Notch信號通路在肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)中的研究進(jìn)展

李明星，顧勝龍，應(yīng)苗法，金燁成，趙 蕊

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 310016)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是由多種致病因素引起的遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈壓和肺血管阻力升高，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的發(fā)生，最終引起右心功能受限的慢性進(jìn)展性疾病[1]。PAH發(fā)生的病理機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳因素和環(huán)境因素，引起多種相關(guān)基因的突變，如骨形成蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)、內(nèi)皮素1、五羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體等[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路對調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、凋亡具有重要作用，廣泛參與動(dòng)脈粥樣硬化、肺動(dòng)脈高壓、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生[3]。本文主要對Notch信號通路參與肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)發(fā)生的過程作一綜述，以期為肺動(dòng)脈高壓治療藥物的開發(fā)提供新的思路。

甄小美臉上露出無奈的神情。我接著說：“那咱們想想，你還能做什么，讓自己覺得不無聊，覺得有意思？然后把它做到選擇輪里。你看我這個(gè)建議怎么樣？你要愿意試試，咱們就做；要不愿意試，也無所謂。咱們再想別的……”甄小美習(xí)慣了被提問，沒等我說完，立刻蹦出：“畫畫。”

1 PAH的概況

據(jù)2015年歐洲心臟病學(xué)會(huì)和歐洲呼吸學(xué)會(huì)制定的PAH診斷和治療指南，PAH被定義為：在血流靜息狀態(tài)下，平均肺動(dòng)脈壓≥25 mmHg，肺動(dòng)脈楔壓≤15 mmHg，肺血管阻力>3 Wood單位[4]。目前，根據(jù)病理特征和發(fā)病機(jī)制將PAH分為5大類：動(dòng)脈性PAH、左心疾病引起的PAH、肺部疾病或低氧引起的PAH、慢性血栓栓塞性PAH及不明原因引起的PAH，共21個(gè)亞類。臨床常用的靶向治療藥物包括內(nèi)皮素受體拮抗劑(波生坦、馬西替坦和安倍生坦)、5-磷酸酯酶抑制劑(西地那非、他達(dá)拉非)、鳥苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑(利奧西呱)、前列環(huán)素類藥物(依前列醇、伊洛前列素、曲前列尼爾和貝前列素)及選擇性前列環(huán)素受體激動(dòng)劑(司來帕格)[5]。最新調(diào)查表明，成年人PAH的年發(fā)病率約為每百萬人中有3～10例，且女性的發(fā)病率大于男性[6]。目前，由于PAH靶向治療藥物的療效和預(yù)后效果有限，以至于PAH患者的中位生存期約為2.8年，且患者易產(chǎn)生耐藥性；因此，深入探究PAH的發(fā)病機(jī)制及作用靶點(diǎn)，有利于新的治療藥物的開發(fā)。

2 Notch信號通路的作用機(jī)制

Notch信號通路主要由Notch受體、配體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子(CBF1/suppressor of hairless/Lag-1, CSL)組成，相鄰細(xì)胞的受體與配體在細(xì)胞間結(jié)合，活化Notch通路，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。目前研究發(fā)現(xiàn)，Notch有4個(gè)同源受體：Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4，Notch-1在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)，Notch-2在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，Notch-3表達(dá)于平滑肌細(xì)胞，Notch-4主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞。Notch配體存在于細(xì)胞表面，是一種單鏈跨膜蛋白，含有5個(gè)同源配體，即Dll-1，Dll-3，Dll-4，Jag-1 和 Jag-2；CSL為核轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別Notch通路下游的靶基因并與其啟動(dòng)子上DNA序列結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[7-8]。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路的激活包括CSL依賴途徑(經(jīng)典的Notch信號通路)和非CSL依賴途徑(非經(jīng)典的Notch信號通路)。當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后，Notch受體在胞外域S2位點(diǎn)和跨膜片段S3位點(diǎn)分別被ADAM金屬蛋白酶和γ-分泌酶切割，釋放Notch胞內(nèi)片段(Notch intracellular domain，NICD)，NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并與CSL結(jié)合，調(diào)控下游靶基因發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子(hairy and enhancer of split，Hes)、Hey、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21及細(xì)胞周期蛋白等的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡；但在活化過程中，NICD能被細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8(cyclindependent kinase 8, CDK8)磷酸化，并被E3泛素連接酶靶向蛋白酶體降解，導(dǎo)致Notch信號活化半衰期較短[9]。在Notch信號通路活化的過程中，Notch信號組成基因的突變會(huì)引起一系列遺傳性疾病，如骨質(zhì)疏松癥、T淋巴細(xì)胞白血病、腦血管疾病及精神分裂癥、腫瘤等[10]。

