傅立葉變換離子回旋共振質譜法測定生物樣品中的溶血磷脂酰膽堿

何凱麗,楊運云,徐 舸,向章敏*

(1.沈陽工業大學 理學院 化工系，遼寧 沈陽 110870；2.廣東省測試分析研究所 廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室，廣東省原位電離質譜分析工程技術研究中心，廣東 廣州 510070)

溶血磷脂酰膽堿(LPCs)又稱溶血卵磷脂,是一類脂質化合物。LPCs廣泛存在于各種生物體內，是一類具有多種生理功能的生物活性信號分子，與動脈粥樣硬化[1-2]、糖尿病[3]、心血管疾病[4]及癌癥[5-7]等疾病密切相關。眾多研究表明，生物體內LPCs的含量水平可作為疾病的潛在生物標志物[8-9]，在臨床病理研究、疾病診斷及預防等方面發揮著重要作用。

生物樣本中LPCs 的快速、準確測定是臨床分析的一項重要任務。目前，LPCs的分析方法包括薄層色譜法(TLC)[10]、高效液相色譜法(HPLC)[11]、高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)[12-14]、高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[15-16]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[17]等。然而，這些技術均存在一定不足，如TLC在LPCs的檢測中專屬性較差，難以實現廣泛應用。HPLC對復雜樣品具有良好的分離能力，但檢測靈敏度低，在目標物濃度較低時，基質干擾嚴重、選擇性差、分析時間長，不適用于復雜生物樣品中LPCs的痕量檢測。GC-MS適用于揮發性和半揮發性物質的分析，LPCs的檢測需要預先對樣品進行酯化反應，樣品前處理過程復雜，難以實現批量樣品檢測。因此，建立一種快速的LPCs分析檢測方法十分必要。

傅立葉變換離子回旋共振質譜(FTICR-MS)[18-22]技術具有靈敏度高、分辨率高、準確性好、分析速度快等特點，在化合物的精準檢測方面有很大優勢。利用FTICR-MS檢測LPCs，可極大地縮短分析時間。此外，FTICR-MS具有超高的分辨率以及精確的質量準度，有利于待測物精確分子量的準確測定。本文建立了一種快速測定生物樣品中4種LPCs(LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0)的FTICR-MS分析方法，該方法簡便、快速、靈敏、準確，可滿足生物樣品中LPCs的檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

傅立葉變換離子回旋共振質譜儀(FTICR-MS SolariX XR7.0 T，德國Bruker公司)，BSA224S型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；注射器(宣城市江南醫療器械有限公司)；JP-060S型超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；TG16-W離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；數據處理軟件(德國Bruker 公司，DataAnalysis 4.4)。LPCs標準品(LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0,美國Avanti Polar Lipids公司)；二氯甲烷、氯仿(分析純，廣州化學試劑廠)；LPCs標準品(25 mg);甲醇(色譜純，美國Honeywell公司)。

樣品：血漿與大鼠肝臟樣品(8周齡雄性SD大鼠，體重180～220 g，ID：SYXK 2014-0137)于-80 ℃下保存，分析前于室溫下解凍。

1.2 標準溶液的配制

分別稱取LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0標準品各0.01 g(精確至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質量濃度為1 000 mg/L的混合標準儲備溶液。準確移取適量混合標準儲備溶液于容量瓶中，用甲醇逐級稀釋成質量濃度為0.5、1、10、50、100 μg/L的混合標準工作溶液，待測。

1.3 樣品前處理

1.3.1 人體血漿樣品移取0.85 mL(精確至0.001 mL)樣品于2 mL Eppendorf(EP)管中，加入1 mL甲醇-氯仿(9∶1，體積比)，渦旋萃取5 min，超聲30 min,以12 000 r/min離心15 min,靜置至室溫，取上清液經0.22 μm濾膜過濾后，濾液待測。

1.3.2 大鼠肝臟組織樣品將大鼠肝臟組織勻漿后，稱取0.10 g(精確至0.000 1 g)樣品于2 mL EP管中，加入1 mL甲醇-氯仿(9∶1，體積比)，渦旋萃取5 min，超聲30 min，以12 000 r/min離心15 min，靜置至室溫，取上清液經0.22 μm濾膜過濾后，濾液待測。

