乙酰丙酸對沙門氏菌誘導性耐酸響應

田牧雨，張一敏，董鵬程，毛衍偉，梁榮蓉，朱立賢,，羅 欣,2

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

沙門氏菌（Salmonella）是與食品安全相關的最主要的食源性致病菌之一，能引起一系列人類疾病，包括急性高燒發熱和胃腸炎等[1]。根據歐洲食品安全管理局的統計，歐盟每年就有10萬多人被感染[2]。沙門氏菌可在各種惡劣的環境條件下生長，因此在食品安全方面存在一定的隱患。在肉類加工企業中，為了減少細菌（如大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特菌）的污染，屠宰后的胴體在入庫預冷前采用有機酸噴淋的方式進行減菌處理[3]，或者以鹽的形式添加到加工肉制品中以抑制細菌生長[4]。最常用的有機酸是檸檬酸、蘋果酸、乳酸和醋酸等。此外，有研究表明，乙酰丙酸也具有相類似的抑菌效果[5]。美國食品藥品監督管理局認證乙酰丙酸是一種可以直接添加到食品中的一般認為安全類物質[6]。

然而，弱酸環境可以提高沙門氏菌在其他環境壓力下存活率并影響其毒性[7]。沙門氏菌具有復雜的調控機制以保護其應對諸多生物或非生物的不利因素[8-9]。Foster等[10]在1991年首先提出了誘導性耐酸響應（acid tolerance response，ATR），隨后，沙門氏菌在酸應激條件下存活的適應性反應得到了廣泛關注。誘導性耐酸響應的定義是指微生物在適度的低pH值環境中培養一段時間或暴露在微酸性環境中（酸適應），然后在普遍致命的低pH值環境中培養產生了抗性（酸激過程），稱作誘導性耐酸響應或耐酸反應[10-11]。有學者對不同酸（蘋果酸、檸檬酸、乳酸、醋酸、鹽酸）誘導沙門氏菌產生耐酸能力的研究發現，檸檬酸誘導能力最強，而鹽酸誘導能力最弱；其中乳酸和醋酸也具有較強的誘導能力[12]。ATR可增強細菌在酸性食品中的生存能力，使其在極端的胃酸環境中存活，嚴重威脅消費者的生命健康[13]。沙門氏菌的ATR受血清型、培養基組成、培養溫度、pH值、酸化劑種類等多種條件的影響[14]。沙門氏菌在弱酸環境下的ATR是細胞內發生的一個復雜的生理生化反應，目前關于ATR的研究主要從pH值穩態系統、應激蛋白分子的調控、細胞膜組成和流動性控制等方面進行研究。因此，本實驗研究了幾種有機酸（L-乳酸、醋酸和乙酰丙酸）和鹽酸在即食肉制品pH 6.0和肉極限pH 5.4下對兩株不同血清型沙門氏菌的生長和ATR的影響，以及沙門氏菌在酸脅迫下的pHi變化，為進一步探究沙門氏菌的ATR提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

鼠傷寒沙門氏菌標準菌株（S. typhimurium ATCC 14028）和分離自我國肉牛屠宰企業中常見的德爾卑沙門氏菌（S. Derby），由山東農業大學食品學院畜產品加工實驗室保存。

腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養基、腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA） 北京陸橋技術股份有限公司；L-乳酸 上海麥克林生物有限公司；醋酸、乙酰丙酸 上海阿拉丁工業公司；羧基熒光素琥珀酰亞胺脂 （5,6-carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE） 美國AAT Bioquest公司。

1.2 儀器與設備

S210 pH計 瑞士Mettler Toledo公司；生物安全柜美國Thermo Scientific公司；紅外線滅菌器 中國力康公司；804R離心機 德國Eppendorf公司；RF-5301PC熒光分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

