枯草芽孢桿菌HS09產芽孢發酵培養基的優化

陳俊煌

摘?要：枯草芽孢桿菌HS09具備較好益生菌性能，已作為微生態菌劑應用于水產養殖業。為了提高菌株HS09產芽孢發酵水平，以芽孢產量為指標，通過單因素試驗及正交試驗對枯草芽孢桿菌HS09產芽孢發酵培養基的碳源、氮源進行篩選及優化，確定最佳發酵培養基。結果表明：影響枯草芽孢桿菌HS09芽孢產量的主次因素為玉米粉>硫酸銨>葡萄糖。枯草芽孢桿菌HS09產芽孢發酵優化培養基為葡萄糖10 g·L-1、硫酸銨8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、硫酸錳0.5 g·L-1、磷酸氫二鉀1 g·L-1 、磷酸二氫鉀2 g·L-1、碳酸鈣3 g·L-1;以最佳產孢發酵培養基進行200 L發酵罐放大發酵，發酵有效菌落數可達4.3×109 cfu·mL-1，實現芽孢90%高轉化率。該研究結果可為菌株工業化生產提供參考依據。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌;培養基;優化;正交試驗

中圖分類號：TQ920?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）10-0016-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.10.03

Abstract： Bacillus subtilis HS09 has good probiotic performance and has been used as a microbial agent in aquaculture industry. In order to improve the spore-producing fermentation level of the strain HS09， with the spore yield as the index， the carbon and nitrogen sources of the fermentation medium of spore produced by Bacillus subtilis HS09 were screened and optimized by single factor tests and orthogonal experiments to determine the best fermentation medium. The results showed that the primary and secondary factors affecting the spore yield of Bacillus subtilis HS09 were in order as follows： corn flour， ammonium sulfate and glucose. The optimized fermentation medium of spore produced by Bacillus subtilis HS09 was as follows： glucose 10 g·L-1， ammonium sulfate 8 g·L-1， corn flour 15 g·L-1， magnesium sulfate 0.5 g·L-1， manganese sulfate 0.5 g·L-1， dipotassium phosphate 1 g·L-1， monopotassium phosphate 2 g·L-1， and calcium carbonate 3 g·L-1. The optimal spore-producing fermentation medium was used for the amplified fermentation in 200 L fermentation tank， and the effective clump count of fermentation could reach 4.3×109 cfu·mL-1， achieving a high conversion rate of 90% of spore. The results of this study could provide reference for the industrial production of the strains.

Key words： Bacillus subtilis;Culture medium;Optimization;Orthogonal experiment

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis是芽孢桿菌屬的一種腐生細菌，由于發酵能夠產生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶等十幾種酶[1]，是重要的微生態益生菌。我國水產養殖業高速發展，但近年來水產養殖業在養殖密度和規模不斷擴大的同時，也面臨著日益嚴峻的食品安全問題。傳統的抗生素雖然在治療動物疾病、促進動物生長方面有明顯優勢，但其負面效應也日益突出，表現為病原微生物產生耐藥性、不易降解等缺點，從而危害人類健康。因此，抗生素替代品益生菌、酶制劑等產品成為綠色飼料添加劑的熱點[2-3]。微生態制劑作為抗生素的替代物之一，因其無毒副作用及不存在抗藥性等優點，在養殖業中具有廣闊的應用前景[4]?？莶菅挎邨U菌是飼用微生態制劑的常用菌種之一[5]，其對水產中的弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害微生物有很強的抑制作用，能夠有效預防水產動物腸炎、爛鰓等疾病;能夠分解養殖池中的有毒有害物質，凈化水質;同時具有較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，能夠促進飼料中營養素降解，使水產類動物對飼料的吸收利用更加充分;能夠減少對蝦病害發生，可以大大提高對蝦產量，從而提高經濟效益[6-8]。

為了便于運輸、保存及應用，芽孢桿菌型微生態制劑通常加工為芽孢菌粉?？莶菅挎邨U菌HS09具備較好的益生菌性能，常作為微生態菌劑應用于水產養殖業。為了提高產孢發酵水平，本研究進行枯草芽孢桿菌HS09培養基優化，以期降低生產成本，旨在為枯草芽孢桿菌微生態粉劑的工業化生產提供參考依據。

1?材料與方法

1.1?菌株

枯草芽孢桿菌HS09，由福建匯盛生物科技有限公司研發中心菌種室保藏。

1.2?培養基

（1）平皿培養基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.2。

（2）種子培養基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，水1000 mL，pH 7.2。

（3）碳源基礎發酵培養基：酵母粉8 g，豆粕粉20 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，磷酸二氫鉀2 g，碳酸鈣3 g，水1000 mL。

