超聲成像在早期干燥綜合征小鼠模型中的評價作用

周偉杰，周正煒，陶 娟，邰 宇，汪丹丹，王 珍，郭派派，汪慶童，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

干燥綜合征 (Sj?gren’s syndrome，SS) 是一種慢性炎癥性自身免疫病，臨床表現(xiàn)為口干、眼干等癥狀，其主要侵犯外分泌腺體(如唾液腺)，同時使皮膚等其他器官受到一定程度的損害。腺體中可出現(xiàn)大量淋巴細胞浸潤，并累及多系統(tǒng)病變(如神經(jīng)系統(tǒng)組織受損；累及關(guān)節(jié)，引起關(guān)節(jié)腫痛等)[1- 2]。動物模型是研究SS病理機制和藥物治療療效觀察的重要方法，采用何種簡單高效的技術(shù)或敏感的評價指標對SS模型進行動態(tài)觀察與評價至關(guān)重要，尤其是活體觀察SS模型動物病程變化及唾液腺腺體炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展過程。唾液腺病理改變，雖然可以反映SS病變的發(fā)生，但是實驗動物必須處死才能獲取樣本病理進行觀察，導致實驗無法連續(xù)進行，且不能對SS模型動物的病程進行實時動態(tài)觀察，此外小動物的腺體組織較小，活檢技術(shù)難度較大。CT檢查輻射較大，長周期的實驗過程，對實驗操作者和實驗動物均有一定損害。血液生化指標個體間差異較大，且不夠敏感。因此，探索小動物(如小鼠)腺體病程變化的無創(chuàng)、動態(tài)和靈敏的檢查方法是目前SS實驗研究中面臨的重要問題之一。近年來，隨著小動物超聲成像系統(tǒng)的發(fā)展，其在多種疾病模型中評價及應(yīng)用價值逐漸得到認可。并且超聲檢查具有無創(chuàng)性、無輻射、實時動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點，逐漸成為SS的一項重要臨床診斷技術(shù)，已逐步應(yīng)用SS患者的診斷與療效觀察，但基礎(chǔ)研究中對此技術(shù)的應(yīng)用和超聲觀察指標的定量分析方法尚不成熟[3-4]。本實驗以C57BL/6雌性小鼠建立SS模型，采用小動物超聲成像實時觀察SS小鼠頜下腺的大小和血流量改變，與傳統(tǒng)指標進行相關(guān)性分析，為超聲診斷在SS評價中的應(yīng)用，以及分析方法的建立提供實驗依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康♀近交系C57BL/6小鼠，20只，SPF級，體質(zhì)量20 g左右，周齡8周，購買于常州卡文斯實驗動物有限公司(合格證號：SCXK(蘇)2016-0010)，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。本研究中的相關(guān)操作均根據(jù)動物實驗相關(guān)指南進行，并經(jīng)由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心動物研究倫理委員會批準。

1.1.2儀器與試劑 毛果蕓香堿(批號：LRAA3042)和不完全弗氏佐劑(批號：SLBX2135)均購自Sigma公司；卡介苗(Bacille CalmettE-Guerin, BCG)購于新華區(qū)群碩實驗用品銷售部(批號：20181209DG)；異氟烷為瑞沃德生命科技有限公司產(chǎn)品(批號：217181101)；TM-100型醫(yī)用超聲耦合劑購自天津市西苑寺制作所(批號：20180502)；BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司(批號：PF205489)；VisualSonics Vevo 2100高分辨小動物超聲成像系統(tǒng)為FUJIFILM公司產(chǎn)品；AS-01型小動物氣體麻醉機為英國Norvap公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1干燥綜合征模型的建立 在無菌超凈臺上取C57BL/6小鼠頜下腺，冰上用預(yù)冷的PBS研磨20 min，3000 rmp離心15 min取上清，BCA法進行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度為5 g·L-1。再將 80 ℃滅活1 h的BCG溶于液體石蠟中，研磨2～3 h，終濃度為4 g·L-1BCG的完全弗氏佐劑。蛋白中加入等體積完全弗式佐劑冰上混合研磨，使頜下腺提取蛋白終濃度為2.5 g·L-1，除正常對照組外，d 0和7，各組小鼠背部酒精消毒后背部皮內(nèi)多點注射抗原，每只小鼠共注射0.1 mL抗原。d 14，用不完全弗氏佐劑將頜下腺抗原濃度調(diào)整為2.5 g·L-1，注射抗原方法同前[5-6]。

1.2.2全身情況及唾液量與飲水量觀察 每天觀察全身情況，小鼠全身皮膚有無搔抓、破損現(xiàn)象，口唇情況等；d 0、21、28和35分別測量小鼠的唾液量與飲水量，采用小動物麻醉機對小鼠進行麻醉后，注射0.025 g·L-1毛果蕓香堿溶液(1.2 mg·kg-1)，5 min后開始收集唾液，共收集10 min唾液量(將事先稱好的無菌小棉球塞入小鼠舌下，10 min后取出稱重)[7]；小鼠飲水量以3 d為單位進行檢測，分別在d 0、21、28和35檢測。

