乳酸菌細菌素Durancin GL對單增李斯特菌的抗菌活性及機制

吳學友，朱 悅，陳正行，鞠興榮,

（1.江南大學食品學院，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇省糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

單核細胞增生性李斯特菌（簡稱單增李斯特菌）是一種食源性病原菌，其廣泛存在于水、土壤、植物中[1]。該菌可污染牛奶[2]、肉制品[3]、蔬菜[4]等食品，在加工、運輸和冷藏條件下均可生長[5]。單增李斯特菌是人畜共患菌，可引起人和動物腦膜炎、敗血癥、胃腸炎等疾病，威脅人類生命與健康[6-7]。此外，研究發現單增李斯特菌可形成生物膜[8]，該結構影響了化學防腐劑的抑菌效果，給食品加工帶來難題。此外，化學防腐劑的安全隱患以及抗生素耐藥菌的大量出現越來越受到人們重視。因此，尋找新型天然綠色安全的抑菌物質已經迫在眉睫。

乳酸菌是公認的食品級安全微生物，廣泛應用于食品工業，尤其是乳制品行業。細菌素是由細菌核糖體合成并分泌至細胞外的一類具有抗菌活性的蛋白質（多肽）[9-10]。研究發現其對目標菌的抑制具有濃度低、效價高等特點，且目標菌不會產生耐藥性[11]。乳酸菌產生的細菌素本身就存在于食品基質中，其來源明確，安全可靠；應用于食品防腐保鮮具有獨特優勢以及極大潛力[12]。近年來，不同來源新型細菌素的研究與挖掘受到科研工作者的廣泛關注，眾多新型細菌素陸續見諸報道[13-16]。這些細菌素抑制目標微生物的機理研究也有相關報道，如Nisin[17-18]、Pediocin Pa-1[17,19-20]、Plantaricin 163[21]等。Nisin是目前研究最為透徹的細菌素，自1957年首次商業應用以來已有60余年且成效顯著[22]，開展新型細菌素的發掘以及闡釋其抑制目標菌相關機理具有重大的價值。

研究發現，腸球菌及其產生的細菌素對單增李斯特菌具有良好的抑制作用[23-26]。乳酸菌細菌素Durancin GL是由干酪制品中腸球菌產生的一種新型細菌素，本課題組前期研究發現，該細菌素由43 個氨基酸組成，且N-端含有保守序列YYGNG[27]，具有良好的理化穩定性，如經吐溫、玻雷吉和十二烷基硫酸鈉等表面活性劑處理后其抑菌活性保持不變，且在pH 2～11范圍內或經100 ℃處理30 min仍保持活性[28]。此外，Durancin GL對單增李斯特菌具有較強的抑制作用，包括抗Nisin的L. monocytogenes NR30[29]。為了充分認識該新型細菌素對單增李斯特菌抗菌活性、探索抑制單增李斯特菌相關機理，本研究通過最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC）和殺菌動力學考察Durancin GL對單增李斯特菌的抑制作用，結合監測胞內物質泄漏、菌體存活情況以及形態學分析探討Durancin GL對單增李斯特菌的抑制機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Durancin GL表達載體由本實驗室自行構建[27]；pGEX-P-1載體 美國GE公司；單增李斯特菌L. monocytogenes Scott A 江蘇省疾病預防控制中心；表達菌株Escherichia coli Rosetta（DE3）、表達載體pGEX/his-durAB、細菌基礎培養基、腦心浸液（brian heart infusion，BHI）培養基 北京陸橋技術股份有限公司；LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit美國Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為分析純國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

微型臺式冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；AKTA蛋白純化系統 美國GE公司；M2e酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；FE32 DDS-電導率儀 德國Meitele-Tuoliduo公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；GeminiSEM 300掃描電子顯微鏡 德國Carl Zeiss公司；JEM-2100透射電子顯微鏡日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 Durancin GL的外源表達及制備

