種子活力無損檢測方法研究進展

瞿志杰，賈良權，祁亨年，王瑞琴，趙光武

（1.浙江農林大學 信息工程學院，浙江 杭州 311300；2.湖州師范學院 信息工程學院，浙江 湖州313000；3.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300）

種子活力（seed vigor）是判定種子質量的重要依據，與農、林、園藝等生產息息相關，對農林業發展具有重要意義[1]。19世紀的德國種子檢查方法中已經有發芽速度、發芽速力、發芽力、生長力、種子大小等表示種子活力高低的檢測項目。1950年，國際種子檢驗協會（International Seed Testing Association,ISTA）和北美官方種子分析家協會（North American Association of Official Seed Analysts,AOSA）組織成立了ISTA活力測定委員和AOSA活力委員會，這兩大委員會負責總結全世界國家的種子活力測定成果。1980年發行的《種子活力測定方法手冊》概述了低溫測定方法、電導率測定等8種種子活力測定方法[2]。1982年中國學者[3]開始了種子活力的探索，通過發芽生理法測定白菜Brassica pekinensis、菜豆Phaseolus vulgaris、蘿卜Raphanus sativus等種子的活力。1996年，通過電導率等多項指標對濕地種子進行活力探測[4]。2001年第1次將機器視覺技術[5]引入農作物種子質量檢驗中，開啟了無損檢測的嘗試。在之后的10 a里，種子活力檢測研究逐步引入激光散斑技術、超微弱發光法、高光譜成像技術、電導法檢測技術、電子鼻探測技術等新型技術。這些檢測方法具有操作簡單、檢測速度快、準確率高和無損等優勢，隨著種子檢測技術領域的不斷拓展，將成為種子活力測定的新方向。

1 種子活力無損檢測方法

種子活力反映的是種子在田間條件下的出苗率和出苗時間，因此無損檢測方法都應基于種子活力相關的某種特性檢測從而間接獲得種子的活力值。總結起來，有基于光學特性、生理生化特性和外觀特性的3類種子活力無損檢測方法。其中，基于光學特性的無損檢測方法包括近紅外光譜檢測技術、高光譜檢測技術、激光散斑技術、葉綠素熒光檢測技術及激光檢測技術；基于生理生化特性的無損檢測技術有電子鼻檢測技術、電導法檢測技術、過氧化氫（H2O2）流速檢測技術以及可調諧半導體激光吸收光譜（tunable diode laser absorption spectroscopy，TDLAS）檢測技術；基于種子外觀特性的檢測技術主要是機器視覺檢測技術。

1.1 基于光學特性的種子質量檢測方法

當光輻射到種子時，種子會以表面反射和本體反射等能量形式轉移，并且種子在輻射不同強度和密集度的光之后所展現的特性也不同。利用種子對光的吸收特性，將種子的光學特性與內部活力指標建立關聯，可以利用該關聯對種子活力進行判別。

1.1.1 近紅外光譜檢測技術 近紅外光譜技術（near infrared spectroscopy，NIR）[6]的原理是近紅外光（波長780～2 526 nm）激發有機物的官能團，有機物組成的分子吸收近紅外光對應部分的能量，從穩定的基態躍遷到不穩定的激發態。不同的分子因具有特定的振動頻率，從而吸收的能量是特定的，所以可以生成特有的近紅外吸收光譜。利用此技術可以研究有機物中含氫基團（O—H，N—H，C—H，S—H和P—H）對近紅外光譜的吸收特性，可對種子活力開展定性和定量分析，并且該方法具有無損、成本低、無污染、速度快、不破壞樣品、測量方便等特點。

