞內皮完整，促進腫瘤細胞穿越內皮屏障。Fang等[13]用來自表達穩定miR-103的HCC細胞的外泌體預處理內皮單層細胞，最終促進了腫瘤細胞的跨內皮侵襲，并且通過抑制內皮細胞中的miR-103消除了外泌體的這種作用，進一步研究發現肝癌細胞分泌的外泌體miR-103通過靶向調節VE-鈣黏蛋白，p120-連環蛋白和閉鎖小帶1來破壞內皮細胞結合的完整性，削弱血管屏障，促進HCC細胞的跨內皮侵襲，從而促進HCC侵襲轉移。

2.3 外泌體ncRNAs促進HCC血管生成血管生成可為腫瘤細胞提供足夠的營養和氧氣，是腫瘤生長和轉移的關鍵步驟。HCC或CAFs衍生的外泌體ncRNAs可釋放血管內皮生長因子(VEGF)等可溶性因子促進血管生成，為HCC提供充足的營養，促進其發生發展。研究表明癌癥干細胞樣CD90+肝癌細胞衍生的外泌體表達高水平的lncRNA H19，可顯著增加VEGF的釋放和VEGF-R1的產生，促進血管生成，lncRNA H19沉默后，VEGF蛋白的表達水平明顯降低[14]。腫瘤來源的外泌體miRNA-21可以通過下調磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologous，PTEN)，將肝星狀細胞轉化為CAFs，并激活PDK1/AKT信號傳導途徑促進CAFs釋放VEGF等血管生成細胞因子促進血管生成[15]。低氧可以刺激HCC細胞分泌含有miR-155的外泌體，從而促進血管生成，并且外泌體miR-155的水平與HCC樣本中VEGF和HIF-1α的表達呈正相關[16]。因此，外泌體ncRNAs可通過激活相關通路，促進血管內皮生長因子的生成來調節腫瘤微環境中的血管重構，從而促進腫瘤血管生成。

2.4 外泌體ncRNAs調節HCC免疫反應癌癥的發展與腫瘤免疫微環境密切相關，通過調節免疫反應，腫瘤可以逃避免疫破壞。腫瘤細胞可以通過外泌體將致癌的ncRNAs轉移至免疫細胞，以誘導抑制T效應細胞等免疫抑制細胞的活性，最終導致局部或全身性免疫抑制。肝癌表現出的高度惡性、總體生存結果差與宿主免疫反應的抑制密切相關，肝癌細胞釋放的外泌體可以抑制患者的免疫系統，并為轉移性擴散做好準備。外泌體miR-23a-3p可以從內質網應激的HCC細胞向巨噬細胞轉移，通過抑制PTEN激活PI3K-AKT途徑，增加PD-L1表達并抑制T細胞活化，導致腫瘤免疫逃逸[17]。Liu等[18]研究發現，外泌體衍生的HMGB1激活B細胞，通過Toll樣受體2/4和絲裂原活化蛋白激酶信號傳導途徑促進TIM-1+Breg細胞擴增，表達高水平的免疫抑制細胞因子IL-10，并表現出對CD8+T細胞的強抑制活性，從而促進肝細胞癌免疫逃逸。在另一項研究中，源自HCC的外泌體lncRNA TUC339可調節巨噬細胞，導致IL-1β、TNF-α等促炎性細胞因子生成降低，吞噬作用受損以及M2極化，從而促進HCC進展[19]。

3 外泌體ncRNAs可作為HCC診斷和預后的生物學標志物

早期診斷可以改善HCC患者的臨床結局，因為早期HCC可以進行根治性切除或肝移植，且術后生存率較高。目前，HCC的診斷分為病理診斷和臨床診斷，臨床診斷除患者病史外，要結合腹部超聲、計算機成像、磁共振等影像學檢查以及甲胎蛋白檢測，但通過以上方法，易遺漏早期的小腫瘤。因此，需要更有效的生物標志物來改進小腫瘤的篩查。外泌體中的ncRNAs，因其被外泌體的雙層脂質膜包裹，不受RNA酶的影響，在血清穩定，且在血清、尿液、唾液等各種體液中廣泛存在，是液體活檢的理想標本，因此，可成為HCC診斷的生物學標志物。Sohn等[20]研究表明，HCC患者的外泌體miR-18a、miR-222、miR-221和miR-224的血清水平顯著高于慢性乙型肝炎或肝硬化患者。此外，與外泌體miRNA不同，血清循環miRNA在慢性乙型肝炎組和HCC組之間沒有顯示出明顯的差異。表明外泌體miRNA比血清miRNA敏感性、特異性更高。在大鼠模型的HCC發育過程中，在不同階段檢測到四種失調最明顯的miRNA，其中，miR-10b、miR-21減少，miR-122和miR-200a增加。在HCC早期，血清和血清外泌體中的4個miRNA比血清AFP改變更顯著。接受者操作特征(ROC)分析的結果表明，AFP、miRNA-10b、miRNA-21、miRNA-122和miRNA-200a的組合產生的最高曲線下面積(AUC)為0.993，這可能成為早期診斷HCC的更好方式[21]。此外，血清外泌體lncRNA HEIH的表達水平在HCV相關的HCC患者以及HCV誘發的肝硬化或慢性肝炎患者存在差異[22]。

