谷氨酰胺轉運蛋白ASCT2的研究進展

梁寶瑜，金 春，高儷原，李余佳，王桭屹，張 峰，2，3，鄭仕中，2，3

[南京中醫藥大學 1. 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室、2. 江蘇省中藥功效物質重點實驗室、3. 中藥品質與效能國家重點實驗室(培育)，江蘇 南京 210023]

谷氨酰胺是人體內含量最豐富的一種非必需氨基酸。而在高增殖率細胞(如炎癥細胞、干細胞、肺癌細胞)中，谷氨酰胺代謝明顯增加。谷氨酰胺進入胞質后，在谷氨酰胺酶的作用下，轉變為谷氨酸，再進一步在谷氨酸脫氫酶等的作用下變為α-酮戊二酸(α-KG)，回補三羧酸循環，為線粒體氧化磷酸化提供碳源，保障細胞的能量供應，因為能量代謝穩態是維持心肌細胞等機體細胞形態穩定和功能的正常的重要保證[1]。谷氨酰胺的酰胺基和氨基還可以為多種重要生物分子(如非必需氨基酸、核苷酸、己糖胺等)的合成提供氮源，保障細胞的持續增殖。此外，谷氨酰胺是合成谷胱甘肽的重要前體，在維持細胞氧化還原穩態中起關鍵作用[2]。谷氨酰胺還可以作為藥物，提高小鼠大鼠心肌缺血/再灌注損傷后心肌細胞抗凋亡能力，增強保護性蛋白HSP70的表達[3]。因此，谷氨酰胺代謝在細胞(特別是高增殖率的細胞)的蛋白質和能量代謝中起著核心作用。

谷氨酰胺必須通過細胞膜上特異性載體的轉運，才能進入細胞內發揮作用，其中命名為丙氨酸-絲氨酸-半胱氨酸轉運載體2(alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2)的Na+依賴性谷氨酰胺載體ASCT2最為重要。人ASCT2在正常的肺、骨骼肌、大腸、腎臟、睪丸、腦中廣泛表達[4]。另外，研究表明[5]，ASCT2在結直腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、腎癌和腦癌中的表達明顯增加，表明谷氨酰胺轉運體ASCT2與人類生理功能及很多重大疾病有密切關聯。本文主要綜述ASCT2的細胞生物學功能及其在疾病中的調控作用的相關研究進展。

1 ASCT2的生物學功能

2 ASCT2生物學功能的調控

2.1 ASCT2翻譯后修飾在細胞生物學中，蛋白質翻譯后修飾作用對蛋白質活性的調節、穩定性，以及與其他蛋白的相互作用等細胞過程起著至關重要的作用。研究發現[12]，ASCT2翻譯后修飾的一個典型路徑——N-糖基化。N-糖基化路徑能夠精確地定位蛋白質在細胞質膜中的位置。據報道，有研究根據生物信息學預測的ASCT2的N-糖基化位點是2個天冬氨酸殘基(N163和N212)，然后用定點突變的方法取代這兩個殘基，驗證了ASCT2存在N-糖基化的靶點。Garaeva等[6]的三維結構顯示，N212暴露在細胞外環境中，而N163隱藏在結構的間隙中，該三維結構更直觀地證明了N-糖基化位點的存在。但是，Console等[13]在完整細胞和重組的ASCT2蛋白質脂質體中進行的研究結果表明，N-糖基化/去糖基化狀態對ASCT2蛋白Na+依賴性反向轉運中性氨基酸的內在轉功能影響不大，但N-糖基化對ASCT2轉運到膜上的過程至關重要。所以非糖基化重組的ASCT2適用于人ASCT2的功能研究。

在細胞不同的生命時期，同一個分子可能有不止一種的修飾作用，而且這些作用可能是短暫的，也可能是穩定持久的。Aebersold等[14]發現另一個常見的ASCT2翻譯后修飾作用是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化。磷酸化通常與蛋白功能的特殊階段(信號激活或抑制)聯系在一起。前期文獻報道，在表達人類ASCT2異構體的X卵母細胞中，放射性標記的絲氨酸的攝取受到蛋白激酶SGK1、3和PKB活性的影響，但該研究沒有明確ASCT2序列中的磷酸化序列。Palmada等[15]假設激酶活性對ASCT2的動力學最大轉運速度Vmax有影響，但不影響它的動力學米氏常數(半飽和常數)Km。因此，他們猜測ASCT2磷酸化位點不在常規位點，或者是因為另一個未知的蛋白正在磷酸化來反過來調節ASCT2的活性。ASCT2除了N-糖基化和絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的磷酸化等翻譯后修飾外，還有賴氨酸泛素化和乙?；?，以及精氨酸單甲基化，但是對這些修飾作用的生物學意義的研究尚不夠清晰，因此本文不作闡述。