在PASMC中，Notch-Ca2+信號通路也參與了調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡的過程；在先天性PAH-PASMC中，鈣敏受體(Ca2+sensing receptor，CaSR)表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖；采用Jag-1蛋白處理PASMC15～60min，能夠活化Notch信號通路，增加儲(chǔ)存的鈣釋放(store-operated Ca2+entry, SOCE)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，促進(jìn)PASMC的增殖[25]。后來的研究顯示，在PASMC中，低氧和Jag-1誘導(dǎo)Notch3信號通路的活化，上調(diào)CaSR，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)PASMC的增殖；采用DAPT處理PASMC和低氧誘導(dǎo)的大鼠，大鼠右心室收縮壓、右心肥厚指數(shù)、右心室心肌纖維化的程度均降低，PASMC的增殖率也明顯降低，減輕PAH肺血管重構(gòu)[26]。另外，低氧能夠誘導(dǎo)PASMC中Notch3信號的活化，上調(diào)經(jīng)典的瞬時(shí)受體電位6(canonical transient receptor potential 6，TRPC6)通道，增加SOCE并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，促進(jìn)PASMC的增殖，誘導(dǎo)血管重構(gòu)；采用DAPT干預(yù)能夠逆轉(zhuǎn)此過程，降低肺動(dòng)脈壓力，緩解低氧誘導(dǎo)PAH[27]。由此揭示，CaSR和TRPC通過Notch信號通路共同調(diào)控PASMC的增殖，介導(dǎo)PAH肺血管重構(gòu)。

3 Notch信號通路在肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)中的作用

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和MCT能夠明顯上調(diào)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch3和細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule，ICAM1)的表達(dá)，下調(diào)Id的表達(dá)，誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)的發(fā)生；采用胸腺素β4處理內(nèi)皮細(xì)胞，Notch3和ICAM1的mRNA表達(dá)顯著減少，減輕右心室肥厚，發(fā)揮血管保護(hù)作用[21]。內(nèi)皮細(xì)胞特異性脯氨酰基羥化酶2(prolyl hydroxylase 2，PHD2)在調(diào)控肺血管重構(gòu)過程中具有重要作用，敲除PHD2的小鼠肺動(dòng)脈壓力和右心室體積逐漸升高，且Notch3和TGF-β的表達(dá)顯著增加，肺動(dòng)脈血管纖維化，誘導(dǎo)PAH肺血管重構(gòu)的發(fā)生[22]。由此表明，Notch信號通路參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控，但其在肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)發(fā)生中的研究較少，還有待進(jìn)一步研究其可能的作用機(jī)制。

第二課堂學(xué)分認(rèn)定流程各個(gè)高校雖然有差異，但學(xué)分的認(rèn)定統(tǒng)一由教務(wù)處制定規(guī)則，各個(gè)二級學(xué)院以及學(xué)生處等根據(jù)管理范圍為學(xué)生認(rèn)定。各高校對學(xué)生第二課堂學(xué)分認(rèn)定現(xiàn)狀存在以下問題：