1.4 質譜條件

采用FTICR-MS分析提取液中的LPCs。進樣前，采用三氟乙酸鈉進行質量準確度校正；采用250 μL微量進樣器進樣，流速為120 μL/h；ESI離子源；正離子模式檢測；質量掃描范圍m/z50～1 000；噴霧氣壓力(Nebulizer pressure):40 kPa；噴霧電壓(Spray capillary voltage)：4.5 kV,毛細管出口電壓：-500 V；射頻電壓：350 Vpp；霧化器(Nebulizer)：4×104Pa；干燥氣體(Dry gas)為氦氣，流速為4.0 L/min；干燥氣溫度(Drying gas temperature)：200 ℃；采集大?。? M；累加次數：64 Scans；采集時間(Acquisition time)：0.200 s。每個樣品注入ESI源前，需提前對離子源進行清理，直至背景信號強度小于105的響應，以確保樣品的信號強度大于背景信號的3倍信噪比(S/N)。數據采集與分析均采用儀器配有的專用軟件進行處理。

圖1 不同提取溶劑對LPCs提取效率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction efficiencies of four LPCs

2 結果與討論

2.1 樣品提取條件的優化

由于生物樣品成分復雜，待測化合物性質各異，本文分別考察了3種不同有機溶劑：甲醇、甲醇-二氯甲烷(9∶1，體積比)、甲醇-氯仿(9∶1，體積比)對樣品的提取效果。以血漿樣品為例，由圖1可知，甲醇對4種LPCs的提取效率最低，甲醇-氯仿(9∶1)的提取效率最高，LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的響應值均明顯增大，且雜質干擾較小。為保證4種LPCs在生物樣品中得到更好的提取，本文選擇甲醇-氯仿(9∶1)為最佳提取溶劑。

圖2 溶血磷脂酰膽堿(LPCs)的分子結構通式Fig.2 General formula of molecular structure of lysophosphatidylcholine(LPCs)

2.2 質譜條件的優化

2.2.1 檢測模式的選擇LPCs是一種帶有正電荷的極性脂質，分子結構通式見圖2。為確定質譜檢測條件，本文首先對LPCs在質譜中的檢測模式進行優化。選取50 μg/L LPCs混合標準溶液分別在電噴霧離子源的正離子和負離子模式下進行檢測。結果顯示，4種LPCs在正離子模式下的響應均高于在負離子模式下的響應，為保證檢測靈敏度，本文選擇在正離子模式下對LPCs進行檢測。

2.2.2 定量離子的選擇為進一步確定4種LPCs的定量離子，保證分析結果的準確性，本文分別在碰撞誘導解離電壓為30 V的條件下對4種LPCs在混合標準溶液和血漿提取液中進行MS/MS分析，結果如圖3所示。由該圖可知，4種50 μg/L LPCs混合標準溶液(圖3A)的主要二級質譜碎片為[M+Na-59]+,其主要是由于LPCs為一類含有N原子的化合物，其N原子上存在的孤電子對容易加合鈉離子，因此得到待測物的基峰離子均為[M+Na]+。進行MS/MS分析時，在碰撞能量的誘導下脫去三甲基丙胺基(59 Da),從而得到了二級碎片離子[M+Na-59]+。此外，血漿提取液的MS/MS質譜圖(圖3B)中4種LPCs均能得到相應的二級碎片離子[M+Na-59]+，進一步證實了4種LPCs的定量離子為[M+Na]+。

2.2.3 質譜采集參數的優化在正離子檢測模式下，對采集兆數(Size)、采集時間(Accumulative time)和采集次數(Scans)進行優化，以化合物的[M+Na]+峰為定量離子，優化后的定量離子、采集兆數、采集時間等質譜參數見表1。

