Beta-谷甾醇通過抑制TNF-α-NF-κB和TβR1-Smad2/3信號通路抗小鼠肝纖維化損傷

萬 星，李相國，李修賢，呂慧芬，黃德斌，胡澤華

(湖北民族大學 1. 醫學院機能學教研室，2. 科技學院醫學院，3. 醫學院中藥學教研室, 湖北 恩施 445000)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是指各種慢性肝病引起的細胞外基質在肝臟過度沉積，其病理特征為肝內纖維結締組織異常增生[1]，及時有效的抗纖維化治療是防止慢性肝病向終末期肝病轉化的必要措施。Beta-谷甾醇(Beta-sitosterol，BS)是一種常見的植物甾醇，廣泛存在于植物葉子、植物油和果蔬中，具有良好的抗氧化、抗炎、免疫調節、抗腫瘤等藥理活性[2]，被廣泛應用于醫藥保健品領域。炎癥是病毒、藥物、酒精等病因引起慢性肝病發展的一個動態和共同過程，慢性炎癥進一步發展最終引起肝纖維化甚至肝癌。Gupta等[3]和Valerio等[4]報道，Beta-谷甾醇具有類似氫化可的松的抗炎作用，能提高IL-10的活性，抑制NF-κB的遷移。以炎癥為切入點，本文將初次探討Beta-谷甾醇對四氯化碳誘導小鼠肝纖維化的作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠，♂，體質量(17±3)g，購于北京維通利華實驗技術有限公司，許可證號：SCXK京2016-0011。

1.2 藥品與試劑BS(LOT:R08S7F20751，純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)；CCL4(國藥集團化學試劑有限公司，臨用前溶于橄欖油)；ALT、AST試劑盒(AST,ALT:LOT:20171017，南京建成生物工程研究所)；TNF-α試劑盒(美國BD公司)；鼠源α-SMA(LOT:GR239100-1) 、 collagenⅠ、TβR1(LOT:GR201638-3)、Smad2/3(LOT:GR221934-8) 、NF-κB 和 p-NF-κB一抗(英國Abcam公司)；β-actin一抗、山羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)

1.3 儀器顯微鏡(Nikon E200，日本)；電子天平(YP5002,上海越平)；酶標儀(Thermo Scientific Multiskan GO，美國)；石蠟切片機(Thermo Fisher HM325，美國)；蛋白電泳儀(Bio-Rad, 美國)；蛋白濕轉儀(Bio-Rad, 美國)。

2 方法

2.1 BS配制每只動物灌胃體積在0.1～0.4 mL適宜。取一瓶BS 20 mg研磨成細粉加橄欖油，在溫水浴中加速溶解，定容到41.7 mL，配成高劑量0.48 g·L-1的溶液，然后從中取20 mL溶液加橄欖油，定容到30 mL，配成中劑量0.32 g·L-1的溶液，再從該溶液中取10 mL加橄欖油，定容到20 mL，配成低劑量0.16 g·L-1的溶液，每管溶液約為10只小鼠1周的用量。

2.2 動物分組、給藥[5-6]與造模50只小鼠適應性喂養一周后，隨機分為5組：正常組(control group，CG)、CCL4模型組(carbon tetrachloride group，CTG)、2 mg·kg-1Beta-谷甾醇組(BS-L)、4 mg·kg-1Beta-谷甾醇組(BS-M)、6 mg·kg-1Beta-谷甾醇組(BS-H)。模型組小鼠腹腔注射含25% CCL4的橄欖油溶液1.6 mL·kg-1，每周2次，30 d共9次。藥物組在造模同時，d 1～15灌胃BS，每次灌0.25 mL，正常組灌胃等體積生理鹽水。所有小鼠30 d后禁食不禁水，24 h后處死，按要求做后續操作。

2.3 肝臟外觀形態觀察及肝指數測定小鼠稱重，眼球采血，頸椎脫臼處死后，取肝臟，用高倍相機在同背景同視野下拍外觀形態。生理鹽水洗血，濾紙吸干，稱量肝重。肝指數=肝臟重量(g)/體質量(g)×100%

2.4 血清學指標檢測小鼠采血后，靜置分離得血清，按照kit要求測谷丙轉氨酶(alanine aminotrans，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的含量。