HCC的早期診斷利于患者及早手術治療，而HCC患者術后是否會復發、總生存期長短，對患者整體預后情況的評估尤為重要。外泌體ncRNAs與HCC的臨床分期、術后復發時間、總生存期等相關，可作為HCC預后的生物學標志物。研究表明，HCC患者的血清外泌體miR-665水平明顯高于健康受試者，且與腫瘤大小、侵襲，臨床分期和存活時間密切相關。血清外泌體miR-665水平越高，臨床表現越差，表明血清外泌體miR-665可能是HCC診斷和預后的非侵襲性生物標志物[23]。與慢性乙型肝炎和肝硬化組相比，HCC組血清外泌體miR-125b水平較低，且 miR-125b水平較低的患者復發時間和總生存期均較短，表明血清外泌體miR-125b可能是肝切除術后HCC患者復發和存活時間的高度準確和有效的生物標志物[24]。Lee等[25]研究發現，循環外泌體lncRNA-ATB與TNM分期和其他預后因素相關，包括T分期和門靜脈血栓形成。Cox回歸測試的多變量分析發現，較高的lncRNA-ATB是HCC死亡率和疾病進展的獨立預測因子，外泌體lncRNA-ATB高的患者的總存活和無進展存活率顯著較低。結果表明循環外泌體lncRNA-ATB是HCC的新型預后標志物和治療靶點[25]。HCC患者的血清外體lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635的水平高于慢性乙型肝炎患者(AUC分別為0.719和0.750)，且ENSG00000258332.1的高表達與TNM分期、門靜脈腫瘤栓塞、淋巴結轉移和總生存期有關[26]。采用兩組無病生存率的生存曲線分析circPTGR1的表達與預后的關系，發現circPTGR1低表達的HCC患者的預后要好于circPTGR1高表達的HCC患者的預后[11]。隨著研究的深入，外泌體ncRNAs有望成為HCC診斷和預后的重要生物學標志物。

4 外泌體ncRNAs在肝癌中治療的作用

部分外泌體ncRNAs可抑制HCC的生長，如人成體肝干細胞衍生的外泌體可以通過轉移抗腫瘤的miRNA下調與細胞增殖有關的基因來抑制肝癌的生長，如miR-223靶向的Cyclin D1，miR-31靶向的E2F-2。此外，人肝星狀細胞LX2分泌的外泌體中過表達miR-335-5p，可在體內傳遞至受體HCC細胞，抑制體外HCC細胞增殖并抑制體內腫瘤生長[6]。由此給我們啟示，可以體外構建外泌體載體，將抑制腫瘤的ncRNAs裝載至外泌體轉移到HCC細胞可逆轉其惡性表型，或增強HCC細胞對化療藥物的敏感性。目前該技術已經比較成熟，將“貨物”載入外泌體的方法主要有“前轉載”、“后轉載”兩種方式，而“后轉載”中電穿孔法因參數容易控制，多種“貨物”載入外泌體使用該方法[27]。Liang等[28]采用電穿孔技術將功能性的miR-26a加載到HEK-293T細胞來源的外泌體，而負載miR-26a的外泌體經清道夫受體選擇性結合HCC細胞，通過抑制CCND2、CCNE2、CDK6等蛋白抑制HCC的生長和侵襲。外泌體ncRNAs可有效抑制HCC的生長侵襲、增強癌細胞對化療藥物的敏感性，且具有低生物毒性、低免疫原性、低致病性、更好的生物相容性等優點，因此，外泌體ncRNAs用于治療HCC具有較良好的應用前景。

5 小結

HCC在全世界發病率和病死率極高，HCC早期診斷患者可手術切除，臨床預后較好，而HCC晚期患者多采用化療或靶向治療，治療效果欠佳，患者總生存期低。因此，發現用于早期診斷HCC以及治療HCC的高靈敏度、高特異性生物學標志物具有重要意義。越來越多的研究發現，外泌體ncRNAs在HCC的發生發展、診療預后中起重要作用，且外泌體ncRNAs具有無創性、在體液中廣泛存在、穩定性高、低生物毒性等明顯優勢，故外泌體ncRNAs今后有望成為HCC診療預后的重要生物標志物。