ALAMERY等[7]第1次通過創建偏最小二乘（PLS）預測模型來對種子活力等級進行分類，創建的二分類預測模型能夠識別低和中、高活力種子群，正確率分別為80%～100%和96.3%～96.6%，證明了近紅外光譜技術對種子無損檢測的可行性。尹淑欣等[8]采用矢量歸一化和主成分分析法對近紅外光譜技術獲得的數據進行預處理，去除數據噪聲并降維，利用BP神經網絡構建的模型對單粒玉米Zea mays種子進行識別，準確率達90.30%，識別時間僅需27.36 ms[9]。時偉芳等[10]測得春小麥Triticum aestivum單粒種子二面平均光譜數據，通過最小二乘法建立定性的模型，測單粒小麥種子的活力，準確率最優達91.3%。白京等[11]基于近紅外光譜技術測得玉米種子的數據，采用多項式平滑預處理（SG）曲線減小噪聲，應用支持向量機（SVM）構建判別模型獲得種子有無活力的判別正確率達95.56%。李武等[12]將近紅外光譜技術與競爭性自適應重加權法（CARS），無信息變量消除（UVE）和前向間隔偏最小二乘法（FiPLS）等3種方法相結合，篩選出最佳建模波段，利用偏最小二乘法回歸 （NISR）建立甜玉米種子活力相關指標的預測模型，實現了采集一次光譜測定3個參數，提高了種子無損檢測的效率。在實際生產應用中發現：該方法容易受其他因素的干擾，其中水份的干擾最為明顯，也最為常見。

1.1.2 高光譜檢測技術 高光譜成像技術（hyperspectral imaging technology）通過線陣掃面獲取種子樣本的空間信息和光譜信息，具有超多波段、光譜高分辨率和圖譜合一的特點。與近紅外光譜檢測技術測定在近紅外波長范圍內種子的吸收值不同，高光譜成像技術借助成像光譜儀，可在紫外、可見光、近紅外和中紅外等區域測定，可獲取數以百計波段，間隔非常小且光譜連續的光譜數據[13]。光譜中的每個像元均對應一條連續的光譜，能夠反映某一個點所代表的信息。該方法不僅擁有近紅外光譜檢測技術的高分辨率，還能通過直觀的圖像更加全面地了解樣本內部組成信息，通過測定的光譜數據可以無損檢測種子的相關活力[14]。

李美凌等[15]通過高光譜成像儀采集了水稻Oryza sativa‘滇雜31’（粳型三系雜交稻）、‘榮優225’（秈型三系雜交稻）和‘珍珠糯’（秈型常規稻）等3個品種共564粒種子的高光譜數據，并將獲取光譜數據后的水稻種子進行標準發芽實驗，得到了種子活力數據。基于主成分提取光譜波段，建立基于SVM的2個活力梯度的預測模型，94.44%的分類鑒別率初步論證了基于高光譜的雜交稻與常規稻種子活力檢測的可行性，并且表明波段選擇對模型的優化是有效的。許思等[16]選取22個雜交水稻品種共5 280粒水稻種子為實驗材料，通過人工老化處理得到3個活力梯度，實驗所有品種的研究結果都表明：基于高光譜成像技術的種子活力等級進行快速無損檢測普遍適用于雜交水稻，檢測準確率可以達90%以上。吳小芬等[17]研究了基于高光譜的常規種子活力檢測，選取2個不同的常規水稻品種（‘甬秈69’和‘中早39’）為研究對象，選取了8 889粒樣本，老化處理獲得3個活力梯度。結果表明：對種子的發芽率、簡易活力指數和苗長等活力參數的預測，所建立的幾種預測模型均取得了較好的結果，最優達98.9%。彭彥昆等[18]利用連續投影算法（SPA）獲得番茄 Lycopersicon esculentum種子的最優特征波長為713 nm，并借助統計學后得到的校正集和驗證集的正確率分別為93.75%和90.48%。尤佳[19]采用偏最小二乘與迭代遺傳算法協同（siPLS-GA）篩選光譜特征波長，對脫絨棉種用高光譜圖像技術進行無損檢測，測得的數據用主成分分析進行降維，創建判別分析和SVM模型，另用折交叉驗證算法（K-CV）和粒子群優化算法（PSO）對SVM模型進行參數尋優，達89.7%的分類精度。LI等[20]對稻種獲得的原始高光譜數據采用小波包進行預處理，對光譜數據進行協方差分析降維和主成分分析提取特征波段，論證了稻種活力通過最小二乘支持向量回歸算法（LS-SVR）對其進行測定是可行的，且獲得相關系數均超過95%的預測集和校正集。該系列研究在雜交稻、常規稻多個品種的上都獲得了有效性驗證，但同時也表明各品種種子均存在差異，需要對不同品種建立檢測模型。