2.5 HE染色肝臟用10%甲醛固定24 h，HE染色，石蠟切片在二甲苯脫臘3次，過梯度乙醇各5 min，水洗1 min，蘇木精染色5 min，水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，伊紅染2 s，乙醇脫水2 min，二甲苯透明、封固、鏡檢。

2.6 Masson染色常規脫水包埋，切片脫臘至水，Harris蘇木精染色10 min，流水稍洗，1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗2 min，麗春紅酸性品紅染液染5 min，流水稍洗，磷鉬酸溶液5 min，苯胺藍復染5 min，1%冰醋酸處理1 min，95%乙醇多次脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.7 免疫組織化學檢測α-SMA、CollagenⅠ含量石蠟切片脫蠟至水，高溫高壓修復2 min，冷卻至室溫，轉入TBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶室溫20 min，TBS沖洗3次，每次5 min，10%山羊血清孵育20 min，一抗(α-SMA：1 ∶150，CollageⅠ：1 ∶600)4 ℃過夜，次日復溫后，TBS沖洗3次，每次5 min，每張切片滴50 μL二抗，室溫孵育30 min，TBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復染2 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化2 s，溫水返藍，梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，封片。

2.8 Western blot檢測α-SMA、CollageⅠ、TβR1、Smad2/3 、NF-κB 和 p-NF-κB蛋白表達稱肝臟組織100 mg，加1 mL Ripa裂解液勻漿破組織，再超聲破碎(超聲時間3 s，間隔10 s，超聲10次)，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1,4 ℃，離心20 min，取上清，BCA法測蛋白濃度后，加5×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min，-20 ℃保存。配10%的分離膠，電泳條件：60 V，30 min濃縮，110 V，70 min分離，電轉條件：110 V恒壓，75 min。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗：α-SMA：1 ∶3 000、collagenⅠ：1 ∶3 000、TβR1:1 ∶100、Smad2/3:1 ∶500、 NF-κB/p-NF-κB:1 ∶1 000，4 ℃過夜，TBST洗脫，孵二抗：1 ∶80 000，90 min，TBST洗脫，曝光。

3 結果

3.1 BS對CCL4誘導小鼠肝纖維化肝臟大體形態與組織結構的影響大體觀察肝臟表面顏色和光滑度，HE染色觀察肝內結構，炎癥水腫等，Masson染色觀察膠原生成情況。正常組肝臟包膜光滑，呈紅褐色，小鼠肝細胞結構正常，肝小葉結構正常，無膠原沉積；CCL4組肝臟表面彌漫明顯大小不一的塌陷區，邊緣泛白，肝小葉被破壞，肝不同程度的水腫、結構紊亂、明顯腫脹變形，有點狀、片狀壞死及炎性細胞浸潤，肝索紊亂，大量膠原沉積分離原來的肝小葉形成假小葉；BS各組量效依賴地減少肝臟表面塌陷數量，肝索較整齊，炎性細胞減少，水腫改變不明顯，膠原沉積仍可見，但少于CCL4組。見Fig 1。

3.2 BS對CCL4誘導小鼠肝纖維化肝指數的影響肝指數一定程度上反映肝臟腫脹。CTG組肝指數高于CG組(P<0.05),BS較CTG組，量效依賴地降低肝指數(P<0.05)。見Fig 2。

3.3 BS對CCL4誘導小鼠肝纖維化血清ALT、AST的影響與CG組比，CTG組ALT、AST活性明顯升高(P<0.01)，BS組量效依賴地降低其表達(P<0.05或P<0.01)，其中，對ALT的降低效果更好。見Fig 3。

3.4 BS對CCL4誘導小鼠肝組織α-SMA、CollagenⅠ的影響肝星狀細胞的激活是肝纖維化的關鍵步驟。α-SMA是肝星狀細胞活化的標志[7]，而CollagenⅠ是肝星狀細胞活化后釋放的最主要的細胞外基質[8]。利用Western blot和免疫組織化學進行BS對α-SMA、CollagenⅠ的探究。鏡下可見：與正常組比，CCL4組α-SMA、CollagenⅠ表達明顯增加，BS量效依賴地降低了α-SMA、CollagenⅠ表達，見Fig 4； Western blot的結果提示，CCL4明顯增加了α-SMA、CollagenⅠ蛋白含量(P<0.01)，較正常組，不同劑量的BS降低了CCL4誘導地α-SMA、CollagenⅠ的表達(P<0.05或P<0.01)，且呈劑量依賴性。見Fig 5。

