三種國標方法測定酒中甜蜜素的比較與方法改進

閆吉昌，馬長海，于明明，辛若竹

（1.白城市產品質量檢驗所，吉林白城 137000；2.梅河口市食品藥品檢驗檢測中心，吉林梅河口 135000）

甜蜜素雖然作為一種甜味劑廣泛應用于各類食品中，但長期過量攝入也會損害健康，所以國家食品安全標準[1]嚴格規定了其使用范圍和使用限量。酒類產品按生產工藝和產品特性分為蒸餾酒、發酵酒和配制酒[2]。甜蜜素常作為甜味劑應用于配制酒中，這是國家食品添加劑使用標準允許的。而不法商販為改善酒品口感將甜蜜素應用于蒸餾酒和發酵酒中，這卻是國家嚴格禁止的。所以為保證酒類產品的品質，對酒中甜蜜素監測是十分必要的。目前，甜蜜素測定的常用方法有氣相色譜法[3-4]、液相色譜法[5-6]、液相色譜-質譜/質譜法[7-9]。GB 5009.97—2016甜蜜素測定的國家標準檢測方法[10]中規定了不同種類產品與其相應適用的分析方法，其中氣相色譜法不適用于酒類產品測定，液相色譜法適用于配制酒檢測，液相色譜-質譜/質譜法適用于蒸餾酒和發酵酒測定。本文通過比較氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-質譜/質譜法3種國標方法測定酒中甜蜜素含量，發現國標氣相色譜法不能將酒中的干擾物分離，常出現甜蜜素假陽性結果，這與其規定的適用范圍相吻合；液相色譜法雖無基質干擾現象，其檢出限滿足配制酒的檢測要求，但樣品衍生化時會產生有害物質，對操作者有潛在的危害；液相色譜-質譜/質譜法雖是檢測酒中甜蜜素最佳方法，但其設備比較昂貴，應用范圍受限。為了找到實用性更好且對操作者無潛在危害的酒中甜蜜素的檢測方法，對國標氣相色譜法進行了改進，通過優化色譜條件，使改進后的氣相色譜法能有效地消除基質干擾，檢出限、回收率及精密度均能滿足配制酒日常檢測要求，且方法技術參數均優于液相色譜法，擴展了國標氣相色譜法的適用范圍。同時對國標液相色譜-質譜/質譜法進行了優化，優化后的方法檢出限為0.01 mg/kg，低于國標液相色譜-質譜/質譜法，能滿足酒中微量甜蜜素的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒。

試劑及耗材：甜蜜素標準物質（純度99.1 %，Dr.Ehrenstorfer）；色譜純甲醇、乙腈（Fisher Scientific）；色譜純正庚烷（CNW）；色譜純甲酸（CNW）；氫氧化鈉溶液（40 g/L）；硫酸溶液（200 g/L）；亞硝酸鈉溶液（50 g/L）；氯化鈉；硫酸溶液（1+1）；次氯酸鈉溶液（有效氯含量50 g/L以上）；碳酸氫鈉溶液（50 g/L）。

儀器及設備：GC2010plus氣相色譜儀（FID檢測器，日本島津公司）；HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國安捷倫公司）；Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.7 μm,3.0×150 mm)；AB SCIEX API4000+超高效液相色譜/串聯質譜聯用儀（ESI離子源，美國AB SCIEX公司）；Kinetex? 2.6 μm F5 100 ?色譜柱（50×3.0 mm）；渦旋混合器（美國talboys）；KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機(湖南凱達)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 樣品處理

1.2.1 氣相色譜法和液相色譜法樣品溶液制備

稱取酒樣25.0 g于燒杯中，用氫氧化鈉溶液（40 g/L）調至pH7～8，60 ℃水浴加熱30 min以除去酒精，放冷，用水定容至50 mL備用。

1.2.2 氣相色譜法衍生化

準確移取制備好的酒樣溶液10.0 mL于50 mL帶蓋離心管中，置冰浴中5 min后，準確加入5.00 mL正庚烷，加50 g/L亞硝酸鈉溶液2.5 mL，加200 g/L硫酸溶液2.5 mL，蓋緊離心管蓋，搖勻，在冰浴中放置30 min，期間振搖3～5次；加入2.5 g氯化鈉，蓋上蓋后渦旋1 min，低溫3000 r/min離心10 min分層后，取上清液放置1～4 ℃冰箱冷藏保存以備進樣。

