石墨烯基材料在毛細管電泳中的應用進展

徐 蕾，盧 靜，崔鳳娟，高立娣

(齊齊哈爾大學 化學與化學工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

石墨烯(Graphene)是由sp2雜化的碳原子以六邊形排布形成的蜂窩狀二維新型碳材料，是構筑碳的其它同素異形體的基本結構單元[1]，具有大的比表面積、優異的導電性、良好的穩定性和高的機械強度。但是，石墨烯極易團聚，較強的π-π電子共軛作用導致其疏水性較強，因此直接應用受到限制。氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)是高結晶性的石墨烯強力氧化后的產物，具有二維層狀結構，片層結構間存在羥基和環氧基團，邊緣也存在羧基，此結構使之具有親水性并提供了反應活性基團，擴展了應用范疇。還原氧化石墨烯(Reduced graphene oxide，GOOH)是廣義上的石墨烯材料,由于經歷了氧化和還原步驟，GOOH表面存在缺陷，利于修飾。石墨烯量子點(Graphene quantum dots,GQDs)，是石墨烯家族中冉冉升起的一顆新星。GQDs是指尺寸小于100 nm的石墨烯片層[2]，厚度為0.5～1.0 nm，它結合了石墨烯和量子點的優良性質，表面有含氧基團，具有良好的水溶性并易于功能化。上述石墨烯基碳材料，在光電、催化、傳感、清潔能源和生物醫藥等方面具有良好的應用前景[3-4]。

毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)是經典電泳與現代微柱分離技術完美結合的產物，具有高效、快速、微量、易于自動化等特點。石墨烯基材料具有大的比表面積，利于分離，當用作色譜或毛細管電色譜(Capillary electrochromatography,CEC)的固定相時，可提供與分析物附加的相互作用位點從而改善分離[5]。而且，在GO或GOOH表面可共價鍵合某些官能團進行改性，使之具有更高的選擇性和生物兼容性。在CE中，石墨烯基材料可以直接加入到背景電解質(BGE)中作為假固定相；也可以被吸附或鍵合到CEC柱的固定相上形成半永久或永久涂層。本文主要綜述了近年來(2013～2018年)石墨烯基材料在CE中的應用并進行了展望。

圖1 石墨烯基固定相在CEC中的選擇和保留機理Fig.1 A general scheme of selectivity and retention mechanisms of graphene-based stationary phases in CEC

圖2 3個多環芳烴(A)和3個芳香族化合物(B)在裸NH2-SiO2、GO@SiO2和G@SiO2填充柱上的電泳圖 [8]Fig.2 Electrochromatographic separations of three polycyclic aromatic hydrocarbons(A) and three aromatic compounds(B) on bare aminosilica,GO@SiO2 and G@SiO2 packed columns[8]inset is optical and SEM images of packed beds in capillaries using packing slurries containing GO@SiO2 microspheres

1 背景緩沖液的添加劑

2 CEC的固定相

CEC是一種結合了CE的高分離能力和高效液相色譜(HPLC)的高選擇性的微分離技術。根據固定相在毛細管內存在形式的不同，可劃分為填充柱-CEC、開管柱-CEC及整體柱-CEC。圖1為石墨烯基固定相材料在CEC中的選擇和保留機理。

2.1 填充柱-CEC

毛細管填充柱通過將色譜填料填充到毛細管內，采用電滲流(EOF)或EOF結合壓力流驅動流動相，進而實現樣品分離。石墨烯基材料用于填充柱-CEC的報道極少，主要是因為將納米厚度的石墨烯或GO填充到毛細管柱內比較困難，且團聚的石墨烯片沒有足夠的機械強度抵抗填充產生的高壓力；同時，石墨烯不規則的形貌會降低分離效率。Wang等[8]利用氨基功能化的SiO2納米粒子與GO間的縮合反應制備了SiO2微球功能化的GO復合材料(GO@SiO2)，并以水合肼為還原劑制得SiO2功能化的石墨烯復合材料(G@SiO2)，然后利用壓力勻漿填充法將SiO2、G@SiO2和GO@SiO23種單顆粒料填充到毛細管內制成填充柱，對3種弱極性多環芳烴及3種極性不同的芳香族化合物進行了分離(見圖2)。結果表明：G@SiO2和GO@SiO2同目標物間存在獨立或協同的π-π堆積及氫鍵相互作用。這種填充柱具有很好的重現性，并成功應用于淡水中芳族烴的分析。