Fig 1 Effect of different doses of BS on liver morphology by eye, HE and Masson staining

Fig 2 Effect of different doses of BS on liver

3.5 BS對CCL4誘導地TβR1-Smad2/3信號通路的影響TGF-β是HSCs活化過程和細胞外基質生成過程中的致纖維化因子，通過激活其受體，再激活Smad蛋白，進而激活細胞內信號，是纖維化的一條經典通路。CCL4誘導肝纖維化時，TGF-β受體(TβR1)和Smad2/3發生顯著性高表達(P<0.01)，中劑量的BS降低了TβR1、Smad2/3的表達(P<0.01)。見Fig 6。

Fig 3 Effect of different doses of BS on activities

3.6 BS對CCL4誘導地TNF-α- NF-κB信號通路的影響炎癥因子，如TNF-α，是CCL4誘導的肝纖維化的參與者[9]，且增加炎癥因子數量的NF-κB也會被CCL4激活[10]。較正常組、CTG組TNF-α顯著性增高，BS-M降低其表達(P<0.01)。見Fig 7；如Fig 8，較正常組，p-NF-κB、NF-κB在CTG組表達增高，BS-M亦降低其表達(P<0.01)。見Fig 8。

Fig 4 Effect of different doses of BS on α-SMA and Collagen I by IHC(×100)

Fig 5 Effect of different doses of BS on α-SMA and

Fig 6 Effect of BS-M on TβR1 and Smad2/3

Fig 7 Effect of BS-M on TNF-α by n=10)

Fig 8 Effect of BS-M on NF-κB by Western n=6)

4 討論

甾醇分動物甾醇、植物甾醇和菌類甾醇，BS是四環三萜類，是植物甾醇最常見的類型之一，占總甾醇的50%～65%[11]，是一種重要的天然甾體，被譽為“生命的鑰匙”[12]，BS最初研究都集中在降膽固醇功效及機制上，同時降膽固醇功效也是目前研究最多和最深的。后有研究顯示，植物甾醇還有抗炎癥、免疫調節、抗腫瘤、中樞神經系統調節作用[2]，其分子機制尚不清楚，也未形成完整的信號通路模型。以抗腫瘤和抗炎作用為結合點，本文初步探討了其對肝纖維化的作用與作用機制。

CCL4是一種選擇性肝毒性物質，能活化HSCs，促使肝纖維化。肝纖維化是終末期肝病發生的基礎，發病機制異常復雜，HSCs活化是肝纖維化發生的細胞學基礎，另外，各種細胞、細胞因子等也參與此過程[13]。去除致病因素是最佳治療策略，但許多慢性肝病中，致病因素和相關因素往往難以消除，這表明開發抑制肝纖維化進展并誘導其消退的特異性抗纖維化藥物的重要性。本實驗BS甾醇降低肝指數，降低血清ALT、AST活性，減少細胞外基質CollagenⅠ的沉積和HSCs活化標志物α-SMA的表達，提示BS能降低肝臟損傷并抑制纖維化進程。

TGF-β可以激活HSCs并使其增殖，活化的HSCs可以通過自分泌和旁分泌的途徑持續不斷的釋放細胞外基質，激活鄰近的HSCs，導致持續不斷地發生纖維化。TGFβ/Smad信號通路是肝纖維化過程討論得最為廣泛的分子機制，本實驗中，CCL4組明顯升高了TGFβ和Smad2/3的蛋白含量，BS降低其表達，提示BS干預了此條信號通路的轉導，減輕纖維化程度。

NF-κB信號通路能加快HSCs的激活，其抑制劑能降低肝纖維一些重要蛋白的表達并誘導HSCs產生凋亡，延緩纖維化進程[14]，也有學者報道，在膽總管結扎的肝纖維化中，TNF-α也加重纖維化程度[15]。同時，本課題前期工作也驗證TNF-α參與肝纖維，本實驗中，選擇TNF-α-NF-κB這條經典的炎癥通路做了探討，結果發現CCL4組，TNF-α和p- NF-κB高表達，BS明顯地降低了其表達，提示BS亦干預了此條炎癥通路的轉導。

綜上所述，BS對CCL4誘導的小鼠肝纖維化有保護作用，其機制可能與TGFβ/Smad2/3和TNF-α- NF-κB相關。

(致謝：本實驗在湖北民族大學醫學實驗中心和附屬民大醫院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室完成，感謝支持。)