表1 待測物質的質譜參數Table 1 MS parameters of tested components

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限在優化條件下，采用FTICR-MS法對“1.2”配制的混合溶液進行測定，以LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，對應定量離子的質譜豐度(y)為縱坐標進行線性回歸，結果見表2，由表2可知,LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0在0.5～100 μg/L質量濃度范圍內均呈良好的線性關系，相關系數(r2)為0.993 0～0.998 3。采用基質樣品加標方法，通過計算其樣品加標的響應與背景噪音的比值分別確定檢出限(LOD,S/N=3)和定量下限((LOQ,S/N=10)，得到4種LPCs的LOD為0.02～0.03 μg/L，LOQ為0.07～0.1 μg/L，日內精密度(Intra-RSD,n=6)為3.3%～4.3%，日間精密度(Inter-RSD,n=3d)為5.5%～9.3%，方法的靈敏度和準確性可滿足復雜生物樣品的檢測要求。

表2 4種LPCs的線性方程、線性范圍、相關系數(r2)、檢出限、定量下限及相對標準偏差Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r2 ),LODs,LOQs and RSDs of four LPCs

2.3.2 專屬性將本方法用于20 μg/L LPCs混合標準溶液和血漿中4種LPCs的分析(見圖4)。從圖中可以看出，采用本方法進行測定時，無論是在低濃度標準溶液，還是在血漿樣品提取液中，4種LPCs均有較好的響應。

2.3.3 回收率結果為驗證該方法對不同生物樣品的適用性，選取兩種不同的生物樣品(人類血漿、大鼠肝臟)分別加入3個不同濃度的LPCs混合標準溶液進行加標回收實驗，所有實驗均平行測定6次。由表3可知，4種LPCs在3個加標水平下的平均回收率為70.8%～95.0%，相對標準偏差(RSD)為1.2%～9.8%。以上結果表明該方法具有較高的準確度，且精密度和重現性良好。

表3 生物樣品中4種LPCs混合標準溶液的回收率與相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of four LPCs mixed standards from biological samples(n=6)

2.4 實際樣品的分析

采用本文建立的方法對5只健康大鼠(HR,藍色片段)以及5只通過高脂飲食造模所得的患有脂肪肝的大鼠(FLR,棕色片段)對照組進行LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0檢測。該方法中5組健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內4種LPCs的檢測結果如表4所示。

表4 健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內4種LPCs的質譜豐度Table 4 MS spectra abundance of four LPCs in the livers of healthy rats(HR) and fatty liver rats(FLR) (×107)

由表4可知，健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內對應的4種LPCs中，均以LPC16∶0的豐度最高，其余依次為LPC18∶0>LPC13∶0>LPC15∶0。相對于健康大鼠(HR)，脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內LPC16∶0的豐度無明顯變化，但LPC13∶0、LPC15∶0和LPC18∶0的豐度降低較為明顯，其中LPC13∶0的豐度減低近50%。為使結果更加清晰，采用熱圖對5組大鼠肝臟內4種LPCs含量進行進一步的對比分析，比較結果如圖5所示。

圖5 健康大鼠(HR)與脂肪肝大鼠(FLR)肝臟內4種LPCs含量的熱圖Fig.5 Heatmap of four LPCs contents in the livers of healthy rats(HR) and fatty liver rats(FLR)

由圖5可知，熱圖在實際樣品的分析中，能適用于多組別樣品和目標物的綜合分析，具有可視化比較4種LPCs相對濃度的優勢，柱狀圖和行狀圖分別代表不同組別的大鼠和LPCs的相對含量。不同顏色顯示出每只大鼠肝臟中不同水平的LPCs，從紅色到綠色，LPCs含量逐漸升高。同時可觀察到，相比于健康大鼠，患有脂肪肝的大鼠肝臟中的LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0含量均有降低，且LPC13∶0、LPC15∶0的含量最少。

3 結 論

本研究建立了FTICR-MS檢測生物樣品中4種LPCs的分析方法。樣品采用甲醇-氯仿(9∶1,體積比)進行超聲提取,通過利用高分辨率FTICR-MS，實現了4種LPCs的高靈敏、高準確檢測，并成功應用于實際樣品。該方法操作簡單，質譜檢測結果更為靈敏、準確，回收率高，精密度好，可滿足生物樣品中LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的檢測要求。