1.1.3 激光散斑技術測定 生物散斑是激光照射在種子表皮呈現顆粒結構，產生的這種顆粒狀態被稱作散斑現象。主觀散斑是經過透鏡成像形成的散斑，客觀散斑則是在自由空間傳播形成的散斑。種子散斑的變化反映種子內在活力的某些相關性質，因而能作為一種新型的種子無損檢測技術[21-23]。

MOREIRA等[24]使用激光散斑技術采集玉米種子的散斑圖像，基于測得的指標建立種子活力分析的基本法則。激光散斑技術有快速無損測定種子活力的潛質，但尚停留在實驗室研究階段。王鳳鵬等[25]采用主觀和客觀激光散斑技術對大豆Glycine max種子進行無損檢測，以圖像的形式給出定性檢測結果，并使用廣義差分算法進行處理，實驗結果驗證了主觀和客觀激光散斑方法均可檢測大豆活力。趙瑛琦等[26]對麻皮豌豆Pisum sativum種子運用激光散斑技術進行活力測定，部分散斑圖像用時間對比分析法處理；同時結合栓皮櫟Quercus variabilis種子實際發芽結果與散斑值變化曲線的對比分析結果，驗證了激光散斑能快速無損檢測栓皮櫟種子活力。該研究進展驗證了激光散斑技術可以快速無損地鑒別種子活力，但還需要克服不同品種的種子產生的實驗結果差異性。

1.1.4 葉綠素熒光檢測技術 葉綠素熒光檢測技術是當波長為650～730 nm的光束射在種子表皮上，種皮上的葉綠素將會以熒光和熱的形式釋放能量，通過對種皮上葉綠素釋放的熒光信號進行測定可獲得種子活力等級的相關信息。檢測到種子表皮的熒光信號越小，葉綠素含量也越少，則證明該種子活力也越高。通過葉綠素熒光檢測技術可對種子活力進行快速無損的檢測，由于該方法只對葉綠素有特異性，減少了其他光信號噪聲對熒光信號的影響，為該方法的普及應用打下了良好的基礎。JALINK等[27-28]最先采用650～730 nm波長激光照射單粒甘藍Brassica oleracea種皮，并根據種皮產生的葉綠素熒光信號對種子進行活力分級。證實葉綠素熒光信號大小與種子質量呈負相關，選取13%葉綠素熒光信號來判別種子活力，可使種子活力等級的分選正確率由90%提升到97%。由于種皮本身葉綠素含量較少，且隨成熟度提高葉綠素含量會不斷降低，導致檢測的熒光信號差異性趨小，增加了監測難度。KENANOLO[29]將4個不同品種和階段的辣椒Capsicum annuum種子采用美國Satake公司生產的葉綠素熒光技術種子分選機分級，依據葉綠素熒光信號分級后的種子活力顯著增高。DELEURAN等[30]利用激光對單粒菠菜Spinacia oleracea種子進行葉綠素熒光檢測過程中，發現葉綠素熒光信號分級更適合最終的種子分級，并且可以對每年至少20%要丟棄的小顆粒蔬菜種子進行檢測和分選，將分選后的種子重新投入農業生產中。葉綠素熒光檢測法屬于高效無損的種子活力檢測技術，但是在種子樣本中葉綠素含量過高或者過低的情況下，最后獲得的種子活力分級效果欠佳。

1.1.5 其他光特性檢測技術 紅外熱成像技術[31]能夠很好地反映種子表面的溫度范圍和分布的細微變化。利用種子新陳代謝產生的這種輻射性能的熱場，紅外熱成像技術能觀測到在可見光下無法用肉眼直接觀察到的種子外形輪廓和表面熱分布。種子表面各點的溫度及其變化在顯示屏上以灰度差和偽彩色的形式表現，從而獲得種子表面溫度高低與種子活力高低關系的重要指標。KRANNER等[32]通過蒙特卡羅模擬開發了 “虛擬豌豆種子”的計算機模型，該模型可以有效預測吸水后豌豆種子相關活性值。軟X-射線造影測定法的原理是利用重離子不能被有活力的種子吸收，而重離子能滲入失去活力的種子內部并對X-射線有強烈的吸收性能[3]。楊冬風[33]通過軟X-射線下曝光造影鋇鹽處理過的種子，發現死傷組織呈明亮白色，反之為黑色。建立BP神經網絡識別模型能有效檢測軟X-射線下曝光造影的圖片，并且輸出的種子活力判斷結果達95%。生物的微弱發光（又稱生物發光）是由生命體（細菌微生物、植物、動物、人等）光細胞或光細胞所組成的光器官產生[34]。生物產生的光子輻射極其微弱，一般在幾到幾千個光子之間。生物微弱發光能反映生物系統的氧化代謝等諸多生命活動。章華仙[35]采用BPCL儀測試不同時間光照下稻種的微弱發光實驗，發現種子的微弱發光特性可以定性地判斷出種子的新陳度。