1.2.3頜下腺指數(shù)和病理學檢查 d 35處死小鼠，取出頜下腺稱重，計算頜下腺指數(shù)(腺體質(zhì)量與小鼠體質(zhì)量的比值)。另外取頜下腺用10%福爾馬林固定，HE染色，光鏡下觀察，根據(jù)Cutler的方法進行病理組織學評估：0級：散在淋巴細胞浸潤；1級：少量淋巴細胞浸潤；2級：中度淋巴細胞浸潤(無淋巴灶形成)，輕度頜下腺血管及腺導管水腫；3級：每5個低倍鏡下有1個淋巴細胞灶(浸潤淋巴細胞>50 個相當于1個淋巴灶)，中度血管及腺管水腫、擴張；4 級：每5 個低倍鏡下有 2～3個淋巴細胞浸潤灶，腺泡萎縮，重度血管及腺管水腫等損傷。1 級相當于1分，2分以上為發(fā)病[8]。

1.2.4小動物超聲掃描檢查 SS小鼠造模前后d 0、21、28和35對小鼠頜下腺進行超聲檢查，采用異氟烷對小鼠進行吸入性麻醉，并對超聲掃描部位進行脫毛處理。將小鼠采用仰臥位固定于檢查板上，并涂抹一定量的耦合劑于小鼠頜下腺部位待超聲掃描。采用MS550探頭對小鼠頜下腺進行超聲檢查，并選擇General imaging模式，在B-Mode模塊下對小鼠頜下腺部位進行縱切掃查(Fig 1)。此模式下成像的小動物解剖結(jié)構(gòu)，以黑/灰/白的色階顯示(黑色：表示無回聲，通常為低密度組織，如壞死組織、血管和積液；灰色：表示低回聲，通常為中密度組織，如脾、膽、肝等器官；白色：表示強回聲，通常為高密度組織，如氣泡和結(jié)石等)，圈出腺體長軸縱切面積。采用Color Doppler-mode又稱為彩超模式，觀察小鼠頜下腺腺體內(nèi)是否有血流信號及豐富程度。整個超聲掃查過程，保持探頭對準小鼠頜下腺部位且壓力適中，并控制超聲探頭位置與腺體的間距，防止腺體受壓變形，以免影響觀察實驗結(jié)果。采集圖像，對Color Doppler檢測結(jié)果進行半定量評分，0分，腺體內(nèi)部偶見少量斑狀血流信號(0～1個血流斑點)；1分，腺體內(nèi)部有少量血流信號(2～3個血流斑點)；2分，腺體內(nèi)有較多的血流信號(4～5個血流斑點)；3分，腺體內(nèi)部血流信號較豐富(6個及以上血流斑點)；左右側(cè)腺體評分不一致時，以高分側(cè)評分為最終分數(shù)。

Fig 1 Ultrasonic probe positioning: axial incident

2 結(jié)果

2.1 SS小鼠造模后d 28左右檢測出飲水量和唾液量的明顯改變?nèi)鏔ig 2所示，采用自身抗原誘導小鼠SS模型，分別在d 0、21、28和35檢測小鼠相對唾液量和相對飲水量，模型組小鼠的相對唾液量在d 28和35均較正常組顯著降低(P<0.01)(Fig 2A)，而相對飲水量較正常組明顯升高(P<0.01)(Fig 2B)，從d 0開始每周稱量小鼠的體重，模型組較正常組在d 28和35體重有所減輕，但未見統(tǒng)計學差異(Fig 2C)。d 35處死小鼠，取頜下腺稱重，計算頜下腺指數(shù)，模型組較正常組頜下腺指數(shù)升高，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(Fig 2D)。d 35處死小鼠，取出頜下腺進行HE染色，正置顯微鏡下觀察，如Fig 3所示，模型組小鼠與正常組小鼠相比，頜下腺內(nèi)有大量淋巴細胞浸潤，并形成淋巴細胞浸潤灶，并伴有嚴重的血管及腺管水腫和擴張，病理分析具有統(tǒng)計學差異，提示模型建立成功。

2.2 超聲檢測造模后d 21即可觀察到SS小鼠的腺體腫大如Fig 4所示，在B-Mode模塊下采用小動物超聲成像系統(tǒng)檢測不同時期小鼠頜下腺的影像，模型小鼠與正常小鼠相比，d 21即出現(xiàn)頜下腺超聲軸面Area值明顯增高，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，但模型小鼠和正常小鼠的頜下腺超聲回聲強度均未見明顯改變；如Fig 5所示，在Color Doppler-mode模塊下檢測不同時期小鼠頜下腺的超聲影像，模型小鼠與正常小鼠相比，d 28開始頜下腺超聲血流信號明顯增高，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

