電針治療周圍神經損傷后損傷局部差異表達基因分析*

車文文，郭永明，王 丹，趙舒蒙，郭 義，章明星

（1.天津中醫藥大學實驗針灸學研究中心，天津 301617；2.天津中醫藥大學中醫學院，天津 301617；3.天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617）

周圍神經損傷（PNI）是臨床常見疾病，交通事故是導致PNI 的主要原因[1]。雖然周圍神經損傷后可以再生，但是其結構比較復雜，致使周圍神損傷后的功能恢復率只能達到損傷前的70%左右[2]。PNI還會導致骨骼肌失去神經支配，長期失神經狀態則會引起肌容量喪失、肌纖維重構，肌衛星細胞減少等病理改變，最終造成不可逆的失神經性肌萎縮，致使運動功能恢復不理想[3-4]。近些年來神經修復水平有了明顯的提高，但神經功能恢復效果仍不盡如人意。大量研究表明電針療法對PNI 治療效果顯著[5]。團隊前期研究結果已表明電針治療周圍神經損傷有效[6-7]。然而，電針對PNI 治療作用的具體機制尚不完全明確，還需要進一步的研究。高通量轉錄組測序技術是從轉錄組水平來研究基因表達譜的一個新的技術手段，其憑借高靈敏度、高通量和低成本的優勢成為從全基因組水平研究基因表達的主要方法[8]。本研究利用高通量測序技術對坐骨神經損傷局部神經組織進行轉錄組測序，并結合生物信息學技術對獲得的差異表達基因開展功能注釋、信號通路分析等方面的研究，以進一步闡明電針治療周圍神經損傷的作用機制，為電針進一步推廣應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集 依據文獻報道和實驗動物“3R 原則”，本實驗選取Wistar 大鼠9 只[4-5]，雄性，8 周齡，SPF 級，隨機分為空白組、模型組、電針模型組，對電針模型組、模型組建立坐骨神經橫斷傷模型，電針刺激患側環跳（+）、足三里（-），電針參數：輸出頻率5 赫茲，斷續波，15 min，強度以患肢輕微顫動為度。電針6 d 后，在坐骨神經橫斷傷處，以損傷處為中心取1 cm 長的神經組織樣品，并迅速置于液氮中，然后放入-80 ℃超低溫冰箱內冷凍保存，用于RNA 提取和轉錄組測序。

1.2 測序方法 進行樣品的total RNA 抽提，后純化total RNA，再進行質檢，質檢合格的RNA 可進行后續的測序實驗。對純化后的total RNA 進行rRNA去除、片段化、第1 鏈cDNA 合成、第2 鏈cDNA 合成、末端修復、3'末端加A、連接接頭、富集等步驟，完成測序樣本文庫構建，文庫質檢合格后進行上機測序，進行雙端測序。對測序得到的raw reads 進行質控。所有的樣品測序量都滿足質控標準后進行數據分析。

2 結果

2.1 差異表達基因 以P≤0.05、Fold-change≥2為條件，篩選3 個樣本的差異表達基因。模型組與空白組相比，檢測到4170 個顯著性差異基因，下調差異基因3 001 個，上調差異基因1 169 個（圖1）。電針模型組和模型組相比，檢測出104 個顯著性差異基因，80 個差異基因下調，24 個差異基因上調（圖2）。其中有69 條基因造模后表達趨勢與電針后表達趨勢相反，62 條基因造模后表達上調，經過電針后表達下調，7 條基因造模后表達下調，經過電針后表達上調，因此這69 個基因是3 組共同差異表達基因，其在模型制備以及電針干預后均發生顯著的差異表達。這些差異基因中經過電針刺激后，上調最明顯的5 個基因為：Igh-1a、Igkc、Ncald、Igf2、Has3；下調最明顯的5 個基因為：Tchh、AABR07052585.1、Myh1、Mylpf、Actn3。

2.2 差異表達基因GO 功能注釋及顯著性分析 基因本體論（GO）是一個國際標準化的基因功能分類系統，提供了一個全面描述生物體的基因屬性和基因產物的動態更新詞匯庫[11]。將模型組與空白組、電針模型組與模型組的差異基因做GO 功能分類統計，從生物工程（biological process，BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3 個方面進行基因功能分析，篩選標準為P＜0．05。

圖1 空白組和模型組差異基因火山圖

圖2 電針模型組和模型組差異基因火山圖

圖3 空白組與模型組差異基因GO 分類結果

圖4 空白組與模型組差異基因GO 富集結果

圖5 電針模型組與模型組差異基因GO 分析結果

圖6 電針模型組與模型組差異基因GO 富集結果

空白組與模型組共45 187 個基因得到了注釋，BP 類別中：細胞過程、單一生物過程所含基因最多，CC 類別中：細胞、細胞部分類所占比例最高，MF類別中：結合、催化活性類所包含的基因最多；GO功能富集主要與細胞發育、遷移，信號轉導、神經系統發育等相關（圖3、圖4）。電針模型組與模型組共92 個差異基因得到分類注釋，BP 類別中細胞過程和單一生物過程包含的基因最多，在CC 類別中：細胞類、細胞部分類所占比例最高，而在MF 類別中：占主導地位的是結合類；GO 功能富集主要與鈣離子結合、免疫應答、以及電壓門控陽離子通道活性等過程相關（圖5、圖6）。