2.2 開管柱-CEC

開管柱是指毛細管內壁涂覆或鍵合有固定相的空心柱。其制備簡單方便，但由于柱內修飾的固定相量有限導致樣品容量較小，因此會一定程度地影響分離效率。尋找新的固定相材料提高柱的表面積，增強固定相/流動相間相互作用以提高分離度是目前研究的主要方向。GO含有大量的含氧基團，因此容易被鍵合至氨基功能化的毛細管柱內。Qu等[9]首次利用化學鍵合法制備了石墨烯/GO修飾毛細管柱(G/GO@column)：以3-氨丙基二乙氧基甲基硅烷為偶聯劑，鍵合GO得到GO@column；并以水合肼為還原劑制得G@column。研究發現：G@column的EOF與pH值(pH 3.0～9.0)密切相關，而GO@column則表現出恒定的EOF；GO@column對中性多環芳烴表現出較好的分離性能，G@column則由于分析物與石墨烯間較強的親和力產生峰拖尾，分離效果較差。石墨烯的特異性保留對吸附更有利，而GO與蛋白質間較弱的相互作用更利于分離。GO在毛細管柱內的高覆蓋率可提高相比，采用化學鍵合法則可使柱子具備較高的穩定性。這種開管柱已成功用于雞蛋蛋白中6種蛋白質的分析，展現了石墨烯基材料在CEC分離中的巨大潛力。后續的有關研究，多采用硅烷偶聯劑對毛細管進行氨基功能化，進而將GO鍵合，基于傳統的反相分離模式即GO與目標物間的π-π堆積、疏水和氫鍵等相互作用實現分離[10-17]。Ji等[18]將GO鍵合至氫氧化銨衍生化的觸須式聚合物鏈(甲基丙烯酸酯縮水甘油酯，GMA)接枝毛細管上，制成開管柱。GMA的觸須式結構能延長GO與毛細管內壁的距離，因此可提高GO在柱內的容量和結合力，從而提高相比。這種開管柱在pH 4.0～9.0范圍內能形成強且穩定的EOF，用于分離中性小分子時，分離度超過2.30，柱效達到170 000塔板/米。

化學鍵合法制備的開管柱壽命長，但制備過程復雜耗時，而且在共價涂層中常用的硅烷偶聯劑毒性強，對濕度敏感。聚電解質的物理吸附被認為是一種快速產生穩定涂層的方法[19]。石墨烯基材料在水溶液中帶負電，因此可通過靜電相互作用將其自組裝到陽離子聚電解質表面，這種方法穩定性好，制備步驟簡單省時。Yang[20]、Wang[21]和Qu[22]等利用石墨烯、GO、GOOH和陽離子聚電解質聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDA)間的靜電引力，通過層層自組裝(LBL)制備了石墨烯/GO/GOOH-PDDA修飾毛細管柱，獲得了較好的重現性和穩定性。但靜電相互作用的穩定性不如化學鍵，而且涂層在CEC運行中會面臨流動相流動產生的持續壓力和電泳分離高壓，使柱的穩定性下降。Chen等[23]開發了一種共價鍵合和非共價鍵合聯用的LBL技術(圖3)，首先在毛細管內壁鍵合聚苯胺(PANI)；然后利用分子間聚合作用在PANI表面形成聚多巴胺(PDA)層；最后將GO組裝到PDA表面。其中，PANI在多巴胺(DA)的自偶聯過程中可促進電子轉移從而提高PDA的修飾效果，同時還能增大毛細管的內表面積；以PANI為涂層子層，分離度、理論塔板數、保留因子和對稱因子都得到顯著提升。該柱的分離性能優于GO鍵合的開管柱，而且能保持可控的EOF，穩定性高。Yu等[24]開發了一種共價鍵合的自組裝技術制備固定相，以光敏重氮樹脂(DR)替代硅烷偶聯劑，分別制備了DR/羧基功能化的C60(C60-COOH)和DR/GO涂層。由于DR獨特的光化學性質，其與C60-COOH或GO間的離子鍵經紫外燈處理后可轉變為共價鍵。同裸柱、非共價鍵合柱相比，共價鍵合柱分離性能最好。這種綠色、簡單的制柱方法為CEC固定相的制備提供了一種新思路。

圖3 GO-PDA-PANI@毛細管的制備示意圖[23]Fig.3 Schematic procedure of preparing GO-PDA-PANI@capillary[23]