原始菌株置于-80 ℃條件下貯藏。工作菌株按照1%的接種比例從貯藏液轉接至BHI培養基（pH 7.4）中，37 ℃過夜（約18 h）培養。

1.3.2 生長曲線的測定

本實驗對兩株沙門氏菌在五種培養基中的生長曲線分別進行了測定。空白對照為100 mL BHI培養基（pH 7.4），鹽酸對照組用鹽酸調BHI培養基pH值分別為6.0和5.4。三個處理組為分別添加了L-乳酸、醋酸及乙酰丙酸的BHI培養基（pH值分別為6.0和5.4）。將上述所述的過夜（約18 h）培養的菌液，分別于4 ℃下離心（5 000×g，10 min）收集菌體（兩株菌的細胞濃度約為108CFU/mL）。按1%的接種量，將其接種至上述各種BHI培養基中，37 ℃培養至穩定期。每小時收集樣品，適度稀釋后涂布于BHIA，并在37 ℃培養24 h后菌落計數。以lg（CFU/mL）表示存活細胞數量隨時間變化，然后將數據擬合到Gompertz模型[15]生成生長曲線方程（1）。

式中：N0是初始細胞計數的對數（lg（CFU/mL））；C是初始和最終細胞數之間的差值（lg（CFU/mL））；k是最大比生長速率/h-1；LPD是遲滯期持續時間（lagphase duration）/h；X培養時間/h；Y是細胞計數的對數（lg（CFU/mL））。

生長動力學參數為：LPD、k、最大生長密度（maximum population density，MPD）（lg（CFU/mL））、達到穩定期所需的時間（time needed to reach the stationary-phase，TSP）/h和增代時間（generation time，GT）/h。GT根據式（2）計算。

式中：0.301為系數。

1.3.3 誘導性耐酸的測定

參考Liu Jiamei等[13]的方法，取1 mL培養至穩定期（10～48 h）的酸適應或非酸適應的菌液（兩株菌的細胞濃度約為108CFU/mL）離心（8 000×g，5 min，4 ℃）后接種于9 mL的pH 3.0的BHI溶液（使用HCl調節）中酸激2 h。分別在酸激前和酸激2 h后，梯度稀釋后涂布于BHIA平板培養基，37 ℃培養24 h，進行菌落計數。殘存率以酸激前后菌落數比值的對數表示，并按照式（3）計算。

式中：NC為酸激后菌落數（lg（CFU/mL）），N0為酸激前菌落數（lg（CFU/mL））。3 次獨立實驗，每次實驗做3 個平行。

1.3.4 pHi的測定

參照Breeuwer等[16]的方法，分別對上述兩株沙門氏菌在不同培養條件中的pHi進行測定。

預處理：將兩株沙門氏菌分別接種于如上所述的不同pH值條件下的100 mL空白對照培養基、鹽酸對照培養基、L-乳酸、醋酸和乙酰丙酸的BHI培養基中。生長至穩定期，離心收集（8 000×g，10 min），用緩沖液D（含50 mmol/L HEPES緩沖液，5 mmol/L EDTA，pH 7.2）洗滌1 次后將其懸浮在等體積的緩沖液D中，加入一定量的終濃度為1.0 μmol/L CFSE，37 ℃避光溫育30 min后，離心（8 000×g，0 ℃，15 min）收集菌體，在同樣的條件下，用緩沖液E（含50 mmol/L KH2PO4-NaOH緩沖液，pH 6.8）洗滌1 次，去上清液，然后將其懸浮在緩沖液E中，再加入一定量的濃度為10 mmol/L的葡萄糖，37 ℃溫育30 min后，用緩沖液E洗滌1 次，然后再將其懸浮在緩沖液E中細胞密度為108CFU/mL，避光冷藏備用。

建立pHi標準曲線：pHi標準緩沖液（含50 mmol/L氨基乙酸、50 mmol/L檸檬酸、50 mmol/L Na2HPO4·2H2O、50 mmol/L KCl）調節pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，共8 種緩沖液。將上述進行熒光標記的菌液離心（8 000×g，4 ℃，10 min），然后將其懸浮在相等體積、pH值不同的8 種緩沖液中，制成一系列菌懸液，再加入一定量終濃度為1 μmol/L的纈氨霉素和終濃度為1 μmol/L尼日利亞菌素，使兩株沙門氏菌細胞內外pH值達到平衡，15 min后，用熒光分光光度計測定發射波長為520 nm、激發波長分別為490 nm和435 nm的熒光強度（激發縫寬為5 nm，發射縫寬為10 nm）。以490 nm與435 nm的熒光強度的比值（R490nm/R435nm）為縱坐標，pHi標準緩沖液的pH值為橫坐標，數據經R軟件回歸處理后，作出R490nm/R435nm隨pH值變化的標準曲線。

pHi測定：在發射波長為520 nm、激發波長為490 nm和435 nm下，用熒光分光光度計分別測定上述處理后熒光標記的樣品（懸浮在緩沖液E中）的熒光強度，求得R490nm/R435nm的比值；再根據制作的R490nm/R435nm隨pH值變化的標準曲線，則可計算出R490nm/R435nm所對應的pHi。進行3 次獨立實驗，每次實驗做3 個平行。