在PAH發(fā)生過程中，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonaryarterial smooth muscle cells，PASMC)和肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary arterial endothelial cells，PAEC)的過度增殖及凋亡抑制，能夠引起肺動(dòng)脈血管中膜增厚、內(nèi)膜損傷及肺動(dòng)脈收縮性增加，最終導(dǎo)致肺血管重構(gòu)及PAH的發(fā)生[13]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，Notch信號通路參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分化和凋亡，對維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要作用，參與肺動(dòng)脈血管重構(gòu)的過程。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，Ang-Ⅱ)通過活化Notch信號通路誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，肺動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的發(fā)生；采用Notch信號通路抑制劑DAPT干預(yù)，能夠抑制Notch信號通路的激活，但Notch1和Notch4受體的表達(dá)無改變，Notch信號通路下游的同型半胱氨酸反應(yīng)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留泛素樣結(jié)構(gòu)域1蛋白(homocysteine-responsive endoplasmic reticulum-resident ubiquitin-like domain member 1 protein，HERP1)和HERP2表達(dá)降低，抑制中膜的增厚，抑制Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)[14]。在低氧誘導(dǎo)的PAH小鼠模型中，小鼠右心室收縮壓升高、右心肥厚，伴隨著Notch3通路被激活，發(fā)生肺血管重構(gòu)；給予小鼠腹腔注射Notch信號抑制劑DAPT，能夠抑制PASMC的過度增殖，降低肺動(dòng)脈壓力及減輕肺血管重構(gòu)[15]。另外，在野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的PAH大鼠模型中，Notch3和NICD3表達(dá)水平升高，肺血管細(xì)胞異常增殖、凋亡減少，導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管重構(gòu)；Notch信號抑制劑DAPT能夠抑制肺血管細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，改善肺血管重構(gòu)[16]。因此，探討Notch信號通路在肺血管重構(gòu)發(fā)生中的作用具有重要的意義。

另有研究發(fā)現(xiàn)[29]，Notch2在血管平滑肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與調(diào)控平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移過程；沉默Notch2會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈組織中平滑肌細(xì)胞增殖減少，肺動(dòng)脈異常狹窄。腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor α，TNF-α) 在PAH患者肺動(dòng)脈組織中高度表達(dá)，小鼠轉(zhuǎn)染過表達(dá)的TNF-α能夠引起自發(fā)性的PAH；進(jìn)一步研究顯示，TNF-α能夠下調(diào)PASMC中BMP6的表達(dá)，TNF-α和BMP6通過調(diào)控酪氨酸激酶c-SRC活化Notch2- Hey1/2信號通路，抑制Notch3-Hes1信號通路，促進(jìn)PASMC的增殖，誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)的發(fā)生；采用抗TNF-α免疫藥物依那西普能夠逆轉(zhuǎn)PAH肺血管重構(gòu)的進(jìn)程，修復(fù)異常的BMP-Notch信號通路[30]。

對于非CSL依賴激活途徑，目前的研究較少，仍不明確其中的調(diào)控機(jī)制。在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核水平上，非CSL依賴的Notch信號傳遞過程中，NICD能夠活化下游的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/mTOR復(fù)合物2(phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B/mTOR complex 2，PI3K/AKT/mTORC2)、Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)、核因子κB激酶抑制劑α/β(inhibitor of nuclear factor κB kinaseα/β，IKKα/β)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia induced factor 1α, HIF-1α)等信號通路并與其相互作用，取代CSL的轉(zhuǎn)錄活化，參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和免疫系統(tǒng)的激活[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，顱神經(jīng)嵴細(xì)胞中Notch配體Jag1的缺失與小鼠上頜發(fā)育不全或上頜骨缺陷相關(guān)；采用Jag1處理顱神經(jīng)嵴細(xì)胞能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的分化，增加酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)的磷酸化，上調(diào)Notch1靶基因Hes1、Hey1的表達(dá)，誘導(dǎo)Runx2和骨鈣素(osteocalcin，Ocn)的表達(dá)，采用Notch抑制劑N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT)進(jìn)行干預(yù)，Hes1、Hey1的表達(dá)降低，但Runx2和Ocn的表達(dá)無明顯改變；JAK2抑制劑能夠明顯降低Runx2和Ocn的表達(dá)，調(diào)控成骨細(xì)胞的分化[12]。由此可知，非經(jīng)典的Notch1- JAK2信號通路也參與了細(xì)胞的分化過程。