2.3 干燥綜合征模型頜下腺超聲影像學改變與常規(guī)診斷指標具有顯著相關(guān)性如Fig 6 A和B所示，對常規(guī)SS診斷指標飲水量和唾液量與頜下腺超聲軸面Area值進行相關(guān)性分析，飲水量與超聲頜下腺軸面Area值具有顯著正相關(guān)(r=0.74，P<0.01)，唾液量與超聲頜下腺軸面Area值存在顯著負相關(guān)(r=-0.77，P<0.01)。如Fig 6 C和D所示，飲水量與頜下腺Color Doppler評分(血流信號等級)具有顯著正相關(guān)(r=0.89，P<0.01)，唾液量與Color Doppler評分(血流信號等級)存在顯著負相關(guān)(r=-0.86，P<0.01)。病理檢查顯示的腺體血管擴張程度評分與超聲Color Doppler評分(血流信號等級)具有顯著正相關(guān)(r=0.78，P<0.01)，腺體導管水腫程度評分與超聲軸面Area值具有顯著正相關(guān)(r=-0.83，P<0.01)(Fig 6 E和F)。

Fig 2 Detection of routine indicators in mice at different periods

Fig 3 Pathology of submandibular gland n=5)

3 討論

SS是一種累及外分泌腺體和淋巴細胞浸潤的全身性異常炎癥免疫反應(yīng)為特征的疾病，其局部臨床表現(xiàn)為口干、眼干和牙齒脫落[9]。動物模型是研究SS病理機制和療效觀察的重要前提，但目前評價動物模型方法和技術(shù)的缺乏很大程度限制了對該疾病的研究進展。因小動物超聲檢查具有無創(chuàng)傷、無輻射和實時動態(tài)檢測等優(yōu)點，所以逐漸成為多種疾病動物模型評價的標準。在臨床上，干燥綜合征患者早期的唾液腺腺體淋巴細胞浸潤，腺體導管和血管擴張水腫，超聲表現(xiàn)為腺體形態(tài)增大或正常，晚期腺體細胞被纖維組織取代，腺體實質(zhì)回聲不均勻，最終表現(xiàn)為腺體纖維化和腺體形態(tài)萎縮[10]。而本研究通過自身免疫誘導法建立干燥綜合征模型，通過小動物超聲和傳統(tǒng)常規(guī)檢測指標的觀察發(fā)現(xiàn)，模型小鼠癥狀與臨床干燥綜合征早期病人癥狀相似，表現(xiàn)為模型小鼠血管和腺體導管擴張，淋巴細胞浸潤，腺體腫脹。臨床上超聲診斷原發(fā)性SS的靈敏度、特異度、準確率、陽性預(yù)測值以及患者的依從性均較傳統(tǒng)檢測方法有所提高[11-12]。超聲成像系統(tǒng)是否可以應(yīng)用到SS動物模型的基礎(chǔ)研究，準確性和靈敏度如何，以及檢測結(jié)果應(yīng)該怎樣統(tǒng)計分析目前尚無相關(guān)報道。

Fig 4 Ultrasonic axial area of submandibular gland

傳統(tǒng)的SS動物模型評價手段包括飲水量和唾液量的測量，病理切片的觀察等，存在多種不足之處，如飲水量的檢測存在較大的個體差異以及多種外界環(huán)境因素的干擾而無法準確測量。唾液量的檢測需要先對小鼠進行麻醉，再腹腔注射一定劑量的毛果蕓香堿，會引起胃腸道平滑肌收縮[13]，可能會影響研究者后續(xù)的體內(nèi)實驗結(jié)果，過量的藥物劑量還會引起小鼠全身性中毒、支氣管痙攣和嘔吐等不良反應(yīng)，嚴重者還會導致小鼠死亡，樣本減少。而病理切片的觀察需要處死小鼠取頜下腺，不僅耗費模型小鼠的樣本量，還無法針對模型小鼠腺體進行病程連續(xù)性觀察或者給藥前后的療效自身比較。本研究發(fā)現(xiàn)，頜下腺超聲在發(fā)病初期即可觀察到腺體的輕度腫大，在出現(xiàn)明顯的臨床表現(xiàn)即唾液量降低和飲水量升高之前，診斷更為靈敏，與臨床治療和病理改變具有顯著相關(guān)性。

Fig 5 Ultrasonic blood flow signal grade of submandibular gland in different periods n=6)

綜上所述，采用小動物超聲成像可以為SS實驗動物模型提供非侵入式且連續(xù)性的結(jié)構(gòu)及功能的觀察。超聲干預(yù)的小鼠可以前后自身做對照，數(shù)據(jù)更加可信，且重復性高，能夠減少對樣本動物的創(chuàng)傷和死亡率。并且其高分辨率的影像可以給研究者提供更清晰的結(jié)果，例如裸鼠前列腺原位模型體積小, 超聲檢測能夠在不損傷臟器前提下準確獲得深部瘤體體積[14]。但是超聲檢查也有其局限性：操作的規(guī)范依賴于操作者的技術(shù)水平，且易受到操作者主觀意識的影響，因此要對操作者進行深度培訓，并且由檢測者以外的實驗人員進行客觀的分析統(tǒng)計。總之，本研究使用小動物超聲系統(tǒng)分析SS動物模型腺體病變，希望為評價SS動物模型及其他組織疾病模型提供一個新的視角和檢測方法，從而更好推動疾病模型的基礎(chǔ)研究。

Fig 6 Correlation analysis between conventional detection indexes and ultrasonic indexes (n=20)