（4）氮源基礎發酵培養基：葡萄糖10 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，磷酸二氫鉀2 g，碳酸鈣3 g，水1000 mL。

1.3?試驗方法

1.3.1?搖瓶發酵培養?從活化到期的枯草芽孢桿菌HS09平皿挑取2個單菌落接入種子培養基（100 mL/500 mL三角瓶）中，置于37℃，180 r·min-1搖床中培養16 h，按照體積5%的接種量移入發酵培養基（500 mL/2000 mL三角瓶）中，置于37℃，200 r·min-1搖床中培養24 h。

1.3.2?碳氮源單因素優化?（1）培養基碳源篩選：在碳源基礎發酵培養基中，分別加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1，初始pH 6.8條件下發酵培養，考察不同碳源對枯草芽孢桿菌HS09發酵有效菌數及芽孢產量的影響。（2）培養基氮源篩選：在氮源基礎發酵培養基中，分別加入硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1，初始pH 6.8條件下發酵培養，考察不同單一氮源對枯草芽孢桿菌HS09發酵有效菌數及芽孢產量的影響。（3）復合氮源的優化：在單一氮源試驗結果的基礎上進行復合氮源配比試驗，復合氮源配比方案見表1，在初始pH值6.8條件下發酵培養，考察復合氮源對枯草芽孢桿菌HS09發酵有效菌數及芽孢產量的影響。

1.3.3?碳氮源正交優化?在碳氮源單因素優化基礎上，選擇葡萄糖、硫酸銨、玉米粉3個因素，設計L9（34）正交試驗優化，L9（34）正交試驗設計因素及水平見表2。

1.3.4?200 L發酵罐放大培養?從活化到期的枯草芽孢桿菌HS09平皿挑取8個單菌落接入種子培養基（500 mL/2000 mL三角瓶）中，置于37℃，200 r·min-1搖床中培養16 h，按照體積2%的接種量移入體積200 L發酵罐（裝液量120 L）中，溫度37℃，罐壓0.04 Mpa，初始pH值6.8，攪拌轉速和通氣量控制方案如表3，發酵過程pH自然，培養24 h。每2 h取樣檢測，觀察芽孢形成情況，當芽孢率達到90%即發酵完成，放罐。

1.3.5?發酵液菌數的測定?（1）發酵液有效菌落數（cfu·mL-1）測定：采用平板菌落計數法檢測細菌總數;（2）發酵液芽孢數量測定：發酵液經80℃水浴加熱15 min后，用稀釋倒平板法檢測芽孢的產量[9]。（3）發酵液芽孢率快速計算：采用血細胞計數板計算發酵液總菌數與芽孢數，芽孢數與總菌數的百分比，即發酵液芽孢率。

2?結果與分析

2.1?碳源對枯草芽孢桿菌HS09發酵的影響

在碳源基礎發酵培養基中，分別加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1，考察不同碳源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量的影響。從圖1可以看出，枯草芽孢桿菌對4種碳源都可以利用，但發酵后期菌體不易轉為芽孢。其中以葡萄糖作為碳源使用時，菌落總數最高，達到2.8×109 cfu·mL-1。因此，選擇葡萄糖作為枯草芽孢桿菌發酵的最優碳源。

2.2?氮源對枯草芽孢桿菌HS09發酵的影響

2.2.1?單一氮源優化?在氮源基礎發酵培養基中，分別加入硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1，考察不同氮源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量的影響。從圖2可以看出，枯草芽孢桿菌發酵培養基中使用單一氮源，菌落總數整體不高，但不同氮源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量有明顯區別。以豆粕粉作為氮源時，菌落總數最高;其中以硫酸銨和玉米粉作為氮源時芽孢轉化率最好，分別達到80%和90%。

2.2.2?復合氮源優化?根據單一氮源試驗結果，在氮源基礎發酵培養基上，按照表1所列試驗方案，對不同氮源進行復配，考察復合氮源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量的影響。從圖3可以看出，使用復合氮源明顯提高枯草芽孢桿菌菌落總數，其中以（硫酸銨10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1）和（硫酸銨5 g·L-1+豆粕粉5 g·L-1+玉米粉15 g·L-1）兩個組合菌落總數最高，均達到3.5×109 cfu·mL-1，芽孢轉化率分別為90%和75%。因此，選擇（硫酸銨10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1）作為復合氮源，進行下一步正交試驗。

