高效液相色譜法分離純化非達霉素

摘? ?要： 為了獲得高純度非達霉素樣品，以非達霉素粗品為起始原料，基于高效液相色譜法，開發非達霉素的分離純化工藝，考察不同的流動相、填料和上樣量對非達霉素保留與分離的影響，并進行分離條件優化。研究發現：甲酸水/乙腈體系和C8-3填料對非達霉素的保留及雜質的去除情況較好;當上樣量為0.8%時，雜質的去除效果良好。優化后，放大到制備水平，以C8-3為固定相，以甲醇為洗脫劑，對非達霉素粗品進行分離純化，主峰純度可達99.24%，回收率約為90.74%，樣品關鍵雜質指標均在合格范圍內。

關鍵詞： 非達霉素;高效液相色譜;分離純化;C8-3填料;回收率

中圖分類號：O69? ? 文獻標識碼：A? ? 文章編號：2095-8412 （2020） 06-050-05

工業技術創新 URL： http：//gyjs.cbpt.cnki.net? ? DOI： 10.14103/j.issn.2095-8412.2020.06.009

引言

非達霉素（fidaxomicin）是由桔橙指孢囊菌發酵產生的一種新型窄譜大環內酯類化學物質[1-4]，分子式為C52H74Cl2O18，結構式如圖1所示。非達霉素市場前景廣闊，但目前關于非達霉素分離純化的文獻報道相對較少[5-6]。

文獻[7]報道了一種分離純化過程，包括浸提、大孔樹脂吸附、萃取、正相柱層析、苯乙烯微球柱、萃取等步驟，但生產周期長，容易造成產品出現降解產物，使純度和回收率降低。文獻[8-10]報道了先采用有機溶劑從微生物菌絲中浸提，再用大孔樹脂和制備柱層析進行分離的方法，但是微生物發酵過程十分復雜，而且溶媒浸提會將菌絲中的油脂與非達霉素一并提取出來，這些油脂會吸附到樹脂上，使樹脂交換容量大大降低，需額外增加工藝步驟去除這些雜質;同時，再生樹脂需耗費大量溶劑，生產成本高，不利于大規模生產。因此，研究高純度非達霉素的分離純化方法具有重要的意義。

本文以非達霉素粗品為起始原料，采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），通過篩選分離材料和優化洗脫條件，開發一種非達霉素的分離純化方法。后續僅需簡單結晶，即可獲得高質量的非達霉素產品。該方法操作簡便，獲得的樣品純度較高，回收率穩定，適合工業化生產。

1? 實驗部分

1.1? 儀器、試劑與材料

實驗所需要的儀器包括S6000液相色譜系統（華譜科儀（北京）科技有限公司）和DAC 50-HB純化系統（江蘇漢邦科技有限公司）。

實驗所需要的色譜柱及色譜填料均購于浙江華譜新創科技有限公司。

分析水平所用甲醇和乙腈為色譜純，購于Sigma-Aldrich公司;磷酸二氫鉀、甲酸和甲酸銨為分析級，購于國藥集團化學試劑有限公司;水為超純水。

制備水平所用甲醇為工業級甲醇，水為純化水。

非達霉素粗品來自浙江野風藥業股份有限公司。

1.2 色譜條件

1.2.1 樣品分析參數

色譜柱為Unitary C18（4.6 mm×100 mm，3 μm）;流動相A為乙腈，B為50 mM磷酸二氫鉀;洗脫條件為等度洗脫，A/B=50/50（V/V）;流速為0.5 mL/min;柱溫為15℃;波長為230 nm;進樣量為2 μL。

1.2.2 流動相優化考察

色譜柱為C8-1（4.6 mm×250 mm，10 μm）。流動相A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液，C為50 mM甲酸銨（pH～6）水溶液，D為50 mM甲酸銨（pH～3）水溶液。洗脫條件分別為：1）A/B=7/3（V/V）;2）A/C=7/3（V/V）;3）A/D=7/3（V/V）。流速為1 mL/min;波長為230 nm;進樣量為1 μL。

1.2.3 填料優化考察

色譜柱分別為C8-1、C8-2、C8-3，色譜柱規格均為4.6 mm×250 mm，粒徑均為10 μm。

流動相A為0.1%甲酸水溶液;B為乙腈;洗脫條件為等度洗脫，A/B=53/47（V/V）;流速為0.7 mL/min;波長為230 nm;進樣量為100 μL。

1.2.4 上樣量考察

色譜柱為C8-3（4.6 mm×250 mm，10 μm）。流動相A為0.1%甲酸水溶液;B為乙腈;洗脫條件為等度洗脫，A/B=53/47（V/V）;流速為0.7 mL/min;波長為230 nm;上樣量分別為0.8%、1%。

1.2.5 制備條件

色譜柱為C8-3（50 mm×260 mm，10 m，300 g）;流動相A為0.1%甲酸水溶液;B為乙腈;洗脫條件為等度洗脫，A/B=53/47（V/V）;沖柱條件為A/B=20/80（V/V）;流速為60 mL/min;波長為230 nm;上樣量為0.8%

2? 結果與討論

2.1? 粗品純度分析及質量要求

非達霉素粗品經過HPLC檢測，如圖2所示。主峰（20.35 min）純度68.66%，關鍵雜質在18.47 min（相對保留時間RRT=0.91）和18.73 min（RRT=0.92）分別為0.03%和0.08%。根據后續結晶工藝水平，結晶前的粗品要求為RRT=0.91～0.92，雜質之和≤0.15%，其他單個雜質≤0.5%。

