魚(yú)藤素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖的影響

呂滿霞，方瓊彤，陳彥潔，柳傳毅，吳新榮

(1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641； 2. 中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510010)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見(jiàn)的肺癌類型，約占85%[1]。盡管化療可緩解癥狀并提高生存率，但NSCLC患者的5年生存率仍然較低[2]。因此急需尋找NSCLC治療新靶點(diǎn)及副作用較少，可提供更有效的治療效果的新型抗癌藥物。魚(yú)藤素(Deguelin)是一種天然異黃酮類化合物，已被證明具有針對(duì)多種癌癥的抗腫瘤活性，包括肺癌[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)以A549細(xì)胞為研究對(duì)象研究魚(yú)藤素對(duì)其體內(nèi)外增殖的影響，以期為魚(yú)藤素治療肺癌及其抗腫瘤活性提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí) BALB/c 裸鼠(♀)，3～5周齡，體質(zhì)量(15～20)g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)編號(hào):SCXK(粵)2018-0002，于中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.3 試劑魚(yú)藤素(deguelin，批號(hào)D0817)、二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)D2650)均購(gòu)于Sigma公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)于Gibco公司；胰酶消化液、PBS緩沖液購(gòu)于Hyclone公司；CCK-8試劑盒(批號(hào)CK04)、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)AD10)、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(批號(hào)C543)均為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；Hoechst 33258染色液(批號(hào)C1018)、蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào)C0105)購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器倒置熒光顯微鏡(IX7，日本Olympus公司)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiscan-GO，美國(guó)Thermo公司)；低溫高速離心機(jī)(RRESCO 17，美國(guó)Thermo公司)；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，美國(guó)BD公司)；生物組織包埋機(jī)(BM-VⅡ)；灌胃針(ZC-12，北京哲成科技有限公司)；石蠟切片機(jī)(CUT4060，德國(guó)MICROM)；自動(dòng)脫水機(jī)(HP300，深圳達(dá)科為醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 藥物配制將魚(yú)藤素溶于少量DMSO，配制成100 mmol·L-1母液，分裝后置于-20 ℃冰箱避光保存。使用時(shí)，用培養(yǎng)基將母液稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)從細(xì)胞庫(kù)中取出A549細(xì)胞，快速融解后于超凈工作臺(tái)中將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，以轉(zhuǎn)速1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入2～3 mL完全培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的恒溫箱中，待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶(70～80)%時(shí)，進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK-8法將細(xì)胞以2×107·L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。24 h后，取出細(xì)胞已經(jīng)貼壁的96孔板，棄去舊培養(yǎng)基，加入不同濃度魚(yú)藤素(1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)分別作用24、48、72 h，對(duì)照組僅含細(xì)胞及培養(yǎng)基，空白組僅含有培養(yǎng)基。然后每孔加入100 μL 10% CCK-8工作液，完畢后于孵化箱中孵育4 h，于波長(zhǎng)為450 nm處的酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞存活率/% =[(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/( OD對(duì)照組-OD空白組)]×100%，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

2.4 赫斯特染色實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞以1×108·L-1接種于6孔板中，每孔2 mL，均勻分布。24 h后加入不同濃度的魚(yú)藤素(5、10、20 μmol·L-1)，作用24 h后將舊培養(yǎng)基吸出，PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入1 mL配制好的染色液，靜置7～8 min，染色完畢，吸出染色液，隨后用PBS緩沖液洗滌2次，加入1 mL新的PBS，置于熒光倒置顯微鏡下藍(lán)色激發(fā)光下拍照。