1.4 數據統計分析

采用SAS 9.0的混合模型（MIXED Procedure）進行統計分析，菌株、pH值和酸的種類作為對細菌殘存率和pHi影響的固定因素，實驗重復及固定效應的交互作用為隨機因素，數據用平均值及標準誤（standard error，SE）表示，差異顯著水平P＜0.05；采用Origin Pro 9.4軟件和R 3.5.1軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 不同pH值和酸化劑種類對沙門氏菌生長動力學參數的影響

在不同pH值（5.4和6.0）下，對兩株沙門氏菌在鹽酸、L-乳酸、乙酸和乙酰丙酸酸化的BHI（不含葡萄糖）和非酸化BHI培養基（pH 7.4）中的生長情況進行了測定。表1、2中顯示了沙門氏菌的主要生長參數。Gompertz方程的決定系數（R2）均大于0.95，表明該方程能很好地擬合沙門氏菌在不同培養基中的生長情況。在生長培養基中添加有機酸可提高GT、TSP和LPD，并降低k和MPD。pH值為6.0時，不同有機酸對沙門氏菌的抑制效果與pH 5.4相似。本研究發現，低pH值延遲了沙門氏菌的生長，GT、TSP和LPD均較高，而MPD和k則較低。pH值為5.4時的環境對沙門氏菌有較好的抑菌效果且有機酸的抑菌效果高于無機酸。這與先前的研究在一定的pH值下，乳酸比鹽酸具有更強的抑制作用是一致的[17]。

圖1、2顯示了不同pH值（5.4和6.0）下兩株不同血清型的沙門氏菌在非酸化BHI（pH 7.4）和酸化BHI培養基（鹽酸、L-乳酸、乙酸和乙酰丙酸）中的生長曲線。有機酸存在解離和未解離兩種形式，未解離的有機酸由于與細菌的細胞膜具有相似相溶的特性，可經自由擴散直接進入細菌內部，由于細菌內部pH值接近中性，未解離的有機酸在細菌內部解離，降低了膜內pH值，削弱菌膜的跨膜梯度，進而抑制了細菌的生長[18]。

表1 鼠傷寒沙門氏菌的生長動力學參數Table 1 Growth kinetic parameters of S. typhimurium

表2 德爾卑沙門氏菌的生長動力學參數Table 2 Growth kinetic parameters of S. Derby

圖1 鼠傷寒沙門氏菌在5 種培養基中的生長擬合曲線Fig. 1 Growth curves of S. typhimurium in various media

圖2 德爾卑沙門氏菌在5 種培養基中的生長擬合曲線Fig. 2 Growth curves of S. Derby in various media

結果表明pH 5.4時，有機酸對沙門氏菌的抑制作用明顯增強，其中乙酰丙酸對沙門氏菌的生長抑制作用最強，GT（3 h）和TSP（48 h）均較高（表1、2）。酸化劑的抑菌強弱為：乙酰丙酸＞醋酸＞L-乳酸＞鹽酸。這些結果與álvarez-Ordó?ez等[19]研究的結果一致，該學者測試了鼠傷寒沙門氏菌在不同pH值和不同溫度下用醋酸、乳酸、檸檬酸和鹽酸酸化的BHI中生長的能力，發現無論pH值和溫度如何變化，酸抑制細菌生長的順序均為：醋酸＞乳酸＞檸檬酸＞鹽酸。與乳酸和醋酸相比，乙酰丙酸具有更好的耐熱性，更少的蒸發量，這可以提供最有效的殺菌效果[5]。本研究表明pH值為5.4的乙酰丙酸可以一定程度上抑制沙門氏菌的生長。