1.2 基于生理生化特性的種子質量檢測方法

1.2.1 電子鼻檢測技術 種子在存儲中會釋放出一些羰基化合物（如醛類、酮類、醇類等），還有少量醇類和其他化合物的氣體[36]。電子鼻是一種能夠發現、識別和辨別氣味的電子系統，其工作原理是模擬人的嗅覺器官。電子鼻一般由模式識別子系統、信號處理子系統和氣敏傳感器陣列等3大部分組成[37]。種子釋放的痕量氣體，可以被電子鼻快速識別，并分析測得的數據來識別種子活力。

偉利國等[38]研制了一套電子鼻檢測系統能快速識別小麥活性。該系統由5個可以分別提取2個特征值氣敏傳感器組成，對測得的數據用歸一化和平滑濾波進行處理，通過比較后采用PNN神經網絡進行模式識別，訓練樣本的回判準確率為100%，測試樣本網絡識別正確率為91%。ZHANG等[39]利用電子鼻獲取活力不同甜玉米種子的氣味信息，將測取的氣味信息進行主成分分析，獲得各個氣味成分的數據貢獻率，并結合Loading分析主要差異性氣體，建立Lib-SVM模型進行種子活力判別，后經回歸模型驗證發現：實驗測得的種子活力準確率達96.67%。之后該課題組重新將SVM模型結合LDA和Loadings分析法，發現可以更好地鑒別和區分經過不同處理和老化程度后的小麥種子。但種子的品種、產地和年份等相關因素的變化可能會使種子氣味發生變化，需要不斷重復的建模來適應這種因素的變化，導致了工作量的增加。另外，氣相色譜離子遷移譜技術兼具氣相色譜和離子遷移譜技術的特點，擁有高分離能力的氣相色譜以及高靈敏度的離子遷移譜，運用靜態頂空進樣法對種子揮發的痕量氣體進行準確、無損檢測，可為氣相色譜離子遷移譜技術分選種子活力提供更多技術保障。

1.2.2 電導法檢測技術 電導法是一種測定種子浸出液的電導率來判斷種子活力高低的檢測技術，其原理是利用種子在初期吸水膨脹時細胞膜會進行重建，完整重建細胞膜的速度越快，則外滲物就越少。種子損傷修復能力的快慢也影響電解質和內部可溶性物質滲出的程度。電導率越低，則種子的活力越高[40-41]。張文明等[42]以不同品種的大豆種子作為樣本，經過電導率實驗和模擬田間出苗率的驗證，證明了電導法可快速可靠地檢測種子活力。段永紅等[43]初步驗證了電導法可作為雜交水稻種子活力的重要手段之一，但是在實驗結果上無法做到與預期實驗結果吻合，推測與實驗樣本中有破損種子的引入有關。朱銀等[44]結合人工加速老化對小麥種子進行電導法檢測，驗證電導率與小麥種子活力、發芽率、發芽指數都呈負相關，可以作為小麥種子活力的重要參照指標。電導法可以成為種子活力檢測的重要手段，但易受到種子預處理、破損種子和水質等因素的影響。

1.2.3 H2O2流速檢測種子活力 非損傷微測技術是通過測定滴在種子表面的H2O2流速來判斷種子的活力。H2O2是植物自身攜帶的一種信號物質，它可以在植物細胞內或者細胞之間流動，并引發一系列分子、生理學和表型上的響應。對于未老化種子，由于抗氧化酶活力較高，種子的H2O2含量較低，所測得的H2O2流速負值多于正值。老化后則相反。因此活力強的種子H2O2外流作用弱；活力弱的種子內部的 H2O2含量上升，H2O2會出現外流現象[45-46]。