將本實驗室構建的表達載體pGEX/his-durAB轉入表達菌株E. coli Rosetta（DE3）中，參考Ju Xingrong等[29]的方法，在5 L Jupiter生物反應器中制備Durancin GL，生物反應器運行參數為：裝液量為2.5 L，溫度37 ℃，攪拌轉速300 r/min，無菌空氣流速為0.5 L/min。每隔一段時間檢測生物反應器中菌體質量濃度、pH值、上清液以及細胞破碎液中細菌素的效價。參考文獻[30]將制備的細菌素經梯度稀釋，通過瓊脂擴散法檢測其對單增李斯特菌的抑菌效果，以抑菌圈直徑不小于2 mm為具有抑菌效果，用有抑菌效果的最高稀釋倍數表示細菌素的效價。發酵結束后，菌液于4 ℃下10 000×g離心15 min，棄上清液，反復洗滌菌體沉淀后采用液氮冷凍，經細胞破碎儀處理，再次于4 ℃下10 000×g離心15 min，取上清液，利用AKTA蛋白純化系統，借助親和層析柱GE GSTrap 4B分離純化細菌素，再經腸激酶切除標簽，再次重復這一步驟去除標簽蛋白后，經冷凍干燥即制得乳酸菌細菌素Durancin GL凍干粉，于-20 ℃保存備用。

1.3.2 MIC的測定

MIC定義為抗菌劑可以抑制經過夜培養的微生物出現可見生長的最低質量濃度[31]。將制備的細菌素配制系列梯度溶液，通過瓊脂擴散法檢測其對單增李斯特菌的抑菌效果，以抑菌圈直徑不小于2 mm為具有抑菌效果，以有抑菌效果的最低細菌素溶液質量濃度作為外源表達細菌素對單增李斯特菌的MIC，單位為mg/L。實驗重復5 次。

1.3.3 Durancin GL對單增李斯特菌生長曲線、OD值和pH值的影響

以體積分數1%向經121 ℃、15 min滅菌處理過的BHI液體培養基中接種單增李斯特菌，置于37 ℃恒溫培養箱中，以150 r/min搖動培養。每隔一定時間檢測菌體生長情況（以600 nm波長處菌液的OD值表示），在對數生長期加入乳酸菌細菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），繪制單增李斯特菌生長曲線，以加入等量無菌水的實驗組作為對照。菌液OD值和pH值分別采用分光光度計和pH計進行測定。實驗重復3 次，取平均值。

1.3.4 Durancin GL對單增李斯特菌電導率、OD260nm和OD280nm的影響

單增李斯特菌的培養方法同1.3.3節，OD600nm＝0.6時，經4 ℃下8 000×g離心15 min收集菌體沉淀，用50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）洗滌細胞3 次，菌體沉淀重懸于200 μL 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0），使其OD600nm＝0.4，加入乳酸菌細菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），每隔一段時間取樣一次，4 ℃、8 000×g離心15 min，用電導儀測定上清液的電導率。用分光光度計測定上清液OD260nm、OD280nm。以添加等量50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）處理組為對照。實驗重復3 次，取平均值。

1.3.6 Durancin GL對單增李斯特菌存活率的影響

參考文獻[32]的方法并略修改，具體操作如下。當監測到單增李斯特菌已處于對數生長期后期時，向體系內加乳酸菌細菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），繼續培養5 min，經4 ℃、10 000×g離心15 min收集菌體沉淀，取適量沉淀重懸于20 mL質量分數0.85% NaCl溶液中，孵育1 h，每隔15 min混勻溶液1 次，經4 ℃下10 000×g離心15 min收集菌體沉淀，再次重懸于質量分數0.85% NaCl溶液中制備單增李斯特菌菌懸液（OD670nm＝0.03～0.30）。取1 μL該菌懸液加入3 μL試劑盒中組分A與組分B等體積混合物，在室溫下黑暗環境中孵育15 min，立即轉入倒置熒光顯微鏡，選擇激發波長485 nm，分別在530 nm（綠色）和630 nm（紅色）波長處觀察拍照。對照組為未經乳酸菌細菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌。

1.3.7 掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察

通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察Durancin GL對單增李斯特菌的細胞損傷。以體積分數1%向經121 ℃、15 min滅菌處理過的BHI液體培養基中接種單增李斯特菌，置于37 ℃恒溫培養箱中，以150 r/min搖動培養。當監測到單增李斯特菌處于對數生長期時，向體系中加入乳酸菌細菌素Durancin GL（終濃度為50 AU/mL），繼續培養5 min，4 ℃、1 500×g離心35 min收集菌體沉淀，參照文獻[33]的方法對菌體進行前處理，并通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態和內部結構。對照組為未添加乳酸菌細菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌。