1.2.3 液相色譜法衍生化

準確移取制備好的酒樣溶液10.0 mL于50 mL帶蓋離心管中，加入2.0 mL硫酸溶液（1+1），5.0 mL正庚烷和1.0 mL次氯酸鈉溶液（有效氯含量50 g/L以上），劇烈振蕩1 min，靜置分層，除去水層后在正庚烷層中加入25 mL碳酸氫鈉溶液（50 g/L），振蕩1 min。靜置取上層有機相經0.45 μm微孔有機相濾膜過濾，濾液進樣備用。

1.2.4 液相色譜-質譜/質譜法樣品前處理

稱取酒樣1.0 g于50 mL燒杯中，加水1.0 mL，于60 ℃水浴上加熱30 min，殘渣全部轉移至10 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，經0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3 標準溶液制備

1.3.1 標準溶液配制（1.00 mg/mL）

精確稱取0.1124 g環己基氨基磺酸鈉標準品，用水溶解并定容至100 mL，混勻，此溶液1.00 mL相當于環己基氨基磺酸1.00 mg。

1.3.2 標準工作溶液系列1

準確吸取1.00 mg/mL標準溶液0.5 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL、10.0 mL、25.0 mL于50 mL容量瓶，加水定容，混勻。配制的標準溶液系列濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL。準確移取標準系列溶液10.0 mL分別按1.2.2衍生化于氣相色譜分析，再分別按1.2.3衍生化于用于液相色譜分析。

1.3.3 標準工作溶液系列2

準確吸取10 μg/mL標準工作溶液0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL于10 mL容量瓶，加水定容，混勻。配成標準工作溶液系列濃度分別為0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL。用于液相色譜-質譜/質譜分析。

1.4 色譜條件

1.4.1 氣相色譜條件

HP-5MS石英毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度260 ℃。柱流量1.00 mL/min，氫氣流速：40.0 mL/min，空氣流速：400.0 mL/min。分流進樣，分流比1∶10，進樣量1 μL。原國標法柱溫升溫程序55 ℃保持3 min，10 ℃/min升至90 ℃保持0.5 min，20 ℃/min升至200 ℃保持3 min。優化后的柱溫升溫程序55 ℃保持3 min，1 ℃/min升至60 ℃保持2 min，20 ℃/min升至200 ℃保持3 min。

1.4.2 液相色譜條件

Poroshell 120 EC-C18色譜柱2.7 μm，3.0×150 mm，流動相：乙腈+水（70+30），流速0.3 mL/min；檢測波長：314 nm；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

1.4.3 優化的液相色譜-質譜/質譜條件

1.4.3.1 色譜條件：Kinetex?2.6 μm F5 100 ?色譜柱50×3.0 mm，流動相：A泵為0.1%(v/v)甲酸水，B泵為甲醇，梯度洗脫程序B泵：0 min 3%；1 min，3 %；1.1 min，15 %；5.0 min，40 %；5.1 min，95 %；7.0 min，95 %；7.1 min，3 %；10 min，3 %。流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

1.4.3.2 質譜條件

①負離子模式：

離子源：ESI；檢測方式：-MRM；離子源參數：電噴霧電壓（IS）：-4500 V；霧化氣壓力（GS1）：55 Psi；輔助氣壓力（GS2）：60 Psi；氣簾氣壓力（CUR）：30 Psi；離子源溫度（TEM）：550 ℃；噴撞氣（CAD）：7 mL/min。監測離子對及電壓參數：定量離子對Q1/Q3：178.0/79.9 m/z；駐留時間:200 ms；去簇電壓（DP）：-60 V；碰撞氣能量（CE）：-35 V；碰撞池入口電壓（EP）：-10 V；碰撞池出口電壓（CXP）：-15 V。

②正離子模式：

離子源：ESI；檢測方式：+MRM；離子源參數：電噴霧電壓（IS）：5500 V；霧化氣壓力（GS1）：55 Psi；輔助氣壓力（GS2）：60 Psi；氣簾氣壓力（CUR）：30 Psi；離子源溫度（TEM）：550 ℃；噴撞氣（CAD）：7 mL/min。監測離子對及電壓參數：定性離子對Q1/Q3：202.2/122.1m/z；駐留時間：500 ms；去簇電壓（DP）：50 V；碰撞氣能量（CE）：11.8 V；碰撞池入口電壓（EP）：10 V；碰撞池出口電壓（CXP）：13 V。