2.2 誘導性耐酸的測定

殘存率是比較微生物的耐酸能力的重要指標。由表3可知，在弱酸性pH值下預適應顯著增強了沙門氏菌的耐酸性。與非酸適應性細胞相比，酸適應的沙門氏菌細胞在pH 3.0的BHI培養基中殘存率顯著提高（P＜0.05），沙門氏菌在弱酸環境中產生了較強的耐酸性，有機酸培養基中培養的沙門氏菌的ATR顯著高于在無機酸環境中培養的沙門氏菌。另外，研究發現不同血清型菌株之間ATR存在差異，S. typhimurium對不同的有機酸產生的ATR差異顯著（P＜0.05），而乙酰丙酸處理的S. Derby的殘存率在不同pH組存在顯著差異（P＜0.05）。

研究表明，在pH 5.4酸適應后產生的耐酸性顯著高于pH 6.0酸適應后的耐酸性，pH 5.4提高了沙門氏菌對強酸的敏感性。在pH值為6.0的L-乳酸誘導下，pH 3.0酸激后S. typhimurium的菌落數減少約2.4（lg（CFU/mL）），而pH 5.4酸適應后，pH 3.0酸激后細菌的菌落數僅減少0.9（lg（CFU/mL））。該結果與劉佳玫等[20]報道的結果一致，在溫和的低pH值環境下培養沙門氏菌使其耐酸性增強，即ATR。Burin等[21]發現在pH 6.0或pH 5.0時，沙門氏菌對有機酸的適應能力較強。然而，當pH值較低（pH 4.0）時，細菌在6～24 h后無法存活。另外Samelis等[22]的報告發現，酸適應使沙門氏菌對低溫環境更敏感，在低溫（10 ℃）下生長的鼠傷寒沙門氏菌與在30 ℃下獲得的細胞相比，耐酸性降低。因此有機酸協同低溫加工貯藏可作為控制食品微生物的方法。

表3 沙門氏菌在BHI（pH 3.0）酸激2 h后的殘存率Table 3 Survival rates of Salmonella challenged in BHI at pH 3.0 for 2 h

不同酸化劑處理的沙門氏菌殘存率存在一定差異（表3）。耐酸性強弱大致為：L-乳酸＞醋酸＞乙酰丙酸＞鹽酸，其中L-乳酸和醋酸耐酸性之間無顯著性差異，乙酰丙酸耐酸性較弱且顯著低于其他兩組有機酸（P＜0.05）。該結果與Zhang Yimin等[23]報道的酸適應性單增李斯特菌在pH 6.0乙酰丙酸與乳酸和醋酸中的存活率無顯著性差異的結果不同，本研究發現乙酰丙酸適應下的沙門氏菌殘存率低，說明其殺菌效果最強，這意味著乙酰丙酸可作為食品加工中一種理想的殺菌劑。但是這些結果需要進一步擴大ATR的研究以應對不同的環境條件，以促進設計和提高風險評估研究的準確性。

2.3 pHi的變化

pHi與細菌產生ATR的能力密切相關，在低pH值環境中，細胞質會通過排出質子來維持pHi的穩定[24]。測定pHi變化可以進一步探究沙門氏菌細胞在酸脅迫下維持pHi的能力。圖3、4分別為S. typhimurium和S. Derby在BHI培養基中生長至穩定期pHi標準曲線。通過R軟件回歸處理后得到的模型檢驗P＜0.01，R2趨近于1，擬合度較好。這表明，本研究所建立的以CFSE為熒光指示劑測定沙門氏菌pHi的方法是穩定的。因此，該方法在后續研究中被進一步用于測定不同條件下的pHi，以揭示沙門氏菌的耐酸性。由圖3、4可知，隨著pHi的升高，熒光強度比值（R490nm/R435nm）呈升高趨勢。

