雜糧早餐粉對砷致小鼠雄性生殖毒性的緩解作用

高俊宇，儀慧蘭

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

砷是自然界廣泛存在的類金屬元素。自然或人為因素造成的土壤和水體中砷含量過高已嚴(yán)重威脅人類健康[1]。砷可通過呼吸道、皮膚、消化道等途徑進入人體，飲用水?dāng)z入是砷進入人體最主要的途徑[2]。據(jù)統(tǒng)計全球約2億人的飲用水中砷含量高于世界衛(wèi)生組織規(guī)定的最高限值10 μg/L[3]。我國山西、新疆、云南等十幾個省份存在飲用水砷超標(biāo)問題。長期飲用含砷水不僅會損傷人體神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等，還能引發(fā)皮膚癌、肺癌、膀胱癌和肝癌等[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，飲用水砷超標(biāo)可致男性生育能力低下，使精子數(shù)量減少、活力減弱、畸形率增加[5]。目前還沒有有效的措施解決高砷飲水地區(qū)男性生育力下降的問題。

動物實驗表明，砷是生殖毒物之一，會引起一系列生殖毒性。長期飲用含砷水會導(dǎo)致睪丸類固醇生成抑制，睪丸和附屬器官質(zhì)量減輕，精子數(shù)量減少、活性降低，血清促性腺激素和睪酮水平改變[6-8]。現(xiàn)有研究認(rèn)為，砷的生殖毒性可能與其引發(fā)的氧化脅迫有關(guān)，補充抗氧化劑VC能減輕砷攝入對小鼠雄性生殖能力的影響[9]。

鑒于此，本課題組前期基于抗氧化能力提升和營養(yǎng)成分均衡的原則研制了一款雜糧早餐粉[10]，本實驗通過毒理學(xué)實驗程序研究雜糧早餐粉對飲水?dāng)z入砷帶來的雄性生殖毒性的緩解作用，以期為高砷地區(qū)居民提供方便食材，通過日常飲食緩解砷毒性，達到保護機體健康的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康昆明種純系雄性小白鼠40 只，體質(zhì)量（23±2）g（生產(chǎn)許可證號：SCXK 2017-0001；使用許可證號：SYXK 2017-0003），由山西省腫瘤醫(yī)院提供；小鼠飼喂專用全價大顆粒飼料由山西醫(yī)科大學(xué)提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、H2O2、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒 南京建成科技有限公司；乙醇、甲醇、甲醛、二甲苯（分析純） 無錫市晶科化工有限公司；伊紅（分析純） 上海西隴化工有限公司；蘇木精（分析純） 北京亞米生物科技有限公司；亞砷酸鈉 美國Sigma公司；氯化鈉（分析純）山東德彥化工有限公司；考馬斯亮藍 沈陽樂衡科技有限公司；戊巴比妥鈉（純度99%） 北京華業(yè)寰宇化工有限公司；石蠟 海門市峰益實驗器材廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SynergyH1多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek Instruments公司；BX41熒光生物顯微鏡 日本Olympus公司；HC-2518R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；800Y高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；G70F20CN1L-DG（B0）家用微波爐 廣東格蘭仕集團。

1.3 方法

1.3.1 早餐粉溶液的配制

課題組前期研制的早餐粉配方如下[10]：小米27.76%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、白砂糖24.44%、黃豆20.00%、核桃仁19.70%、葡萄皮5.00%、黃原膠3.00%。其中，葡萄果皮粉過120 目篩，其他成分過80 目篩。

早餐粉溶液的配制：取1 g早餐粉加入水溫90 ℃以上的蒸餾水7 mL沖調(diào)，配制質(zhì)量濃度為14.30 g/100 mL的早餐粉溶液；取1 g早餐粉加水溫90 ℃以上的蒸餾水14 mL沖調(diào)，配制質(zhì)量濃度為7.15 g/100 mL的早餐粉溶液。

