對(duì)基因芯片技術(shù)快速檢測水中常見致病菌相關(guān)思考

蔣鵬

摘要：本文首先采用試驗(yàn)的方式進(jìn)行分析靶基因的擴(kuò)增狀況，其次對(duì)于靶基因進(jìn)行討論，最后針對(duì)基因芯片技術(shù)快速檢測水中常見致病菌進(jìn)行了總結(jié)。

關(guān)鍵詞：基因芯片技術(shù);快速檢測;致病菌

1.材料與方法

1.1檢驗(yàn)靶基因的擴(kuò)增

通過以下幾種方式進(jìn)行檢驗(yàn)靶基因的擴(kuò)增：其一，待檢樣品為多年分離并保留的菌株，分別來自飲用水與地表水、游泳池誰以及各種生熟食品分離所獲得。細(xì)菌復(fù)蘇之后轉(zhuǎn)接入平皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，選擇生長在固體培養(yǎng)基上的菌落，進(jìn)行研磨與震蕩，并且混入100 純水中，進(jìn)行煮沸10min，10000r.min-1離心1min，汲取清液（DNA提取液）留以待用[1]。

其二，需要選擇多個(gè)PCR與引物增加的靶基因（引物沙門菌inva基因、引物志賀菌virA、細(xì)菌16S rDNA）。選擇正鏈的方式進(jìn)行增加產(chǎn)物，從而達(dá)到試驗(yàn)所需的效果。其中所需要的材料由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供。PCR反應(yīng)為50 的PCR反應(yīng)體制中，含有10×PCR緩沖液5 ，dNTP Mixture 200 ?mol· -1，TaKaRa Taq（5U·mL-1）0.02U· -1，都為TaKaRa商品。其中各個(gè)引物都為0.1 mol· -1，細(xì)菌DNA提取液2 。通過以上的試驗(yàn)的方式，從而獲得靶基因的擴(kuò)增的原因，從而有效的進(jìn)行控制管理。

1.2基因芯片

在試驗(yàn)中，需要靈活地運(yùn)用基因芯片技術(shù)進(jìn)行合理有效的試驗(yàn)，我們通過試驗(yàn)結(jié)構(gòu)，能夠采用檢驗(yàn)探針進(jìn)行確定細(xì)菌的種類，點(diǎn)陣分布見圖1。檢驗(yàn)探針分為五種類型：（1）陽性與探針相匹配，其主要作用為反應(yīng)雜交體制是否有效與作為掃描坐標(biāo)，包含26號(hào)探針;（2）細(xì)菌屬/種特異性探針，包含6～25號(hào)探針;（3）辨別革蘭陰性（ -）與革蘭陽性（ +）菌的探針;（4）細(xì)菌科特異性包含4號(hào)與5號(hào)探針和屬共有探針;（5）能夠全部真細(xì)菌進(jìn)行價(jià)值較，用于檢驗(yàn)全部真細(xì)菌，包含1號(hào)探針。結(jié)合五種類型的探針的雜交狀況能夠判斷待檢樣品中存在的細(xì)菌類型。采用表面固定的寡核苷酸探針陣列與化學(xué)處理之后的顯微鏡載玻片組成的基因芯片。

1.3雜交檢驗(yàn)

通過試驗(yàn)，我們能夠了解到，取出產(chǎn)物1 與雜交液4 進(jìn)行融合，加熱5min之后，迅速存放在冰面上，5min之后取出，放置在在探針陣列區(qū)域之內(nèi)，之后蓋上蓋玻片，在溫度50℃之間進(jìn)行雜交。之后分別選取洗脫液A（1XSSC +0.2% SDS），洗脫液B（0.1×SSC+0.2%SDS），洗脫液C（0.1XSSC）分別洗1min。選用ScanArray3000（GSI Lumonics）芯片閱讀儀，設(shè)置PMT與Laser強(qiáng)度通常為80%，并且采用Imagene4.0軟件針對(duì)結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的分析。在全面進(jìn)行分離菌株的鑒定過程中，同時(shí)需要鑒定形態(tài)學(xué)。

試驗(yàn)結(jié)果討論

選擇多個(gè)引物在統(tǒng)一的條件下進(jìn)行20株常見菌的靶基因的提升，提升之后需要在同一條件下進(jìn)行雜交，通過有關(guān)的儀器進(jìn)行掃描只會(huì)，獲得它們兩個(gè)自身的雜交圖譜。與此同時(shí)，需要對(duì)于不同類型的細(xì)菌所體現(xiàn)的各種情況，并且根據(jù)雜交圖譜，結(jié)合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行雜交圖譜之間的對(duì)比，進(jìn)行確定常見菌的類型。

圖2與圖3分別為1株沙門氏菌與銅綠假單胞菌的雜交圖譜。與圖1的基因芯片點(diǎn)陣分布相對(duì)比，能夠了解圖2中，除了36號(hào)（陽性對(duì)照）發(fā)生強(qiáng)雜交信號(hào)之外1、3、4/5好探針位置發(fā)生強(qiáng)的雜交信號(hào)點(diǎn)，能夠斷定樣品為 -菌、腸道菌、真細(xì)菌、沙門細(xì)菌。與上文所述相同，圖3中，不僅36號(hào)發(fā)出雜交信號(hào)，2/7/13號(hào)位置同時(shí)也發(fā)出了雜交信號(hào)，能夠準(zhǔn)確的對(duì)于常見菌進(jìn)行確定。以此類推，對(duì)于分離的20余株菌進(jìn)行了詳細(xì)的基因芯片檢測。非特異性雜交發(fā)出較若的雜交信號(hào)點(diǎn)，需要加強(qiáng)雜交以后，加深洗滌的強(qiáng)度，才能夠完美的進(jìn)行預(yù)防非特異性信號(hào)的產(chǎn)生。

對(duì)于20株分離菌株的基因芯片檢驗(yàn)結(jié)果與常見生化檢測結(jié)果進(jìn)行做對(duì)比，結(jié)果見表1，其中，19株通過與基因芯片的雜交被檢驗(yàn)出來，1株發(fā)生的雜交信號(hào)較弱以致憑借基因芯片不能夠分辨菌的種類;結(jié)合鑒定的結(jié)果被視為菌株鑒定的最終結(jié)論，將基因芯片的鑒定結(jié)果與最終結(jié)論想對(duì)比，能夠了解，除了第7號(hào)樣品之外，基因芯片的鑒定較為準(zhǔn)確，最終結(jié)論的符合率達(dá)到95%（19/20）[2]。

結(jié)論

綜合上文所述，現(xiàn)代化免疫學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)技術(shù)的角度來講，集運(yùn)芯片檢測技術(shù)最大限度的體現(xiàn)出高通能量以及效率快的優(yōu)點(diǎn)。一張芯片一次能夠?qū)λ锌赡艹霈F(xiàn)的常見致病菌進(jìn)行全方位、系統(tǒng)的監(jiān)測與鑒定，并且操作簡單、快速，針對(duì)一個(gè)未知的菌落，能夠在4h以內(nèi)完成菌的判斷。為盡快確定鑒別與診斷常見致病菌提供了一定程度上的技術(shù)手段，為今后的衛(wèi)生抽查工作給予了一定的幫助。

參考文獻(xiàn)

[1]李君文，晁福寰，靳連群， 等.基因芯片技術(shù)快速檢測水中常見致病菌[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2002，36（4）：238.

[2]靳連群，李君文，晁福寰， 等.基因芯片檢測腸道致病菌技術(shù)的建立和應(yīng)用[J].中華傳染病雜志，2004，22（1）：24-26.