1.4 數據統計與分析

實驗結果表示為平均值±標準差，采用SPSS 25.0軟件進行數據處理與分析，采用單因素方差分析結合Duncan's法檢驗差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 Durancin GL的外源表達及對單增李斯特菌的MIC

圖1 重組菌生長與細菌素的積累Fig. 1 Growth of recombinant bacterium and bacteriocin accumulation

大腸桿菌原核表達系統因其高效易純化的優點，被廣泛應用于目的蛋白質的外源表達。從圖1可以看出，重組菌進入對數生長期后，細菌素表達開始累積，發酵上清液與菌體破碎液中Durancin GL效價測定結果顯示兩者差異極大，表達的細菌素Durancin GL主要位于大腸桿菌細胞內。經測定，本實驗制備的乳酸菌細菌素Durancin GL對單增李斯特菌L. monocytogenes Scott A的MIC為（2.5±0.4）mg/L。

2.2 Durancin GL對單增李斯特菌生長曲線的影響

圖2 Durancin GL對單增李斯特菌生長曲線的影響Fig. 2 Effect of durancin GL on growth curve of L. monocytogenes

圖2 為乳酸菌細菌素Durancin GL對單增李斯特菌生長曲線的影響，即抑菌動力學曲線。在對數生長期，向培養體系中添加乳酸菌細菌素Durancin GL后，實驗組中OD600nm暫停增加，說明單增李斯特菌生長受抑制。添加乳酸菌細菌素Durancin GL后，實驗組菌落總數開始下降，表明單增李斯特菌活菌數量減少。隨后因細菌素被消耗，大腸桿菌增長速率超過被抑制速率，表現出菌體總數的增加。杜賀超等[21]研究中使用的細菌素劑量更高，其結果顯示目標細菌大量死亡。

2.3 Durancin GL對單增李斯特菌細胞膜通透性的影響

菌體細胞膜通透性可以通過電導率的改變進行觀察。在培養期間，添加磷酸鉀緩沖液的對照組電導率變化不顯著，乳酸菌細菌素Durancin GL處理組電導率隨著時間延長而增大（圖3），推測乳酸菌細菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌膜通透性變大，導致菌體胞內物質流出，引起上清液電導率的增加。

圖3 Durancin GL對單增李斯特菌電導率的影響Fig. 3 Effect of durancin GL on electrical conductivity of L. monocytogenes

2.4 Durancin GL對單增李斯特菌細胞膜完整性的影響

上清液的OD260nm、OD280nm反映了單增李斯特菌膜對蛋白及核酸大分子的通透性，進而能夠反映細胞膜完整性的變化。如圖4所示，在2 h培養時間內，對照組的OD260nm和OD280nm基本保持不變，乳酸菌細菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌OD260nm和OD280nm隨著時間延長不斷增大，在1.5 h時均達到最大值0.2。上清液中OD260nm和OD280nm的增加表明乳酸菌細菌素Durancin GL能破壞細胞膜，使單增李斯特菌細胞中的大分子物質外流，細胞生長代謝受到影響。這說明乳酸菌細菌素Durancin GL不僅能提高單增李斯特菌細胞膜通透性，而且能破壞細胞膜的完整性。

圖4 Durancin GL對單增李斯特菌OD260 nm（A）和OD280 nm（B）的影響Fig. 4 Effect of durancin GL on optimal density of L. monocytogenes at 260 nm (A) and 280 nm (B)