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組給藥同“2.4”，藥物作用24 h后收集細(xì)胞，用冷PBS緩沖液重懸細(xì)胞，離心，棄上清液，重懸于500 μL的結(jié)合液，再加入5 μL Annexin V-FITC溶液和5 μL PI溶液，吹打混勻，避光孵育15 min，隨后轉(zhuǎn)移至流式管中，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞分組給藥同“2.4”，藥物作用24 h后收集細(xì)胞，用冷PBS緩沖液重懸細(xì)胞，離心，棄上清液，滴加1 mL預(yù)冷的70%乙醇，置于-4 ℃固定24 h，離心，棄上清液，用冷PBS緩沖液重懸細(xì)胞，離心，棄上清液，加入500 μL按試劑盒配置好的工作液，緩慢重懸細(xì)胞，于37 ℃孵化箱中避光孵育30 min 后，轉(zhuǎn)移至流式管中，立即采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.7 裸鼠移植瘤模型裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，碘伏消毒裸鼠右側(cè)腋下皮膚，注射200 μL制備好的A549細(xì)胞懸液，含有1×107個(gè)細(xì)胞，接種完后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，裸鼠的活動(dòng)狀況。每2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量計(jì)算皮下腫瘤體積(V= 0.5×長(zhǎng)徑×(短徑)2)，待腫瘤體積達(dá)到50 mm3后，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組(玉米油)、魚(yú)藤素低劑量組(2.5 mg·kg-1)、魚(yú)藤素中劑量組(5 mg·kg-1)、魚(yú)藤素高劑量組(10 mg·kg-1)，每組6只，并采用灌胃方式進(jìn)行給藥，劑量為100 kg·L-1，每?jī)商旖o藥1次，每次給藥前測(cè)定裸鼠移植瘤體積和裸鼠體重，連續(xù)給藥21 d,頸椎脫臼處死。將剝離的腫瘤組織按組別及時(shí)放進(jìn)10%的甲醛中固定，用于HE染色切片，于熒光倒置顯微鏡下觀察移植瘤的病理形態(tài)學(xué)變化情況。

3 結(jié)果

3.1 魚(yú)藤素對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用如Fig 1所示。與對(duì)照組相比，魚(yú)藤素作用24 h后，隨著給藥濃度的增加，魚(yú)藤素對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增加，其中魚(yú)藤素作用A549細(xì)胞24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)，分別為(10.82±1.21)μmol·L-1、(7.11±0.82)μmol·L-1、(5.55±0.42)μmol·L-1。同時(shí)，隨著魚(yú)藤素處理時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞的細(xì)胞存活率降低(P<0.01)。由此可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，魚(yú)藤素對(duì)A549細(xì)胞增殖具有抑制作用(P<0.01)，且呈濃度和時(shí)間依賴性。

Fig 1 Effects of different concentrations of deguelin on A549 cell viability n=3)

3.2 魚(yú)藤素對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響5、10、20 μmol·L-1魚(yú)藤素作用A549細(xì)胞24 h后，赫斯特染色觀察其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。如Fig 2所示，對(duì)照組細(xì)胞密集，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，少量亮藍(lán)色熒光出現(xiàn)，表明少數(shù)細(xì)胞核受損，凋亡細(xì)胞數(shù)少；隨著魚(yú)藤素給藥濃度的增加，亮藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)且數(shù)目增多，到達(dá)魚(yú)藤素20 μmol·L-1高濃度時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核均發(fā)出亮藍(lán)色熒光，細(xì)胞形態(tài)皺縮，說(shuō)明魚(yú)藤素的作用下能夠損傷A549細(xì)胞形態(tài)。

Fig 2 Morphological effect of deguelin on A549 cells

3.3 魚(yú)藤素對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響5、10、20 μmol·L-1魚(yú)藤素作用于A549細(xì)胞24 h后，Annexin-V FITC/PI 雙染結(jié)果如Fig 3所示，其具體的凋亡細(xì)胞百分比分布見(jiàn)Tab 1。與對(duì)照組相比，隨著魚(yú)藤素給藥濃度的增加，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡以及總凋亡的百分率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明魚(yú)藤素能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡，并呈劑量依賴性。

Fig 3 Effect of deguelin on cell apoptosis of A549 cells

Tab 1 Apoptotic cell distribution after A549 treatment with deguelin for 24 h n=3)

3.4 魚(yú)藤素對(duì)A549細(xì)胞周期的影響如Fig 4所示，對(duì)照組處于 G2/M 期的細(xì)胞百分比為(14.79±0.86)%，而5、10、20 μmol·L-1的魚(yú)藤素處理組中處于G2/M 期的細(xì)胞百分比分別為(24.91±1.35)%、(44.38±2.21)%、(45.69±1.04)%。因此，同對(duì)照組相比，魚(yú)藤素處理組中細(xì)胞處于G2/M 期的百分比增加(P<0.01)，且呈濃度依賴性，即魚(yú)藤素使A549細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。

Tab 2 Percentage of cell distribution after 24 h treatment with different concentrations of deguelin in A549 cells n=3)