1.3.2 實驗動物分組

將小鼠按體質(zhì)量隨機分為4 組，每組10 只。設(shè)正常對照組：小鼠飲用蒸餾水；砷染毒組：小鼠飲用含砷蒸餾水（用NaAsO2配制，砷質(zhì)量濃度為10 mg/L）；早餐粉干預(yù)組：小鼠在飲用含砷水的同時灌胃7.15 g/100 mL（低劑量組）或14.30 g/100 mL早餐粉溶液（高劑量組）。灌胃起始劑量為每次每只0.4 mL，小鼠體質(zhì)量每增加2 g，灌胃體積增加0.03 mL，每3 d灌胃一次。實驗周期60 d。所有實驗小鼠均飼喂專用全價大顆粒飼料，每只小鼠5 g/d。各組小鼠均自由取水，每2 d對小鼠的飲水量進行監(jiān)測記錄，將該籠小鼠的飲水量除以小鼠數(shù)量，即為該籠每只小鼠的日均飲水量。實驗期間平均飲水量為日均飲水量的平均值。每周稱體質(zhì)量1 次。染毒結(jié)束前12 h禁食。

1.3.3 實驗動物解剖與取材

將小鼠麻醉、稱質(zhì)量、解剖，取雙側(cè)附睪用于制備精子懸液，取雙側(cè)睪丸用預(yù)冷的生理鹽水浸洗，濾紙吸干表面浮水，稱質(zhì)量，將左側(cè)睪丸浸泡于體積分?jǐn)?shù)4%的中性甲醛溶液中固定，右側(cè)睪丸冷凍于-80 ℃冰箱中備用。睪丸臟器系數(shù)按下式計算。

1.3.4 睪丸組織氧化脅迫指標(biāo)測定

取凍存的睪丸組織，加生理鹽水制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的組織勻漿液。按照試劑盒操作說明，檢測SOD活力和GSH、H2O2、MDA含量。用考馬斯亮藍比色法[11]測定蛋白含量。

1.3.5 精子數(shù)量和形態(tài)的觀察

將附睪用生理鹽水洗凈，置于小平皿中，加入500 μL生理鹽水浸沒，用眼科剪縱向剪1～2 次，于37 ℃水浴5 min，皿中液體經(jīng)擦鏡紙過濾得到精子懸液[12]，用血球計數(shù)板對精子數(shù)量計數(shù)。

取精子懸液，推片、干燥、甲醇固定，用體積分?jǐn)?shù)1%～2%伊紅染色，顯微鏡觀察。精子畸形計數(shù)以7 種畸變類型為基準(zhǔn)，包括無鉤、香蕉頭、胖頭、不定型頭、雙頭、尾折疊和雙尾。選擇背景清晰，精子結(jié)構(gòu)無損壞、無重疊的制片區(qū)域，統(tǒng)計該精子制片畸形精子數(shù)和精子總數(shù)，每只小鼠觀察精子共計約1 000 個，計算精子畸形率[12]。

1.3.6 睪丸組織切片與觀察

取甲醛固定的睪丸組織，制備石蠟切片。組織經(jīng)自來水浸洗，乙醇脫水，二甲苯透明處理，浸蠟（石蠟熔點58～60 ℃），包埋，切片（厚度3～4 μm）、展片、貼片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

各組實驗所得結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗小鼠的一般情況

整個實驗期間，所有小鼠毛發(fā)順暢，行走、飲食正常，未出現(xiàn)死亡。根據(jù)實驗期間對飲水量的監(jiān)測，砷染毒組小鼠飲水量平均值為5.57 mL/d，由飲水量計算小鼠砷攝入量均值為1.731 6 mg/（d·kg mb），砷染毒組和早餐粉干預(yù)組小鼠飲水量無顯著差異（P＞0.05），因此兩組小鼠砷攝入量也無顯著差異（P＞0.05）。實驗結(jié)束時各組小鼠的體質(zhì)量均無顯著差異。

2.2 砷對小鼠睪丸臟器系數(shù)和精子總數(shù)的影響及雜糧早餐粉干預(yù)效應(yīng)

圖1 小鼠睪丸臟器系數(shù)Fig. 1 Mouse testicular coefficient

由圖1可知，與正常對照組相比，砷染毒組小鼠睪丸臟器系數(shù)顯著降低，14.30 g/100 mL早餐粉干預(yù)組小鼠的睪丸臟器系數(shù)較砷染毒組顯著升高（P＜0.05）。

圖2 小鼠的精子總數(shù)Fig. 2 Total sperm count of mice

由圖2可知，砷染毒組小鼠的精子總數(shù)顯著低于正常對照組（P＜0.05），7.15 g/100 mL的早餐粉溶液干預(yù)后小鼠的精子總數(shù)略高于砷染毒組，14.30 g/100 mL的早餐粉溶液干預(yù)后小鼠的精子總數(shù)顯著高于砷染毒組（P＜0.05），且接近正常對照組。