2.3 差異表達基因KEGG 通路分析 KEGG 數據庫是系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物功能的數據庫。利用該數據庫有助于把基因及表達信息作為一個整體的網絡進行研究。對差異基因進行KEGG 分析，空白組與模型組差異表達基因分析主要涉及與信號轉導、免疫系統、全局和概覽圖相關的通路。電針模型組與模型組差異表達基因主要涉及免疫系統、信號轉導、細胞群落3個方面，如圖7，8 所示。

對差異基因進行KEGG 通路富集，以P-value＜0．05 為標準，模型組與空白組之間的差異表達基因顯著富集了53 條KEGG 信號通路。電針模型組與模型組之間的差異表達基因涉及了19 條KEGG 信號通路，去掉與研究方向無關的通路，剩余可能與研究方向相關的通路8 個，富集結果如表1 所示。

3 討論

周圍神經損傷是常見的致殘性疾病，屬于中醫“痹癥”、“痿證”的范疇，《內經》就提出“治痿獨取陽明”的理論。在本次實驗中，選擇“環跳”、“足三里”兩穴，環跳穴位于足少陽膽經上，主要用于下肢痿痹等疾病的治療，足三里穴屬于足陽明胃經，補益要穴，電針刺激環跳、足三里可促進神經功能的恢復，深刺可以增加神經生長因子的表達[12-13]。研究表明電針療法不僅具有針刺穴位本身的作用，還可以產生弱電場，促進再生神經向陰極生長，且5 Hz 電針對于神經損傷的再生修復作用優于高頻電針[14-15]。故本實驗選擇環跳為陽極足三里為陰極，電針參數選擇斷續波、5 Hz，強度以肌肉出現輕微抽動為準。

圖7 電針模型組與模型組差異基因KEGG 分析結果

圖8 空白組與模型組差異基因KEGG 分析結果

表1 模型組與電針組KEGG 富集通路結果

目前，針灸治療周圍神經損傷經過大量的臨床和實驗研究已被證明是一種行之有效的方法。大量基礎研究顯示，電針能夠改善周圍神經損傷后運動終板內的營養物質含量和結構，能夠延緩肌肉的萎縮，促進神經生長相關因子的增多、促進雪旺細胞大量增生并且分泌多種神經活性物質，抑制脊髓前角和背根神經元凋亡，進而促進周圍神經損傷后形態和功能恢復[16-22]。近年來學者們逐漸認識到周圍神經損傷后修復與再生的微環境是決定其結局的關鍵，此微環境可概括為神經再生通道建立、神經營養因子調節、炎性反應、激素調節、信號通路調控及酶的調節等6 個方面，有研究表明電針對神經修復機制可能與神經損傷后神經元、軸突的再生記憶微環境的改變有關，但具體機制尚不明確，還需要進一步的研究[23-26]。高通量轉錄組測序技術是從轉錄組水平來研究基因表達譜的一個新的技術手段，現在被廣泛應用于挖掘功能基因、開發分子標記、揭示代謝調控途徑等方面，本研究采用該技術獲取大量電針治療周圍神經損傷的轉錄信息，并對差異基因進行定量、定性研究，篩選電針對神經的修復機制可能激活的信號通路，進一步闡釋電針的作用機制。

本實驗的結果表明空白組、模型組、電針模型組間基因有顯著的區別，說明電針后的大鼠在基因表達水平上存在特異表現，揭示這些差異表達基因可能在坐骨神經損傷的發生、發展中扮演重要角色。空白組與模型組共篩選出4 170 個顯著性差異基因，其中3 001 個基因在模型組中表達下調，1 169 個基因在模型組中表達上調；電針組和模型組一共檢測出104 個差異表達基因顯著,其中24 個基因在電針組組織中表達上調，80 個基因在電針組組織中表達下調，進一步的篩選發現差異最為顯著的30 個基因中，20 個為下調基因，10 個基因表達上調，表達顯著上調的前5 位基因是：AABR07051592.2、Igkc、Igh-1a、Igf2、LOC100912707；表達顯著下調的前5 位基因是：Acta1、Myh1、Ryr1、Myl1、Mylpf。GO富集分析結果表明電針可能是通過對免疫過程、離子通道、細胞骨架的調節而達到對周圍神經損傷的治療作用。KEGG 分析表明經過電針以后主要涉及免疫系統、信號轉導、細胞群落3 個方面的變化，其中細胞群落中涉及粘著斑、黏合連接、緊密連接等方面的變化，免疫系統中涉及補體、白細胞經內皮遷移、趨化因子信號通路、造血細胞系等方面的變化，信號轉導方面涉及cAMP 信號通路、AMPK 信號通路、FoxO 信號通路、TGF-β 信號通路、ras 信號通路、鈣信號通路、cgmp-pkg 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路等方面的變化，表明電針可能通過調控某些基因的表達從而影響神經的傳導及機體免疫功能的改變；結合KEGG 富集分析結果，基于電針治療周圍神經損傷研究現狀篩選了可能與研究方向相關的8 個通路：白細胞跨內皮遷移通路、γ-氨基丁酸能突觸通路、膽堿能突觸通路、5-羥色胺突觸通路、鈣信號通路、緊密連接通路、粘著斑通路、肌動蛋白細胞骨架的調控通路。

綜上所述，電針治療周圍神經損傷機制可能是通過改變細胞電位平衡、神經元軸突再生骨架結構的重建以及白細胞的遷移而改變周圍神經損傷后修復與再生的微環境，然而具體的分子機制還需結合相關的差異基因及具體信號通路，進一步研究。