Fig 4 Effect of deguelin on cell cycle of A549 cells by flow cytometry

3.5 魚(yú)藤素對(duì)體內(nèi)裸鼠移植瘤的影響魚(yú)藤素可以抑制A549異種移植模型中的腫瘤生長(zhǎng)(Fig 5A)，給藥21 d后，對(duì)照組的腫瘤體積已達(dá)到約920 mm3，但在2.5、5、10 mg·kg-1魚(yú)藤素給藥組中，平均腫瘤體積分別約為369、251、190 mm3(Fig 5B)。同時(shí)，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)魚(yú)藤素處理的組之間荷瘤小鼠的體質(zhì)量沒(méi)有變化，表明魚(yú)藤素沒(méi)有明顯的毒性作用(Fig 5C)。由Fig 5D可知，在空白對(duì)照組中，可見(jiàn)細(xì)胞密集成片排列，細(xì)胞體積較大且不規(guī)則、細(xì)胞核顏色較深，并且有核分裂。而魚(yú)藤素處理組中可以觀察到細(xì)胞體積皺縮，排列稀疏，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，且隨著給藥量的增加，變化越明顯。由此從腫瘤細(xì)胞形態(tài)上驗(yàn)證了魚(yú)藤素可抑制移植瘤的增長(zhǎng)。

Fig 5 Tumor growth in vivo suppressed by deguelin (n=6)

4 討論

魚(yú)藤素是一種天然產(chǎn)物，存在于多種植物物種中，如魚(yú)藤(Derristrifoliata)，栓皮豆(Munduleasericea)，毒灰葉(Tephrosiatoxicaria)，浮氏灰葉(Tephrosiavogelii)和畢澄茄(Pipecubeba)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)藤素或通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期和抗血管生成等方面達(dá)到抑制腫瘤增殖的作用[4-6]。本研究以A549細(xì)胞為模型，發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤素能明顯提高A549細(xì)胞凋亡率，抑制細(xì)胞增殖，這與Hsu等[7]研究魚(yú)藤素對(duì)肺癌細(xì)胞H460的作用結(jié)果相似，表明魚(yú)藤素能促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。此外，研究表明魚(yú)藤素可以通過(guò)下調(diào)H1299細(xì)胞中CDK4、CDK6、CCND1基因表達(dá)使細(xì)胞阻滯在 G0/G1期，達(dá)到抗腫瘤作用[8]，而CDC2與cyclin B復(fù)合體正調(diào)控G2/M期檢查點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，是推動(dòng)細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9]，因此進(jìn)一步探討魚(yú)藤素是否通過(guò)調(diào)節(jié)CDC2與cyclin B復(fù)合體相關(guān)機(jī)制使A549細(xì)胞阻滯在G2/M 期，相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

人體腫瘤裸鼠移植瘤模型可用于研究人類疾病發(fā)生機(jī)制和生理學(xué)特性。Rygaard[10]于1969年首次建立了人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型。目前，裸鼠移植瘤模型已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選中，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌和結(jié)腸癌等[11-13]。近年來(lái)，也有通過(guò)建立裸鼠移植瘤模型來(lái)研究魚(yú)藤素的體內(nèi)活性的相關(guān)報(bào)道。Li等[14]于6周齡無(wú)胸腺裸鼠右側(cè)皮下接種肺癌細(xì)胞(NCI‐H1299)建立模型，腫瘤體積達(dá)到100 mm3后，魚(yú)藤素(3 mg·kg-1)給藥21 d處死裸鼠。結(jié)果表明魚(yú)藤素可通過(guò)部分抑制Bmi1和誘導(dǎo)Noxa表達(dá)而對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。Li等[15]將HepG2細(xì)胞(3×106)接種于6周齡♀無(wú)胸腺裸鼠右側(cè)皮下，當(dāng)腫瘤體積接近100 mm3時(shí)，隨機(jī)分組給藥，魚(yú)藤素(4 mg·kg-1)每3 d腹腔注射給藥1次，接種細(xì)胞34 d后采用安樂(lè)死并提取腫瘤塊，通過(guò)平均腫瘤體積和質(zhì)量對(duì)魚(yú)藤素藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明同空白對(duì)照組相比，魚(yú)藤素明顯抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。本研究通過(guò)接種A549細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型來(lái)評(píng)估魚(yú)藤素對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性，結(jié)果表明：魚(yú)藤素可以明顯抑制A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，而對(duì)裸鼠沒(méi)有明顯的毒副作用。

綜上所述，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，魚(yú)藤素對(duì)A549細(xì)胞存在抗腫瘤活性，并與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞阻滯相關(guān)，為加速開(kāi)發(fā)魚(yú)藤素作為臨床抗癌制劑提供理論基礎(chǔ)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成，特別感謝實(shí)驗(yàn)室老師的指導(dǎo)與幫助。)