2.2 ASCT2的蛋白-蛋白間相互作用前期研究報道，ASCT2是雷帕霉素(mTOR)信號通路質膜上的一種蛋白，它的一個重要的功能是與mTOR信號通路的聯系。mTOR是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶，通過與ASCT2以及其他幾種蛋白的相互作用，形成兩個復合物(mTORC1和mTORC2)，參與生長、能量代謝、氨基酸代謝等多種信號途徑。早前研究發現，人ASCT2與PDZK1(參與調節許多SLC家族成員的支架蛋白)有物理性相互作用，后續研究證明，這種物理性相互作用是通過與一類PDZ結合域結合發生的[11]。PDZ結合域是人類基因組編碼的最常見的蛋白質相互作用域。近期研究發現，另一種結合蛋白質的PDZ結合域為SNX 27(sorting nexin 27)，它通過與ASCT2結合來提高ASCT2在質膜中的穩定性，從而增強谷氨酰胺的攝取，來保證細胞對能量和氮源的需求，另一方面，增強氨基酸刺激下的mTORC1激活[16]，促進細胞的生長增殖。另有研究發現，銜接因子相關蛋白復合體1(adaptor-related protein complex 1 gamma 1，AP1G1)與ASCT2、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)有物理性相互作用，并形成ASCT2-AP1G1-EGFR異三聚體復合物，通過共同靶向ASCT2和EGFR，可以克服人頭頸部鱗狀細胞癌(human head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)對西妥昔單抗的耐藥性[17]。

2.3 氧化還原對ASCT2轉運活性的調節作用半胱氨酸殘基在蛋白質修飾中具有多種調節作用，還參與調控細胞的氧化還原狀態。Scalise等[9]利用重組的人ASCT2蛋白脂質體進行的研究表明，ASCT2可以感知影響半胱氨酸殘基的氧化還原狀態的化合物，或者能夠感知直接和半胱氨酸殘基發生反應的化合物。其中，這些還原態的化合物能刺激ASCT2的動力學最大轉運速度(Vmax)，但不影響ASCT2對底物的親和力；而氧化態的化合物通過形成二硫鍵，會損害ASCT2蛋白質的功能。這些研究結果表明，還原態的半胱氨酸殘基有助于ASCT2的轉運功能。后續研究采用定點突變技術，構建了ASCT2在畢赤酵母(P.Pastoris)(外源蛋白真核表達體系之一)中過表達的8個半胱氨酸-丙氨酸(Cys-Ala)突變體，該研究結果發現，7個Cys-Ala突變體不影響ASCT2的轉運活性，但是與含巰基試劑發生反應。只有位于核心區域的第467位半胱氨酸殘基C467的突變體不但能夠感知生理濃度下的含巰基試劑，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)，并且是ASCT2與底物的結合以及易位的關鍵區域。這些結果表明，半胱氨酸殘基可能在生理條件下導致活化的還原性蛋白與非活化的氧化蛋白之間的相互轉換，從而使得ASCT2活化或者失活，因此，半胱氨酸殘基C467對ASCT2轉運活性至關重要。

3 ASCT2在疾病中的作用

3.1 ASCT2在腫瘤組織中的調節目前，對ASCT2的研究主要是在能夠獲取可重復信息的癌細胞或永生化細胞系的模型中進行的。由于腫瘤細胞的代謝重排，在這些模型中研究的分子機制與正常組織中的分子機制有很大的不同。所以，ASCT2在疾病中的調控知識是復雜的?，F階段的研究表明，ASCT2具有向細胞轉運，參與代謝和信號通路轉導的氨基酸的功能。該功能可能與腫瘤相關蛋白有關聯。例如，Reynolds等[18]的研究發現，通過E2F-3(transcription factor 3，E2F-3)誘導的ASCT2的過度表達，導致腫瘤抑制因子成視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，pRb，RB或RB1)的下調。由于細胞周期進程需要合成多種新物質，而谷氨酰胺為多種重要生物分子(如核苷酸、非必需氨基酸等)的合成提供氮源，在蛋白質和能量代謝中起著核心的作用，因此，Rb也可能直接調控參與谷氨酰胺代謝的蛋白質ASCT2。另一方面，谷氨酰胺轉運蛋白ASCT2和谷氨酰胺代謝在多種腫瘤細胞生存和增殖中起著關鍵的作用。MicroRNA的調控研究揭示，miRNA-137與ASCT2在多種腫瘤中具有負相關的關系。在甲基-CpG結合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2，MeCP2)和DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)作用下，miRNA-137啟動子區域發生去甲基化反應，從而增強其對下游ASCT2的抑制作用，進一步抑制ASCT2表達以及谷氨酰胺代謝，導致腫瘤細胞死亡[19]。因此，ASCT2在腫瘤組織中的調節作用與其谷氨酰胺的轉運功能，以及谷氨酰胺的代謝密切相關，可通過直接調控ASCT2的表達，或者通過ASCT2的上下游因子調控ASCT2的表達來調控谷氨酰胺代謝，抑制腫瘤細胞生存和增殖。

