殼聚糖季銨鹽的制備及抑菌性能研究

包艷玲（武漢輕工大學，湖北武漢430000）

0 引言

無論是殼聚糖還是殼聚糖季銨鹽，其分子量都是影響其抗菌活性的重要因素。據報道，殼聚糖的分子量在104～105之間，有利于抑制細菌的生長。程國軍等人發現殼聚糖分子量為2.2 x 104時，其抗菌活性較高。Tokura 等人發現平均分子量9.3 x 103的殼聚糖對大腸桿菌有抑制作用，而分子量為2.2 x 104的殼聚糖能促進大腸桿菌生長。目前，關于CTS-QTS的性能還沒有一個統一的結論，存在很多爭議。

以殼聚糖衍生季銨鹽抗菌劑是殼聚糖衍生物研究的熱點，但目前對殼聚糖及其季銨鹽衍生物的抗菌機理的研究還不深入，而進一步提高抗菌性能，必須以全面、深層次認識其抗菌機理為基礎。從化學結構方面來看，含吡啶的季銨鹽、雙季銨鹽等具有更高殺菌活性，與殼聚糖反應，有望制得具有更好抗菌效果的殼聚糖衍生物抗菌劑。

HACC 作為一種高分子聚合物，具有良好的抗菌抑菌、保濕、易溶等性能，因此可作為瘢痕及創傷修復、抗感染、調脂、載藥及藥物控釋等產品應用。而HACC 的這些性能與CTS 的季銨化改性有著密切的聯系，但人們對于這種關聯的研究目前還不是很深入，為進一步提高HACC 的擴展應用，有必要加大對CTS 季銨化的了解和探究，以便提高和改善HACC的性能。

由于殼聚糖分子中存在氨基和羧基使得殼聚糖易于進行物理和化學改性，可以引入例如環氧乙烷、乙酸、二硫化碳等化學物質對其進行改性，以改善其物理和化學性質。銨與鹵代烴反應可以制取季銨鹽，季銨鹽易溶于水且具有較強的抗菌性，因這一性能被廣泛用于各種化合物改性中。目前季銨鹽類消毒劑在醫療衛生領域、生物制劑領域以及農業領域中都被廣泛應用。利用季銨鹽對殼聚糖進行改性，若兩者結合既能保留季銨鹽易溶于水的特性又能增強兩者都具有的抗菌性能，就會有更廣闊的應用前景。

本實驗以環氧丙基三甲基氯化銨為原料，在殼聚糖的氨基上發生加成反應生成了殼聚糖季銨鹽。研究不同條件對殼聚糖季銨鹽合成效果的影響，研究了殼聚糖季銨鹽對大腸桿菌的抗菌性能。

1 實驗過程

1.1 合成殼聚糖季銨鹽

首先進行過濾，檢查裝置氣密性；然后把濾紙修剪成合適的大小，最好與布氏漏斗大小相似而略小于布氏漏斗。倒入適當的蒸餾水使濾紙與布氏漏斗完全貼合住，打開抽濾泵開關開始抽濾，將ph為7左右的殼聚糖溶液倒入布氏漏斗進行抽濾得到白色膠狀物，放入250ml圓底燒瓶中備用；

在45～85℃下以不同摩爾比加入環氧丙基三甲基氯化銨(GTA)，再加入100ml異丙醇。然后在恒溫攪拌4～10小時。由于異丙醇沸點較低，所以采用回流裝置。反應結束后，在混合溶液中加入適量丙酮使產物沉淀。沉淀物先進行抽濾，后用甲醇洗滌、抽濾，最后用丙酮-乙醇混合溶液(體積比為4：1)洗滌、抽濾。然后把設置烘箱溫度為120℃，在空氣干燥箱中放置12小時，干燥后得到殼聚糖季銨鹽。

1.2 檢測溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響

開啟恒溫加熱磁力攪拌器，搭建冷凝回流裝置，分別在55、65、75 和85℃條件下進行反應，在上述圓底燒瓶中加入環氧丙基三甲基氯化銨15g，再加入100ml異丙醇，恒溫攪拌8小時。

1.3 檢測不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響

打開恒溫加熱磁力攪拌器，設定溫度為75 攝氏度，搭建冷凝回流裝置，待升溫至75℃后在上述圓底燒瓶中分別加入環氧丙基三甲基氯化銨5g、10g、15g、20g，再加入100ml異丙醇，恒溫攪拌8小時，研究CTS與GTA的不同摩爾比對產物的影響。

1.4 殼聚糖季銨鹽的抗菌性能檢測

（1）培養基的配置：將將10 g 蛋白胨、5 g 牛肉膏、5 g 氯化鈉、20 g 瓊脂粉加入到1000 mL 蒸餾水中，充分混合后調節培養基的pH 值至7.0 ～7.2，加熱充分溶解，于121 ℃下高溫滅菌20min；

（2）倒平板：在超凈工作臺下將滅菌后的混合溶液倒入平板中，等待冷卻，制成固體培養基；

（3）冷卻后翻轉平板，在平板上畫線，分四個區域；

（4）在超凈工作臺上把大腸桿菌用移液槍放入平板中，用涂布棒進行涂布，涂布要均勻、充分，在酒精燈下進行涂布操作；

（5）涂布完成后，用滅菌過的移液槍吸取適量樣品于平板中的指定區域內；

（6）把平板倒扣放入生化培養箱中培養12 小時后，觀察樣品的抑菌情況。

2 結果分析

2.1 分析不同條件對殼聚糖季銨鹽合成的影響

2.1.1 溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響

反應時間定為8h，CTS與GTA的摩爾比定為1：3，測量不同溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響