表1對石墨烯基材料用于毛細管開管柱的制備研究進行了總結。研究表明將石墨烯基材料引入到毛細管開管柱的制備可有效提高CE的分離效率和選擇性。

表1 石墨烯基材料作為固定相在開管柱-CEC中的應用Table 1 Application of graphene-based materials as stationary phase of open-tubular CEC

2.3 整體柱-CEC

整體柱是在色譜柱內進行原位聚合的連續床固定相。相比常規裝填的色譜柱，具有更好的多孔性、滲透性及穩定性。有機聚合物整體柱的應用最廣泛，其大孔結構可實現生物大分子的快速分離；但由于缺少足量的相互作用位點和介孔，在分離小分子化合物時存在困難。提高柱的表面積是最有效的解決方式，如使用石墨烯基材料對聚合物整體柱進行改性。常用的兩種改性制備方法是：(1)一步室溫聚合法，在共聚合作用中將石墨烯材料引入整體柱中；(2)后期改性法，在聚合反應后將石墨烯材料修飾到孔表面。一步法在不影響分離效率的前提下可減少制備步驟，縮短制備時間。石墨烯基材料在毛細管整體柱制備中的應用見表2。

表2 石墨烯基材料在整體柱-CEC中的應用Table 2 Application of graphene-based materials in monolithic-column CEC

MAA:methacrylic acid;EDMA:ethylene glycol dimethacrylate;GMA:glycidyl methacrylate

圖4 待測中性化合物在poly MAA-EDMA整體柱(A)和poly GO-MAA-EDMA整體柱(B)上的電泳圖[25]Fig.4 Electrochromatograms for the separation of test neutral compounds on poly MAA-EDMA monolith(A) and poly GO-MAA-EDMA monolith(B) [25] peak identity:0.thiourea;1.benzene;2.toluene;3.ethylbenzene;4.isopropylbenzene;5.naphthalene;6.acenaphthene;7.fluorene;8.anthracene

Yan等[25]首次利用一步室溫聚合法制備了GO-聚(甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(Poly GO-MAA-EDMA)整體柱，與未修飾GO的整體柱相比，該柱對中性目標物的保留時間和保留因子顯著提高(圖4)，這主要是因為GO與固定相、分析物間較強的疏水和π-π靜電堆積相互作用，不僅能改善分離，還提高了整體柱的機械穩定性。之后，研究人員使用不同的單體，利用一步聚合法制備了GO改性的各種聚合物整體柱[26-31]，這些整體柱均表現出較好的穩定性，不僅可用于極性/非極性化合物的分析，還可用于微萃取技術對分析物進行富集。

盡管一步法制備簡便，但一旦更換功能單體，聚合物的組成和反應條件都需重新優化。為了避免復雜的優化步驟，使用后期改性法是一個不錯的選擇。Jia等[32]利用三步原位共聚法——首先基于柱內甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)和乙二醇二甲基丙烯酸(EDMA)的原位共聚合制得聚(GMA-EDMA)整體柱，然后基于氨基和羧基的縮合作用將乙二胺接枝到整體柱上，最后再鍵合GO，得到GO@poly(GMA-EDMA)整體柱。該整體柱可作為萃取材料與HPLC結合對前列腺癌細胞中的肌氨酸進行分析。

整體柱的分離能力與聚合物的孔結構密切相關，而制孔劑的種類和組成是影響孔結構的最直接因素。大部分整體柱的制備多使用N,N-二甲基甲酰胺、甲苯、醇等有機試劑為制孔劑，這類物質易揮發且有毒性。Huang等[33]以室溫離子液體(RTILs)1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽和深共熔溶劑(DESs)氯化膽堿-1,2-丙三醇為二元綠色制孔劑，制備了一種GO摻雜的整體柱。這種制孔劑充分結合了RTILs和DESs的優勢，功能化的GO在此溶劑中有較好的分散性，進而使整體柱表現出良好的滲透性和均勻性。以小分子烷基苯為目標物對該整體柱的分離性能進行評價，最大柱效可達147 000塔板/米。

3 CE-電化學/電化學發光檢測電極的修飾材料

電化學(EC)和電化學發光(ECL)法儀器簡單、價格低廉，是CE常用的檢測技術[34-35]。工作電極是這兩種方法中最重要的部分。使用化學修飾電極可以有效降低分析物的過電位，提高靈敏度和選擇性，因而成為CE-EC/ECL研究中的一個熱點。