2.3 砷對小鼠睪丸組織的氧化損傷及雜糧早餐粉的干預(yù)效應(yīng)

圖3 小鼠睪丸組織的氧化脅迫指標(biāo)Fig. 3 Oxidative stress indexes of testicular tissue in mice

由圖3可知，與正常對照組相比，砷染毒組小鼠睪丸組織SOD活力和GSH含量顯著降低（P＜0.05），H2O2和MDA含量顯著升高（P＜0.05），采用雜糧早餐粉干預(yù)后，睪丸組織中SOD活力和GSH含量較砷染毒組提高，其中14.30 g/100 mL早餐粉干預(yù)組顯著高于砷染毒組（P＜0.05）。兩個早餐粉干預(yù)組中H2O2和MDA含量均顯著低于砷染毒組（P＜0.05），睪丸組織氧化損傷程度明顯降低。

2.4 砷對小鼠精子的致畸作用及雜糧早餐粉干預(yù)效應(yīng)

圖4 小鼠精子畸形率Fig. 4 Sperm deformity percentage in mice

由圖4可知，砷染毒組的精子畸形率顯著高于正常對照組，7 種精子畸形類型所占比例依次為：尾折疊＞不定型頭＞香蕉頭＞胖頭＞無鉤＞雙尾、雙頭，其中雙尾和雙頭所占比例很少。與正常對照組相比，砷染毒組中不同類型精子畸形率的增幅分別為：尾折疊2.64%、不定型頭0.78%、香蕉頭0.58%、胖頭0.48%和無鉤0.16%。早餐粉干預(yù)組的精子畸形率顯著低于砷染毒組，其中，14.30 g/100 mL早餐粉溶液干預(yù)后精子畸形率降低至接近正常對照組，效果好于7.15 g/100 mL早餐粉干預(yù)組。

2.5 砷對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的損傷及雜糧早餐粉干預(yù)效應(yīng)

圖5 小鼠睪丸組織切片（×200）Fig. 5 Testicular tissue sections of mice (× 200)

由圖5可知，光學(xué)顯微鏡下，正常對照組小鼠睪丸生精小管排列規(guī)則，基膜結(jié)構(gòu)完整，管腔內(nèi)有大量精子，生精細胞排列緊密且層次分明，各發(fā)育階段精細胞均有，生精細胞大約有5～6 層。砷染毒組生精小管間有間隙產(chǎn)生，基膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)破損，生精細胞排列疏松且不規(guī)則，生精小管管腔內(nèi)成熟精子較少。采用早餐粉干預(yù)后，生精細胞排列的緊密度和規(guī)則性提高，生精小管基膜結(jié)構(gòu)較完整，管腔內(nèi)的精子較砷染毒組明顯增多。兩個早餐粉干預(yù)組相比，14.30 g/100 mL早餐粉干預(yù)組的睪丸結(jié)構(gòu)更接近于正常對照組。

3 討 論

現(xiàn)有研究表明，氧化損傷是砷毒性作用的主要機制[13-15]，本研究采用含砷質(zhì)量濃度為10 mg/L的蒸餾水飼喂小鼠，60 d后小鼠精子數(shù)量下降、結(jié)構(gòu)異常，睪丸組織出現(xiàn)氧化應(yīng)激和結(jié)構(gòu)損傷，說明本實驗所用昆明種小鼠對砷致雄性生殖毒性的反應(yīng)與大鼠和雄兔[16]等實驗動物一致，建立的毒理模型具有較好的代表性。而雜糧早餐粉干預(yù)不僅能改善砷攝入引發(fā)的睪丸組織氧化脅迫，對砷致睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷也有明顯的緩解效應(yīng)，可能與雜糧早餐粉增加機體抗氧化活性繼而降低砷誘發(fā)的氧化損傷有關(guān)。

臟器系數(shù)是動物實驗中重要的檢測指標(biāo)，臟器系數(shù)降低說明該組織器官萎縮[17]。本研究中通過飲水?dāng)z入10 mg/L砷，導(dǎo)致小鼠睪丸質(zhì)量的下降，在用14.30 g/100 mL早餐粉溶液干預(yù)后小鼠睪丸臟器系數(shù)得到顯著提升（P＜0.05），表明攝入一定量的早餐粉可緩解砷致小鼠雄性生殖器官的毒性作用。