結果顯示，隨著反應溫度不斷提高，殼聚糖季銨鹽的溶解度也隨之增大，但這種線性關系到75℃之后開始改變，75 攝氏度時殼聚糖季銨鹽溶解度達到最大，而繼續升高反應溫度，殼聚糖季銨鹽溶解度呈下滑趨勢，分析其原因可能是溫度過高，導致了殼聚糖季銨鹽的分子鏈發生裂解，從而導致殼聚糖季銨鹽的溶解度降低。而且反應溫度過高可能會使環氧丙基三甲基氯化銨中的環氧鍵發生斷裂，GTA分子之間可能發生了交聯反應，使得相對較少的GTA 分子與殼聚糖發生反應，導致殼聚糖季銨鹽的合成較少。從而溶解度降低。故選擇反應溫度75℃為宜。

2.1.2 殼聚糖與環氧丙基三甲基氯環的不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響

反應時間定為8h，溫度定為75攝氏度，測量殼聚糖與環氧丙基三甲基氯環的不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響。結果顯示，隨著殼聚糖與環氧丙基三甲基氯環的摩爾比不斷增加，殼聚糖季銨鹽的溶解度也不斷增加，但當殼聚糖與環氧丙基三甲基氯環的摩爾比大于3時，殼聚糖季銨鹽的溶解度增加緩慢趨于穩定，最終不再增加。故選擇CTS 與GTA 的摩爾比為1：3。

2.1.3 殼聚糖季銨鹽的抑菌性能分析

第一次抑菌試驗采用75℃下反應6 小時，CTS 與GTA 摩爾比為1：1 的殼聚糖季銨鹽進行檢測，殼聚糖季銨鹽溶液濃度為0.03%，用濾膜浸染季銨鹽殼聚糖溶液放入平板內，用報紙把平板包好，放入生化培養箱培養12小時后觀察實驗結果.

我們可以看出，浸染了殼聚糖季銨鹽溶液的濾膜上有菌產生但是很少量，而沒有侵染溶液的濾膜與空白對照處都長滿了大腸桿菌，證明0.03%殼聚糖季銨鹽溶液有抑菌效果但抑菌效果不好，分析可能是因為溶液濃度過低而導致抑菌效果不明顯。

第二次抑菌實驗采用了75℃下反應6 小時，CTS 與GTA 摩爾比為1：1的殼聚糖季銨鹽進行檢測，殼聚糖季銨鹽溶液濃度為0.05%，用滅菌過的移液槍向平板內滴加殼聚糖溶液、0.05%殼聚糖季銨鹽溶液和0.05%環氧丙基三甲基氯化銨溶液，放入生化培養箱培養12小時后觀察實驗結果.

可以看出，左上角滴加殼聚糖溶液的部分有明顯的抑菌圈出現，證明殼聚糖溶液具有良好的抑菌效果；而右上角滴加0.05%殼聚糖季銨鹽溶液的部分也有抑菌圈出現，但抑菌圈較小且不是特別明顯；左下角的0.05%環氧丙烷三甲基氯化銨溶液與右下角空白對照組相同，平板上均長滿了大腸桿菌，證明環氧丙基三家基氯化銨完全沒有抑菌性。

第三次抑菌實驗的殼聚糖季銨鹽的反應條件為：反應溫度為75℃，反應時間為8h，CTS與GTA 摩爾比為1：3，稱取3g樣品與100ml水中充分溶解，配置3.00%的殼聚糖季銨鹽溶液，進行實驗.

平板中分為四片區域，上方是環氧丙基三甲基氯化銨溶液，下方為無任何溶液滴加的空白對照組，平板左邊為殼聚糖溶液，右邊為3.00%的殼聚糖季銨鹽溶液。我們可以明顯的看出，滴加環氧丙基三甲基氯化銨處的平板長滿了大腸桿菌，證明其毫無抑菌效果。而殼聚糖溶液與殼聚糖季銨鹽溶液均有抑菌效果，且滴加殼聚糖季銨鹽溶液處的平板抑菌圈較大，抑菌效果相對明顯，滴加殼聚糖季銨鹽溶液的部分已完全沒有菌生長。較之前的兩次實驗相比較，我們可以發現，殼聚糖季銨鹽的濃度對抑菌效果影響較大。

3 結語

文章以殼聚糖為研究對象，用環氧丙基三甲基氯化銨作為化學改性劑對殼聚糖進行改性，反應生成殼聚糖季銨鹽。研究反應溫度、反應時間、殼聚糖與環氧丙烷三甲基氯化銨的不同摩爾比對殼聚糖季銨鹽合成的影響，最后檢測不同濃度不同條件合成的殼聚糖季銨鹽的抑菌效果。通過研究，結論如下：

溫度對殼聚糖季銨鹽合成的影響較明顯，隨著溫度的升高，殼聚糖季銨鹽的溶解度不斷提高，反應溫度為75攝氏度時溶解度達到最高，但再升高溫度殼聚糖季銨鹽分子鏈就會發生降解，溶解度開始下降。隨著反應時間不斷增加，殼聚糖季銨鹽的溶解度也隨之增大，反應時間達到8小時時殼聚糖季銨鹽溶解度達到最大，反應基本完全，反應8小時以上溶解度基本無變化。CTS與GTA的摩爾比為1：3時二者反應基本完全。殼聚糖與殼聚糖季銨鹽均有抑菌效果。隨著溶液濃度升高，抑菌效果越來越明顯。