3.2 Notch信號通路對血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控作用正常情況下，肺動(dòng)脈血管內(nèi)的PASMC處于高分化的收縮型，維持血管的彈性和收縮血管。在多種刺激因素如低氧刺激下，PASMC由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化，異常增殖、遷移進(jìn)入血管內(nèi)膜，引起肺動(dòng)脈血管內(nèi)膜和中膜增生、肥大，發(fā)生肺血管重構(gòu)，肺動(dòng)脈壓力持續(xù)升高，引起肺動(dòng)脈高壓。研究發(fā)現(xiàn)，在低氧和MCT誘導(dǎo)PAH動(dòng)物模型中，Notch1、Notch3、Jag-1和HERP2蛋白在肺動(dòng)脈組織中高度表達(dá)，轉(zhuǎn)染可溶性Jag-1腺病毒至PASMC，Jag-1能夠抑制PASMC的增殖并促進(jìn)其凋亡，抑制Notch-HERP2信號通路的活化，使PASMC由分化表型向去分化表型轉(zhuǎn)換[23]。Notch3信號通路在調(diào)控肺血管平滑肌細(xì)胞增殖誘導(dǎo)的肺血管重構(gòu)中具有重要的作用；在PAH患者和大鼠肺組織中，Notch3 mRNA和NICD蛋白表達(dá)上調(diào)，γ分泌酶抑制劑DAPT能夠抑制PASMC中Notch3-Hes5信號通路的活化，促進(jìn)PASMC由增殖表型向去分化表型轉(zhuǎn)化，改善肺血管重構(gòu)。另外，活化Notch3信號能夠誘導(dǎo)下游Hes1蛋白表達(dá)上調(diào)，下調(diào)p27Kip1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)PASMC的增殖，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)；DAPT能夠抑制Notch3-Skp2-Hes1信號的傳遞，上調(diào)p27Kip1蛋白的表達(dá)，抑制肺血管細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，減輕肺血管重構(gòu)[16,24]。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，Notch信號通路參與調(diào)控肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的過程，導(dǎo)致PAH肺血管重構(gòu)的發(fā)生。對于肺血管重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制，目前的研究主要集中在經(jīng)典的Notch信號通路上，使用γ分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號的傳遞，能夠逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)的發(fā)生，減輕PAH。另外，Notch信號能夠與Wnt/β-catenin、BMP、NF-κB及鈣離子等信號通路相互聯(lián)系，共同調(diào)控肺血管的重構(gòu)，但目前揭示復(fù)雜信號通路參與調(diào)控肺血管重構(gòu)的研究成果較少，其調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此，未來的研究應(yīng)深入探索Notch信號通路參與調(diào)控肺血管重構(gòu)發(fā)生的作用機(jī)制，以及其與其他信號通路的關(guān)系，篩選出調(diào)控肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的靶基因，以期為Notch信號通路抑制劑及PAH治療藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

3.1 Notch信號通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程中的作用研究發(fā)現(xiàn)[17]，Notch信號對調(diào)控PAEC的增殖、凋亡和遷移能力具有重要的作用。在特發(fā)性PAH患者肺動(dòng)脈組織中，Notch-1的表達(dá)上調(diào)，Notch-1通過下調(diào)p21、Bcl-2和生存素的表達(dá)，促進(jìn)人PAEC的增殖，抑制其凋亡；采用γ-分泌酶抑制劑AMG2008827或Notch-1 siRNA處理PAEC，PAEC的增殖和遷移能力降低； AMG2008827處理低氧誘導(dǎo)PAH大鼠，能夠明顯降低大鼠右心收縮壓，改善右心肥厚[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)[19]，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Wnt、Notch信號誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)參與了PAH肺血管重構(gòu)的過程。在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，MCT通過激活NF-κB-骨形成蛋白受體(bone morphogenetic protein receptor，BMPR)-Smad-分化抑制因子(inhibitor of differentiation，Id)-Notch3(NF-κB- BMPR-Smad-Id-Notch3)信號通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，并發(fā)生EndMT，導(dǎo)致肺血管重構(gòu)的發(fā)生；抑制NF-κB的活化能夠抑制下游BMPR2-Smad-Id-Notch3信號通路基因的表達(dá)，抑制MCT誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及右心肥厚，減輕肺動(dòng)脈高壓[20]。另外，在MCT誘導(dǎo)的PAH小鼠模型中，NF-κB通路被激活，調(diào)控下游的BMPR2-Notch3信號通路，介導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及EndMT，導(dǎo)致右心室肥厚及肺血管重構(gòu)的發(fā)生[20]。