2.2? 流動相優化考察

對于分離工藝來說，流動相的選擇需要考慮樣品溶解度、雜質的分離選擇性、目標物的峰形以及環保要求等因素。根據非達霉素的溶解特性及環保要求，選擇甲醇作為有機洗脫劑，考察了酸水以及不同pH的甲酸銨緩沖鹽對分離的影響，結果如圖3所示。在pH～6緩沖鹽的條件下，非達霉素的保留比較弱，峰形拖尾，雜質的分離度也不高，不利于分離純化工藝開發。當甲醇比例相同時，非達霉素在酸性條件下保留和分離較好，添加甲酸或者甲酸銨的差異不大。如果采用pH～3緩沖鹽的條件，需要在后處理過程中增加脫鹽步驟，增加成本，而甲酸為揮發性有機酸，在后處理濃縮過程中基本去除完全，后處理相對比較簡單。后續通過繼續優化有機溶劑的種類及洗脫條件，最終選擇0.1%甲酸水溶液/乙腈（53/47，V/V）體系作為分離純化的洗脫條件。

2.3? 填料優化考察

填料是分離純化工藝的核心，填料的類型及參數對雜質的分離選擇性、峰展寬、上樣量、回收率等有很大的影響。實驗選取三款填料（C8-1、C8-2、C8-3），采用優化好的分離條件，在大進樣量情況下進行模擬制備，并收集目標餾分，檢測純度，計算回收率，結果如表1所示。結果表明，在C8-3填料上，雜質去除效果最好，合格餾分的回收率最高。

2.4? 上樣量考察

上樣量在分離純化工藝中也是一個關鍵因素，關系到生產效率和生產成本控制。隨著上樣量增加，色譜峰變寬，雜質與主峰發生交叉，從而可能影響主峰與雜質的分離度，降低制備樣品的純度[11-12]。因此在放大制備過程中要選擇合適的上樣量，以便在獲取符合質量要求樣品的同時保證足夠的回收率，從而提高效率，降低成本。

實驗考察了不同上樣量對產品質量以及回收率的影響，結果如表2所示。當上樣量為0.8%時，雜質的去除效果良好，回收率也比較高。當上樣量繼續增加至1%時，符合質量要求餾分的回收率降低。因此，選擇0.8%上樣量是比較合適的。

2.5? 放大制備

經過上述優化以后，在內徑為50 mm的制備柱上進行了放大實驗，制備條件如章節1.2.5所述。制備譜圖如圖4所示。收集53～61 min餾分，檢測譜圖如圖5所示，主峰純度99.24%，其余雜質符合要求，回收率約90.74%。經過放大驗證，該方法的分離效果良好，通過一步結晶得到了高純度的樣品，操作簡單，適合工業化生產。

3? 結束語

本文基于高效液相色譜法，考察了非達霉素在不同流動相條件下和不同色譜填料上的保留與分離的情況，確定了最大上樣量，并放大到制備水平，得到了高純度的非達霉素樣品。

該方法操作簡單，分離高效、穩定，所得樣品關鍵雜質指標均在合格范圍內，回收率高，適合工業化生產。

參考文獻

[1] Parenti F， Beretta G， Berti M， et al. Teichomycins， new antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus Nov. Sp. I. Description of the producer strain， fermentation studies and biological properties[J]. Journal of Antibiotics， 1978， 31（4）： 276-283.

[2] 楊振江， 吳遠杰， 張珂， 等. 非達霉素的菌種選育及發酵工藝優化[J]. 中國醫藥工業雜志， 2016， 47（12）： 1519-1521， 1529.

[3] 姜春梅， 劉洋， 王京晶， 等. 抗感染新藥非達霉素的藥理作用與臨床評價[J]. 中國新藥雜志， 2011， 20（23）： 2283-2285.

[4] 馬培奇. 美FDA咨詢委員會推薦批準非達霉素治療艱難梭菌感染[J]. 上海醫藥， 2011， 32（5）： 235.

[5] 高月麒， 李曉露， 王海燕， 等. 樹脂吸附法分離純化非達霉素的研究[J]. 中國抗生素雜志， 2015， 40（3）： 183-185

[6] 王海燕， 李寧， 李曉露， 等. 非達霉素的分離純化[J]. 中國醫藥工業雜志， 2015， 46（4）： 351-353.

[7] 胡海峰， 詹陽. 一種從發酵液中分離和純化非達霉素的工藝： CN104846043A[P]. 2015-08-19.

[8] 唐恒， 楊久林， 孟憲柱， 等. 一種制備高純度非達霉素的方法： CN104418925A[P]. 2015-03-18.

[9] 任會軍， 李道超， 應雪肖， 等. 一種純化非達霉素的方法： CN104098637A[P]. 2014-10-15.

[10] 路新華， 鄭智慧， 丁彥博， 等. 一種游動放線菌菌株及其在制備非達霉素中的應用： CN103320355A[P]. 2013-09-25.

[11] 仲偉潭， 宋盼， 彭亮， 等. 高壓液相色譜技術分離制備桿菌肽各組分的研究[J]. 安徽醫藥， 2018， 22（3）： 422-424.

[12] 潘劍， 陶云國. 胰島素反相制備色譜的方法開發[J]. 色譜. 2017（8）： 848-854.

作者簡介：

周文武（1983—），通信作者，男，浙江溫州人，碩士研究生，工程師。研究方向：發酵產物后提取及分離純化工藝。

E-mail： zhouwenwu1983@126.com

（收稿日期：2020-09-01）