圖5 5種糖在石墨烯-Co納米微球雜化糊電極(A)和石墨-Co雜化糊電極(B)上的電泳圖 [46]Fig.5 Electropherograms for a mixture containing mannitol(a),sucrose(b)，lactose(c),glucose(d) and fructose(e)(0.25 μmol/L each) at a graphene-CoMS hybrid paste electrode (A)and a graphite-Co hybrid paste electrode(B)[46]inset：microscopic photograph of a piece of graphene-CoMS hybrid paste electrode

復旦大學陳剛課題組在CE-EC中石墨烯基材料修飾電極的制備方面做了一系列卓有成效的工作。他們基于石墨烯和陰離子交換樹脂間的靜電相互作用和后續的化學還原法，制備了石墨烯包裹的陰離子交換樹脂球，將其嵌入聚丙烯移液管中制成石墨烯球電極，并用于CE-EC中對洗衣液中的殺菌防腐劑進行分離檢測[36]。并利用熔融石英毛細管微通道中石墨烯和聚合物的原位縮聚作用，制備了一系列石墨烯/聚合物復合電極，作為CE的安培檢測器[37-42]。這些電極制備簡單，電催化活性高，表面抗污染能力強，穩定性高。他們還制備了幾種石墨烯-金屬納米粒子雜化復合物糊電極[43-46]，用于食品中幾種糖的分析，5種糖在石墨烯-Co納米微球雜化糊電極[46](圖5A)上的電化學響應比石墨-Co雜化糊電極(圖5B)高得多。Chen等[47-48]在電極表面利用一步電化學還原GO制備了GOOH修飾的碳纖維微盤電極，并用于CE-EC對眼藥水、單HepG2細胞中的谷胱甘肽和人全血提取物中的色氨酸、尿酸和谷胱甘肽進行了分析。

石墨烯基材料也可用于制備芯片CE-EC的工作電極。Escarpa等[49]制備了雜化聚合物/石墨烯修飾的碳絲網印刷電極，用于芯片CE中對D-甲硫氨酸和D-亮氨酸進行了分離。Ferreira等[50]直接在商用芯片CE儀的鉑工作電極上電解還原GO，得到石墨烯修飾電極，該電極表現出較高的表面電導性和電化學響應，可分離檢測兩種陰離子混合物碘化物和抗壞血酸。表3總結了石墨烯基材料作為CE-EC檢測電極的修飾材料進行的相關應用。

表3 石墨烯基材料修飾電極在CE-EC檢測中的應用Table 3 Application of graphene-based materials modified electrode in CE-EC detection

(續表3)

ElectrodeModified nanomaterialElectrodic substrateDetection potentialElectrophoretic conditionsCapillary(Id,length)Running bufferSeparation voltage and injectionAnalyteRefGraphene/poly(ethyl 2-cyanoacrylate) composite electrode0.8 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,50 cm50 mmol/L borate buffer(pH 9.2)12 kV;12 kV,6 sResorcinol,rutin,hyperoside,chlo-rogenic acid,and quercetin[41]Graphene/poly(ethylene-co-vinyl acetate) composite electrode0.8 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,50 cm50 mmol/L borate buffer(pH 9.2)12 kV;12 kV,6 sRutin,quercitrin,kaempferol,and quercetin[42]Graphene-phenolic resin composite electrode0.8 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,40 cm50 mmol/L borate buffer(pH 9.2)15 kV;15 kV,6 sIsoferulic acid,ferulic acid and caffeic acid43Graphene-Cu NP composite paste electrodes0.65 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,40 cm75 mmol/L NaOH12 kV;12 kV,6 sMannitol,su-crose,lactose and glucose[44]Graphene-Ni NP composite microsphere electrodeand0.65 V(vs.SCE)25 μm,40 cm75 mmol/L NaOH12 kV;12 kV,6 sSucrose,glucose and fruc-tose[45]Graphene-cobalt microsphere hybrid paste electrodes0.65 V(vs.Ag/AgCl)25 μm,40 cm75 mmol/L NaOH12 kV;12 kV,6 sMannitol,su-crose,lactose,glucose and fruc-tose[46]Reduced graphene oxideCarbon fiber microdisk electrode0.8 V(vs.SCE)25 μm,37 cm25 mmol/L PBS(pH 7.4)16 kV;5 kV,10 sDopamine,epineph-rine,L-cysteine,glutathione,ascor-bic acid,uric acid[47]Reduced graphene oxideCarbon fiber microdisk electrode0.9 V(vs.SCE)25 μm,37 cm25 mmol/L PBS(pH 7.4)18 kV;5 kV,10 sTryptophan,glu-tathione and uric acid[48]