表4為S. Typhimurium和S. Derby在不同pH值、不同酸培養基中生長至穩定期后的pHi。研究表明胞外pH值為5.4和6.0時，有機酸處理的沙門氏菌pHi與鹽酸對照組相比普遍存在差異，有機酸在該pH值狀態下誘導的致死酸應激使有機酸比無機酸更有效地緩解pHi。這與ATR結果一致，表明沙門氏菌有機酸誘導的耐酸反應與pHi的穩定能力有關。Cheng Changyong等[25]研究發現單增李斯特菌在乙酸和乳酸存在下，在細胞外pH 4.5下維持pHi的能力受到損害，但在鹽酸和檸檬酸處理組中沒有影響，與本實驗結果相似。不同有機酸處理對沙門氏菌pHi的影響存在差異。pH 6.0的L-乳酸處理組沙門氏菌pHi顯著高于醋酸和乙酰丙酸處理的pHi（P＜0.05）；而在pH 5.4時，沙門氏菌的pHi有機酸處理組之間無顯著性差異。

不同的胞外pH值對其pHi的影響有一定差異，pH 5.4條件下細菌更易維持pHi穩定，其中鹽酸和乙酰丙酸處理組的細菌pHi差異顯著（P＜0.05）。同時pH 5.4時其耐酸能力較強，這說明在弱酸壓力條件下細菌pHi的穩定能力與其酸誘導產生的耐強酸能力成正比，與ATR結果相一致。有研究指出蠟樣芽孢桿菌在低pH值的生長過程中能夠產生ATR，這種適應性依賴于pHi穩態，并且在谷氨酸、精氨酸和賴氨酸存在下增強[26]。張群等[27]研究發現琥珀酸放線桿菌在pH 4.7和pH 4.5時，pHi升高；而pH值大于5.2時，pHi降低，該研究表明這是由于細胞膜受到損傷使其通透性增大，pHi受到緩沖液影響的結果。另外，兩株不同血清型的沙門氏菌在有機酸處理下pHi存在一定差異，其中乙酰丙酸處理組兩株沙門氏菌的pHi均差異顯著（P＜0.05）。該結果與Cheng Changyong等[25]報道的結果一致，他測定了不同酸環境下不同血清型單增李斯特菌的pHi變化，發現不同血清型單增李斯特菌維持pHi穩定的能力存在差異。本研究表明細胞外部pH值和有機酸環境共同決定了pHi的穩定性，在有機酸存在的弱酸培養條件中，S. typhimurium胞內pH值的波動較小。結合ATR結果發現在pH值為5.4和6.0的誘導條件中兩株沙門氏菌均產生顯著的ATR，細菌維持pHi穩態的能力與其在酸性條件下的生長和存活狀況有關。在一定細胞外pH值下有機酸處理對pHi的影響也是沙門氏菌產生ATR的重要因素。

圖3 鼠傷寒沙門氏菌在BHI培養基中生長至穩定期pHi標準曲線Fig. 3 Standard curve of fluorescent intensity ratio versus intracellular pH of stationary phase S. typhimurium cultured in BHI medium

圖4 德爾卑沙門氏菌在BHI培養基中生長至穩定期pHi標準曲線Fig. 4 Standard curve of fluorescent intensity ratio versus intracellular pH of stationary phase S. Derby cultured in BHI medium

表4 兩株沙門氏菌在不同培養條件中生長至穩定期pHiTable 4 Intracellular pH of stationary phase Salmonella cultured in different media

3 討 論

研究發現乙酰丙酸殺菌效果最好，同時其產生耐酸性能力弱，是一種理想的殺菌劑。在酸適應和酸激過程中，不同因素的相互作用對ATR有很大的影響且不同血清型的沙門氏菌ATR差異顯著（P＜0.05）。沙門氏菌在極端酸性環境中存活的能力可根據先前的生長條件而發生顯著變化。pH 6.0的環境顯著降低了細菌的耐酸性（P＜0.05），而耐酸性的產生伴隨著pHi的變化，在一定細胞外pH值下有機酸處理對pHi的影響也是沙門氏菌產生ATR的重要因素。其中涉及到多種機制的協同作用還有待進一步探究。

沙門氏菌對pH 5.4和pH 6.0的適應性強調了在食品加工中利用有機酸殺菌時適當監測pH值變化的重要性。另外，有機酸和低溫[28]、乙醇[29]、高壓[30]等的聯合處理也被證明是一種良好的選擇。因此在食品加工過程中采用聯合殺菌可作為防止該病原微生物生長和存活的一種策略。