1.5 樣品測定

1.5.1 氣相色譜法

分別吸取1 μL經衍生化處理的標準系列各濃度溶液上清液，注入氣相色譜儀中，可測得不同濃度被測物的響應值峰面積，以濃度為縱坐標，以環己醇亞硝酸酯和環己醇兩峰面積之和為橫坐標，繪制標準曲線。在完全相同的條件下進樣1 μL經衍生化處理的試樣待測液上清液，保留時間定性，測得峰面積，根據標準曲線計算樣液中的甜蜜素濃度。

1.5.2 液相色譜法

分別吸取5 μL經衍生化處理的標準系列各濃度溶液上清液，注入液相色譜儀中，可測得不同濃度被測物的響應值峰面積，以濃度為橫坐標，以環己基氨基磺酸鈉衍生化產物N,N-二氯環己胺峰面為縱坐標，繪制標準曲線。在完全相同的條件下進樣5 μL經衍生化處理的試樣待測液上清液，保留時間定性，測得峰面積，根據標準曲線計算樣液中的甜蜜素濃度。

1.5.3 液相色譜-質譜/質譜法

1.5.3.1 定量測定

將配制好的標準工作溶液系列2按照濃度由低到高的順序進樣測定，以環己基氨基磺酸鈉定量離子的色譜峰面積對相應的濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。將試樣溶液注入液相色譜-質譜/質譜儀中，得到環己基氨基磺酸鈉定量離子峰面積，根據標準曲線計算試樣溶液中環己基氨基磺酸鈉的濃度。

1.5.3.2 定性測定

在相同的試驗條件下測定試樣溶液，若試樣溶液質量色譜圖中環己基氨基磺酸鈉的保留時間與標準溶液一致（變化范圍在±2.5%以內），且試樣定性離子的相對豐度與濃度相當的標準溶液中定性離子的相對豐度，其偏差不超過規定要求（相對豐度＞50 %，允許±20 %偏差；相對豐度＞20 %～50%，允許±25%偏差；相對豐度＞10%～20%，允許±30%偏差；相對豐度≤10%，允許±50%偏差），則可判定樣品中存在環己基氨基磺酸鈉。

2 結果與分析

2.1 液相色譜-質譜/質譜法優化

2.1.1 前處理方法改進

取酒樣1.0 g，加1 mL水，于60 ℃水浴上加熱30 min，殘渣全部轉移并定容至10 mL。這樣能將酒中的揮發成分徹底去除，降低本底干擾，提高甜蜜素質譜響應信號。

2.1.2 色譜條件優化

由于甜蜜素的負離子對178.0/79.9 m/z的響應信號特強，而正離子對202.2/122.1 m/z響應信號相對較弱，針對此特征，本文采用0.1%(v/v)甲酸水-甲醇體系為流動相，提高甜蜜素的正離子對的響應值，同時與國標法相比，流動相未引入銨鹽，降低了質譜系統損壞的風險。

2.1.3 方法的校準曲線和檢出限

按照本文液相色譜串聯質譜法優化的色譜條件，對甜蜜素標準工作溶液系列2進行測定，繪制標準曲線，結果表明，濃度在0.01～0.05 μg/mL范圍內有良好的線性關系，回歸方程y=4479180x+10749和相關系數R=0.9999；甜蜜素的負離子質譜響應信號遠大于正離子響應信號，以正離子模式信噪比為響應，計算方法檢出限更具有實際意義。圖1為標準曲線第一個濃度點0.01 μg/mL測得正離子模式下信噪比圖，以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限為0.01 mg/kg，以10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限為0.03 mg/kg。說明該方法的檢出限遠遠低于國標方法的檢出限，能滿足酒中微量甜蜜素的檢測要求。

圖1 正離子模型下的信噪比圖

2.1.4 方法的精密度和加標回收率

選取一市售白酒樣品，按3個濃度水平加入甜蜜素標準溶液，制備成加標樣品，分別對白酒樣品、白酒加標樣品進行測定，對每個添加水平重復測定6次，計算加標回收率和相對標準偏差，數據見表1。甜蜜素的MRM色譜圖見圖2。結果表明，酒樣中甜蜜素的加標回收率在90%～108%之間，相對標準偏差在0.69%～1.78%的范圍內，說明該方法準確、穩定、可靠。