2.3?正交試驗優化

2.3.1?碳氮源正交試驗優化?根據碳源、單一氮源、復合氮源試驗結果，選取葡萄糖濃度為5 、10、15 g·L-1，硫酸銨濃度為2、5、8 g·L-1，玉米粉濃度為10、15、20 g·L-1為試驗條件進行正交試驗。以芽孢產量為指標，確定最優配比。從表4結果可知，影響枯草芽孢桿菌芽孢產量的主次因素是C>B>A，即玉米粉>硫酸銨>葡萄糖。枯草芽孢桿菌產芽孢培養基中最佳碳、氮源配比為A2B3C2，即葡萄糖10 g·L-1、硫酸銨8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1。

2.3.2?驗證試驗結果?對2.3.1正交試驗設計組合7（A3B3C2）和最優方案A2B3C2二者進行搖瓶試驗驗證，試驗結果見表5。表5結果顯示，兩種方案芽孢產量相差不大，驗證了最優方案（A2B3C2）是可行的。

2.4?200 L發酵罐放大發酵培養

在搖瓶優化的基礎上，進行200 L發酵罐放大試驗。發酵罐裝液量120 L，溫度37℃，罐壓0.04 Mpa，初始pH 6.8，攪拌轉速和通氣量控制如表2，發酵過程自然pH，培養24 h。發酵過程中每2 h取樣檢測，記錄pH、OD600、芽孢轉化率，繪制發酵過程曲線，結果如圖4。

從圖4可見，在0～2 h枯草芽孢桿菌HS09處于適應期，菌液OD600值沒有增長。隨著發酵的進行，4 h開始OD600值快速增長，說明枯草芽孢桿菌HS09在4 h左右進入對數生長期，此時菌體大量繁殖，16 h后OD600值趨于穩定，枯草芽孢桿菌HS09菌體的生長進入穩定期。通過降低發酵通氣量和攪拌轉速，促進芽孢形成。芽孢在18 h左右開始形成，22 h芽孢大量形成，24 h芽孢轉化率達到90%。發酵過程中pH自然，0～4 h階段pH呈現先下降趨勢，這是由于菌體在繁殖過程中分解有機物產酸;隨后pH回升，這過程可能與氨基酸的降解產生銨根離子有關;6 h之后pH保持下降趨勢，菌體處于大量繁殖的對數生長期引起的快速產酸有關，但pH基本保持在5.9以上;16 h后pH呈快速上升趨勢，芽孢隨之快速形成。試驗驗證了申燁華等[10]對芽孢桿菌發酵工藝的研究結果：參與合成伴孢晶體的酶最適pH為6.5～7.5。最終，枯草芽孢桿菌HS09在200 L發酵罐培養的發酵液有效菌落數為4.3×109 cfu·mL-1，芽孢轉化率達到90%。發酵罐培養比搖瓶菌落數（3.4×109 cfu·mL-1）有較大提高，說明在發酵罐培養過程中體系溶氧更充足、更均勻，氧傳遞速度增加，促進菌體的大量積累。

3?結論與討論

芽孢桿菌型微生態制劑通常是加工為芽孢菌粉，芽孢菌粉比菌體粉具備更好的抗逆性，在干燥加工、運輸、保存過程損失較少，因此枯草芽孢菌發酵除了考察發酵的最終菌數，還必須考慮放罐前菌體能夠大部分轉化為芽孢。本研究結果表明，枯草芽孢桿菌HS09產芽孢培養基的組成對菌株的生長及芽孢形成有很大影響，尤其是培養基中的氮源。通過碳氮源的單因素試驗、復合試驗及正交優化，確定了枯草芽孢桿菌HS09產芽孢培養基的最佳碳源為葡萄糖（10 g·L-1）、最佳氮源為硫酸銨（8 g·L-1）與玉米粉（15 g·L-1）復合氮源。

在搖瓶優化的基礎上，進行200 L發酵罐放大試驗。發酵罐裝液量120 L，溫度37℃，罐壓0.04 Mpa，初始pH 6.8，在發酵前期增加通氣量及攪拌轉速，有利于提高菌體產量;在發酵對數生長期后期，通過逐步降低通氣量及攪拌轉速，以促進芽孢轉化。最適放罐時間24 h，發酵罐培養獲得有效活菌數為4.3×109 cfu·mL-1，芽孢率90%，比搖瓶培養有效活菌數（3.4×109 cfu·mL-1）有明顯提高，說明溶氧對枯草芽孢桿菌HS09的發酵培養有顯著的影響。在提高枯草芽孢桿菌HS09有效菌落數上，可通過后期罐上培養將進行流加營養補料試驗方案優化。枯草芽孢桿菌HS09具備較好益生菌性能，已作為微生態菌劑應用于水產養殖業。本研究結果可為枯草芽孢桿菌HS09工業化發酵提供了參考依據。

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（責任編輯：林玲娜）