李俊周等[47]采用非損傷微測技術對單粒水稻種子表面進行H2O2流速測定，可精確預判種子活力值和種子發芽率。老化程度加重則種子抗氧化相關酶活力急劇下降。種子H2O2流速與發芽率、電導率、H2O2含量有顯著的線性相關。該方法還需進行種子活力測試的實際應用，以獲得檢測的準確率、適用區值、相關系數等實驗數據，為該方法的實際生產提供更多可能。

1.2.4 可調諧二極管激光器吸收光譜技術檢測法 種子的活力與種子的呼吸存在正相關性，種子呼吸過程中氧氣（O2）的消耗和產生的二氧化碳（CO2）情況可以有效地反映出種子的活力水平。可調諧二極管激光器吸收光譜技術（TDLAS）是近年來發展的一種痕量氣體質量濃度監測技術，具有高靈敏、高分辨率的特點，目前已經能夠達到9～10級甚至10～12級別的檢測限。研究表明：將種子置于密閉容器中可迅速測得CO2濃度變化，基于TDLAS方法測定種子活力的方法具有可行性。

1.3 基于外觀特征的種子質量檢測方法

基于外觀特征的種子質量檢測方法是借助機器視覺模擬人的視覺相關功能，將獲取的圖像信息進行數字化處理，然后建立檢測指標與種子活力之間的判別模型[48-51]，可區分種子活力強弱。

葉鳳林等[52]采用機器視覺技術中種子形態自動化識別軟件，可快速識別黃芩Scutellaria baicalensis種子的物理特性并探究與種子活力之間的相關性，測取黃芩種子的色相、寬度、長度和投影面積，識別準確率達78.5%。劉敏潔等[53]通過機器視覺技術識別不同品種甜玉米種子之間的活力差別，提取玉米種子的色彩要素值、飽和度和投影面積等參數值，進行種子活力相關分析，創建種子活力預測、篩選模型，并結合人工神經網絡和二元邏輯回歸數據分析方法，整體預測準確率最高達77.6%。李振等[54-55]用機器視覺技術對辣椒種子進行無損活力檢測，結果表明：利用過黃特征法、閾值處理和漫水填充算法可加快處理時間，提取的種子灰度值可反映種子活力信息，經種子活力指標檢測系統測定的準確度達92%。機器視覺技術對種子測量環境要求高，在農業復雜生產環境中適應能力不足。同時在種子特征不明顯的情況下，不僅需要提升算法精度，還需要克服高精度帶來的計算量大的問題。

2 結論與展望

從國內外研究現狀來看[56]，種子活力無損檢測的研究方法，一般均基于對種子某種與活力相關的特性進行測定，采用跨領域的方法去檢測種子活力的關聯關系，并建立與種子活力的檢測系統。種子活力無損檢測方法雖然擁有快速、無損、成本低、無污染、重復性好、測量方便等優點，但是在現研究階段還需要克服諸多困難。基于光學類特性的檢測方法中，近紅外光譜檢測技術在實驗中需要克服來自水份、溫度以及樣本差異等因素的干擾；高光譜檢測技術需要選取特征波長，去除圖像噪聲以及實現在線化應用；激光散斑技術不僅需要實現在線化應用，還需要克服樣本差異性；葉綠素熒光檢測技術需要解決樣本中葉綠素含量過高或過低導致種子活力分選結果不理想的難點。基于生理生化類特性的檢測方法中，電子鼻檢測技術除了需要解決檢測設備造價高昂的問題，還需要結合發展氣相色譜離子遷移譜技術的技術優勢；電導法檢測技術最先需要解決預處理過程中種子易破損和實驗環境難以穩定的難點；H2O2流速檢測技術需解決試劑用量、種子實驗區域和檢測技術保障等難題；TDLAS檢測技術尚處于實驗室階段，離農業實際檢測存在差距。基于外觀特性的機器視覺檢測技術需經過不斷實驗來確定拍攝區域，優化實驗過程中的算法以及提升實驗最終的檢測正確率。另外種子活力檢測的樣本數量和種類不足，大部分是對水稻、玉米、小麥以及大豆等主要農作種子的檢測[57-61]。經統計發現，上述所有檢測技術的樣本種類為16種種子，說明還有更多品種的種子需等待后續的測定和完善[62-64]。上述檢測方法對農業發展應用都具有很大的潛能和優勢，不僅提升了檢測效率和正確率，而且對農耕生產、育種以及存儲都具有重要的指導作用。