2.2 液相色譜法分析結果

2.2.1 酒樣本底干擾試驗

將上述經液相色譜-質譜/質譜法測定無甜蜜素的白酒樣品，添加甜蜜素標準溶液制備成加標樣品（加標濃度100 mg/kg），按照液相色譜法分別對白酒樣品、白酒加標樣品及甜蜜素標液（100 μg/mL）進行測定，得到白酒樣品、白酒加標樣品及甜蜜素標液的色譜圖。對比白酒樣品色譜圖（圖3a）和白酒加標樣品色譜圖（圖3b）及甜蜜素標液色譜圖（圖3c）可以看出，白酒樣品在甜蜜素出峰時間點上未出現色譜峰，白酒加標樣品和甜蜜素標液均在甜蜜素出峰時間點上出現了色譜峰，說明液相色譜法測定白酒中甜蜜素無本底干擾。

表1 液相色譜-質譜/質譜法回收率及精密度測定結果(n=6)

圖2 白酒樣品、白酒加標樣品、甜蜜素標液的多反應監測（MRM）色譜圖

2.2.2 液相色譜法技術參數考察

按照本文液相色譜法，對甜蜜素標準工作溶液系列1進行測定，繪制標準曲線；以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限。同時將2.2.1中測得的加標樣品計算的回收率、精密度均列入表2中。由表2可知，液相色譜法的方法檢出限雖然不能滿足國家標準對白酒（蒸餾酒）的檢測要求，但完全滿足配制酒的檢測要求。然而液相色譜法存在不足之處，樣品衍生化時會產生有害物質，對操作者有潛在的危害。

2.3 氣相色譜法分析結果

2.3.1 國標氣相色譜法酒樣本底干擾試驗

表2 液相色譜法技術參數

將上述經液相色譜-質譜/質譜法測定無甜蜜素的白酒樣品，添加甜蜜素標準溶液制備成加標樣品（加標濃度20 mg/kg），按照國標氣相色譜法分別對白酒樣品、白酒加標樣品及甜蜜素標液（100 μg/mL）進行測定，得到白酒樣品、白酒加標樣品及甜蜜素標液的色譜圖。對比白酒樣品色譜圖（圖4a）和白酒加標樣品色譜圖（圖4b）及甜蜜素標液色譜圖（圖4c）可以看出，白酒樣品、白酒加標樣品和甜蜜素標液均在甜蜜素出峰時間點上出現了色譜峰，說明國標氣相色譜法測定白酒中甜蜜素有本底干擾。

2.3.2 改進氣相色譜法酒樣本底干擾試驗

按照改進氣相色譜法分別對上述白酒樣品、白酒加標樣品（加標濃度20 mg/kg）及甜蜜素標液（100 μg/mL）進行測定，得到白酒樣品、白酒加標樣品及甜蜜素標液的色譜圖。對比白酒樣品色譜圖（圖5a）和白酒加標樣品色譜圖（圖5b）及甜蜜素標液色譜圖（圖5c）可以看出，不含甜蜜素的白酒樣品在甜蜜素出峰時間點上未出色譜峰，白酒加標樣品和甜蜜素標液均在甜蜜素出峰時間點上出現了色譜峰，說明改進氣相色譜法測定白酒中甜蜜素無本底干擾。

圖4 白酒樣品、白酒加標樣品、甜蜜素標液國標法氣相色譜圖比較

圖5 白酒樣品、白酒加標樣品、甜蜜素標液改進法氣相色譜圖比較

2.3.3 改進氣相色譜法技術參數考察

按照本文改進氣相色譜法，對甜蜜素標準工作溶液系列1進行測定，繪制標準曲線；以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限。同時將2.3.2中測得的加標樣品計算的回收率、精密度均列入表3中。由表3可知，改進氣相色譜法的方法檢出限雖然不能滿足國家標準對白酒（蒸餾酒）的檢測要求，但完全滿足配制酒的檢測要求，而且方法技術參數均略優于液相色譜法，且對操作者無潛危害，實用性更好。

3 結論

通過比較分析3種國標方法測定白酒中甜蜜素含量，得出以下結論：優化的液相色譜-質譜/質譜法檢出限更低，方法準確、可靠，更適合于白酒（蒸餾酒）中微量甜蜜素的測定；液相色譜法檢出限滿足配制酒的檢測要求，但存在不足之處是樣品衍生化時會產生有害物質，對操作者有潛在的危害；國標氣相色譜法不能將酒中的干擾物分離，常出現甜蜜素假陽性結果，改進的氣相色譜法能有效地消除基質干擾，其檢出限、回收率及精密度均能滿足配制酒的檢測要求，而且方法技術參數均優于液相色譜法，且對操作者無潛危害，實用性更好。

表3 改進氣相色譜法技術參數