2.5 Durancin GL對單增李斯特菌存活率的影響

LIVE/DEAD BacLight Kit常用于快速檢測細菌細胞存活率[33]，近年來應用越來越廣泛。利用熒光探針檢測乳酸菌細菌素Durancin GL對單增李斯特菌存活情況的影響，綠色代表活菌體，紅色代表死菌體。從結果中可以看出，未經乳酸菌細菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌生長狀態良好（圖5A），乳酸菌細菌素Durancin GL可以導致單增李斯特菌部分死亡（圖5B）。圖5結果直觀反映了細菌素Durancin GL對單增李斯特菌的影響，因該方法是通過熒光探針的熒光信號來反映Durancin GL處理后單增李斯特菌細胞膜通透性的變化，而細胞膜通透性的增加不一定會導致細胞死亡，因此，細菌素Durancin GL作用于單增李斯特菌后細胞存活情況的檢測采用平板計數法更為準確（圖2）。

圖5 Durancin GL對單增李斯特菌存活情況的影響Fig. 5 Effect of durancin GL on survival of L. monocytogenes

2.6 Durancin GL對單增李斯特菌形態和結構的影響

采用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察單增李斯特菌的外部形態及內部結構。掃描電子顯微鏡觀察結果顯示，未經乳酸菌細菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌呈桿狀，表面光滑且飽滿（圖6A）；細菌素Durancin GL處理的單增李斯特菌菌體表面凹陷、有褶皺（圖6B）。

圖6 Durancin GL對單增李斯特菌形態和結構影響的掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 Effect of durancin GL on morphology and structure of L. monocytogenes observed by scanning electron microscopy

圖7 Durancin GL對單增李斯特菌形態和結構影響的透射電子顯微鏡圖Fig. 7 Effect of durancin GL on morphology and structure of L. monocytogenes observed by transmission electron microscopy

透射電子顯微鏡觀察結果可以看出，未經處理的單增李斯特菌菌體結構致密，內部及細胞膜完整（圖7A）；乳酸菌細菌素Durancin GL處理后，觀察到單增李斯特菌菌體結構疏松，胞內透亮（圖7B），說明細胞質已外流，說明乳酸菌細菌素Durancin GL對單增李斯特菌的內部結構及外部形態均造成影響。結合圖3～7結果，推斷是乳酸菌細菌素Durancin GL與單增李斯特菌細胞表面受體結合后引起的某些物質交換或者結構變化，造成細胞通透性增加，進而影響細胞功能與形態，導致菌體細胞死亡。

3 討 論

本研究通過將實驗室構建的表達載體pGEX/his-durAB轉入表達菌株E. coli Rosetta（DE3）中，在5 L發酵罐中外源表達、制備乳酸菌細菌素Durancin GL。其對單增李斯特菌的MIC為（2.5±0.4）mg/L。考慮到制備后的細菌素凍存保藏，每次取用時需要重新測定其效價，為此本研究依然采用效價作為評價實驗中使用的細菌素活性標準。在前期研究中發現制備的乳酸菌細菌素Durancin GL效價為50 AU/mL時，對單增李斯特菌具有較好的抑制效果。

研究通過對乳酸菌細菌素Durancin GL抑制單增李斯特菌活性及其機制的探討，明確了Durancin GL對單增李斯特菌的抑制效果，該細菌素作用于單增李斯特菌時，OD260nm與OD280nm檢測結果說明胞內蛋白質類和核酸類釋放到細胞外環境中。一方面，細菌素引起菌體細胞透性的增加，導致物質釋放；另一方面，隨著胞內物質的釋放，菌體細胞裂解死亡，從而加劇胞內物質的釋放，隨之使菌體的形態（胞內、胞外）均發生改變。杜賀超等[21]對細菌素Plantaricin 163抑制熱殺索絲菌作用機制的研究，以及劉國榮等[34]對雙歧桿菌細菌素Bifidocin A抑制大腸桿菌作用機理的研究均得到類似結論，這與已見報道的Ⅱa類細菌素作用機制[35-36]較為一致。

微生物污染是食品工業中最重大的安全問題，控制及消滅微生物技術的探索一直未曾間斷。在化學防腐劑被逐漸舍棄的未來，食品級來源的乳酸菌細菌素潛力無限。更安全和更可持續發展是食品產業鏈對于未來發展的清晰定位，食品級乳酸菌細菌素作為防腐保鮮劑防止微生物污染、提高食品安全性是非常值得稱贊的應用趨勢[37]。為此，深入、全面、透徹地認知細菌素抑制目標菌的機理機制，將為細菌素早日應用提供重要保障。