精子數(shù)量和質(zhì)量是判斷砷致雄性生殖毒性的重要指標(biāo)，進入機體的砷會抑制雄性生殖細胞的發(fā)生和發(fā)育，使精子總數(shù)減少[8,18]，畸形率升高。本研究中砷染毒組精子總數(shù)降低，精子畸形率增加，表明本實驗條件下攝入的砷劑量已對小鼠精子的生成產(chǎn)生毒性或抑制作用，使精子總數(shù)降低、形態(tài)異常。采用雜糧早餐粉干預(yù)后小鼠精子總數(shù)升高，可能是雜糧早餐粉中含有的生物活性物質(zhì)，如植物抗氧化成分、功能小分子物質(zhì)等，可有效地提高小鼠機體抗氧化能力，緩解砷攝入引發(fā)的小鼠生精過程異常。

生物體內(nèi)存在抗氧化防御系統(tǒng)，維持生物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡。本研究中砷染毒組SOD活力和GSH含量降低，H2O2和MDA含量提高，這與前人在動物實驗中取得的結(jié)果[14-15]一致，說明飲用水?dāng)z入砷引發(fā)了小鼠睪丸組織細胞的氧化還原失衡。SOD是機體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，攝入砷使睪丸SOD活力降低，可能是砷對巰基的高親和力導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，競爭性抑制Cu2+和Zn2+等微量元素的吸收，致使含巰基的抗氧化酶失活[18]。GSH是抗氧化系統(tǒng)的第二道防線，可通過自身氧化還原循環(huán)降低胞內(nèi)自由基水平，GSH也是谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferases，GST）的底物，砷染毒組還原型GSH消耗量增加[19]，導(dǎo)致還原型GSH含量減少、機體還原能力降低，通過影響GPx和GST活力引發(fā)機體抗氧化能力下降。砷染毒組H2O2含量提高表明睪丸組織中存在較高水平的自由基，胞內(nèi)高水平自由基能損傷生物大分子，使抗氧化分子減少、抗氧化酶活力降低，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA濃度提高。采用雜糧早餐粉干預(yù)后SOD活力和還原型GSH含量升高，H2O2和MDA含量降低，可能是雜糧早餐粉中含有的大豆異黃酮、花色苷和VC等活性物質(zhì)增加了睪丸組織中酶和非酶抗氧化劑的水平，阻止了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[20]。

本課題組研制的雜糧早餐粉，其主要成分包括小米、大豆、核桃和葡萄皮，小米中含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素、氨基酸和多酚類物質(zhì)[21]；大豆含有豐富的全蛋白、不飽和脂肪酸、花色苷等黃酮類物質(zhì)[22]；核桃中含有豐富的可溶性蛋白、VE、VC、氨基酸、多酚類物質(zhì)和核桃油，核桃油中含不飽和脂肪酸、棕櫚酸、槲皮素和鞣花酸等[23]；葡萄皮中含有大量的植物天然活性成分，如白藜蘆醇、VC、原花青素和花青素等[24-25]。大豆中的全蛋白易于被人體消化吸收，不僅能為人體活動提供能量，還能提供必需氨基酸，全蛋白中的酪蛋白能夠緩解砷引起的氧化應(yīng)激，抑制活性氧生成，提高機體抗氧化酶活力[26]。早餐粉中含有的VC是氧化還原反應(yīng)中的單電子供體，可直接中和活性氧，保護SOD和過氧化氫酶的活力，降低砷對機體的氧化應(yīng)激作用[9]；原花青素、花青素、白藜蘆醇、槲皮素、鞣花酸和花色苷等黃酮類和酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化、抗炎癥和清除自由基功效，具有減緩砷氧化應(yīng)激的作用[27-30]；不飽和脂肪酸α-亞麻酸可上調(diào)SOD蛋白和基因的表達水平，從而提高其活力和含量[14]，提高睪丸組織的抗氧化能力。

上述結(jié)果表明，通過飲水?dāng)z入砷能誘發(fā)睪丸組織氧化脅迫，機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能會導(dǎo)致雄性生殖毒性，包括睪丸組織氧化還原系統(tǒng)失衡、精子質(zhì)量和數(shù)量異常、睪丸組織結(jié)構(gòu)破壞。雜糧早餐粉能顯著增強小鼠睪丸組織的抗氧化能力，緩解砷攝入對睪丸組織的氧化脅迫，提高精子數(shù)量和質(zhì)量，并對睪丸組織結(jié)構(gòu)有一定保護作用。