4 CE樣品前處理技術中的吸附劑

雖然CE具備許多優點，但在光學檢測中由于進樣量小導致檢測光程變短從而使靈敏度較低。為了解決這一問題，可采取一些離線預富集技術。石墨烯的比表面積大，含有豐富的π電子體系，可與芳環化合物及含π電子的化合物相互作用，而且吸附位點多。石墨烯基材料作為良好的吸附劑已成功用于固相萃取(SPE)[55]、磁性固相萃取(MSPE)[56]和固相微萃取(SPME)[57]，其中，與HPLC和氣相色譜聯用的報道較多，在CE中的報道還比較少。

SPE是目前應用最廣泛的一種樣品前處理技術，主要是基于分析物和柱填料間的親和力實現萃取。Ye等[58-59]以石墨烯為SPE的吸附劑材料，分別對美容產品中的4種對羥基苯甲酸酯類防腐劑和肉中4種磺胺殘留進行了萃取，然后利用CE-二極管陣列法進行了分離檢測。實驗考察了洗脫劑種類、體積、樣品pH值、上樣流速等影響因素，獲得了滿意的回收率。GO含有大量的親水基團，對這些基團進行選擇性修飾可以實現對不同分析物的選擇性吸附。Jia等[60]以3-氨基苯硼酸功能化的GO為SPE的新型吸附劑，對4種核苷進行了選擇性富集，然后結合CE建立了中藥制劑中核苷的分析方法，該方法簡單、靈敏、重現性好。

MSPE是依托磁性或可被磁化的材質充當吸附劑的一類分散SPE技術。與 SPE 填料相比，磁性顆粒的體積小，相對面積大，分散快，具有非常高的萃取能力和萃取效率；同時借助磁性完成分離，操作簡單方便。王衛平等[61]以水熱法合成的磁性石墨烯吸附劑對三嗪類除草劑有較好的特異性吸附效果，主要是因為分析物的三嗪環同GO含有的苯環可形成強π-π共軛作用，其氨基還能與GO中的羥基、羧基等形成較強的氫鍵，從而進一步提高吸附性能。該萃取方法與CE結合可對環境水樣中的三嗪類農藥和牛奶中的磺胺[62]進行分析。董樹清等[63]通過一步化學共沉淀法制備了GQDs包裹的Fe3O4磁性納米復合材料，對肉桂酸及其衍生物進行了萃取。Hamidi等[64]則分別以一步聚合法和共沉淀法合成了GO/PDA、磁性石墨烯/Fe3O4復合材料，并以之作為分散SPME的吸附劑，結合CE建立了人血漿中維拉帕米的測定方法。這種萃取技術僅需500 μL丙酮洗脫劑，大大減少了有毒、非水溶性試劑的使用，對維拉帕米檢測的線性范圍為5～500 ng/mL。Fakhari等[65]首次將基于GO的SPE-電膜萃取聯用技術與CE結合分析了多種氯苯氧基酸除草劑，在最佳條件下富集因子可達1 950～2 000，檢出限低至ng/L數量級，這種雙萃取技術操作簡單、價格低廉、富集效率高，樣品清潔環保。

5 結論與展望

本文總結了石墨烯基材料近年來在CE樣品前處理、分離、檢測方面的研究進展。各種新型功能化石墨烯基材料的不斷出現使其在色譜領域得到持續進步和發展，但是應用于CE中仍然存在一些問題：如石墨烯基材料用于制備CEC固定相時，研究多集中在對標準品的分析上，缺少對真實樣品的分析；石墨烯懸浮液的穩定性直接影響粒子大小、表面電荷密度和分散介質的離子強度從而影響分離效果；GQDs在CE中的應用研究很少；此外，缺少對石墨烯基材料在樣品前處理及CE分離中相關機理的深入研究。

為了使CE具備更高的分離效率、選擇性、樣品富集性能和更合適有效的檢測體系，未來石墨烯基材料在CE中的研究將集中在以下幾個方面：(1)設計和合成功能化的石墨烯基材料，使其具備選擇性更高的相互作用位點、更快的電子轉移速度和更大的樣品負載量；(2)合成具有更多應用特性的新型功能化石墨烯納米復合材料；(3)對石墨烯基材料在CE分離機理方面開展更深入的研究；(4)拓寬石墨烯基材料在芯片CE領域中的應用。我們也期待石墨烯及其功能化復合材料在CE領域發揮更重要的作用。