3.2 ASCT2在非腫瘤組織的調控ASCT2在腫瘤細胞中的調節作用已有較多研究，然而，其在非腫瘤組織中的調控作用的研究較少。Yi等[20]研究表明，谷氨酰胺由ASCT2轉運進入豬腸細胞，然后通過激活mTOR信號通路而不依賴AMPK信號通路，促進豬腸細胞的生長。Liu等[21]在小鼠乳腺中的研究揭示，ASCT2的表達與依賴mTOR的氨基酸傳感器G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)有關，ASCT2可能通過GPCRs來調節乳蛋白的合成。因此，Liu等認為ASCT2可以作為調節乳蛋白合成的分子靶點。ASCT2在非腫瘤組織中的調控主要通過其轉運谷氨酰胺的功能來調節細胞生長，以及參與乳蛋白合成的調控。

4 ASCT2抑制劑的研究

谷氨酰胺轉運體ASCT2參與乳腺癌、肝癌等多種疾病的調控，因此，ASCT2可能是藥物的重要靶點，研究ASCT2的抑制劑可能是疾病治療的一個重要策略。較早的研究發現，以ASCT2首選底物谷氨酰胺衍生物的結構為基礎，發現芐基絲氨酸(benzylserine)和芐基半胱氨酸(benzylcysteine)對大鼠ASCT2的具有競爭性抑制作用，表明可用底物模擬藥物來研究ASCT2的抑制劑。后續研究發現，側鏈空間位阻小、疏水性低的氨基酸衍生物與ASCT2結合位點具有很強的相互作用[22]，它以更高的親和力與ASCT2結合，從而競爭性地抑制或者阻斷谷氨酰胺與ASCT2結合。而近年利用大鼠ASCT2重組的蛋白脂質體進行的研究，發現ASCT2能通過與鼠序列中存在一種金屬結合模體(CXXC)與Hg及其有機衍生物等金屬發生反應，從而抑制ASCT2對谷氨酰胺的轉運[23-24]。然而據報道，人ASCT2失去了CXXC序列，但是ASCT2的半胱氨酸殘基依然能夠與Hg衍生物形成共價鍵，可以不可逆轉地阻斷ASCT2的活性[4,6,22]。ASCT2共價抑制的發現能夠避免在某些條件下，內源性氨基酸(特別是谷氨酰胺)的增加，會將ASCT2抑制劑從結合位點上轉移的問題。近年來，在研究ASCT2的抑制劑的過程中，發現芐基脯氨酸衍生物能夠影響ASCT2的轉運活性，基于芐基脯氨酸衍生物支架基礎研究的ASCT2靶向性競爭性抑制劑應運而生[25]。

5 結論

ASCT2是細胞攝取谷氨酰胺的最重要的轉運體，對維持細胞谷氨酰胺穩態，以及依賴谷氨酰胺代謝的細胞的存活和增殖至關重要。然而，氨基酸在細胞中的穩態是一個錯綜復雜的網絡，化學上或基因上單純阻斷一個靶點的想法并不是適用于所有病理情況。同時，ASCT2在正常組織中也有廣泛表達和重要作用，直接靶向這種轉運可能會影響到正常組織的生理活動。所以深入研究ASCT2的功能及其調節，對揭示這種蛋白在生理和病理條件下的作用尤其重要，而最近研究得到的ASCT2冷凍電鏡結構，將為理解ASCT2的結構功能及其抑制劑的研究提供更精確的靶點，對設計出高效的，對正常組織生理活動影響小的靶向性的ASCT2抑制劑具有指導意義。