凹線仙女蜆Cytb基因片段序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹初步構(gòu)建

徐其建 黃鎮(zhèn) 林崗

摘?要：初步探究凹線仙女蜆的系統(tǒng)發(fā)育地位，為凹線仙女蜆的分子遺傳學(xué)研究提供前期數(shù)據(jù)。采用PCR方法擴(kuò)增得到凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata線粒體細(xì)胞色素b（Cytb）基因片段序列，序列長(zhǎng)為624 bp，并在NCBI上使用NT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)分析，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，探討凹線仙女蜆的分類地位。結(jié)果顯示NT數(shù)據(jù)庫中未見凹線仙女蜆的Cytb基因信息。研究擴(kuò)增獲得的序列與蜆屬其他種的Cytb基因片段有88%的相似性，與其他簾蛤目貝類的相似度77.02%～78.53%，表明擴(kuò)增出的片段是凹線仙女蜆?biāo)赜械腃ytb基因片段?；贙imura′s 2-Parameter模型計(jì)算得出，3個(gè)樣本個(gè)體的遺傳距離僅為0～0.0016，遠(yuǎn)小于蜆屬內(nèi)種間遺傳距離（0.002～0.114），與蜆屬的遺傳距離為0.127～0.144、與簾蛤目簾蛤科種類遺傳距離為0.282～0.335。進(jìn)化樹顯示，凹線仙女蜆樣品獨(dú)立聚為一支，與蜆屬聚為一大支，支持度為99，表明仙女蜆屬與蜆屬的親緣關(guān)系較近，與簾蛤科的遺傳距離較遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞：凹線仙女蜆;Cytb基因片段;進(jìn)化樹;遺傳距離

中圖分類號(hào)：S917.4?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）10-0001-09

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.10.001

Abstract： The phylogenetic status of Cyrenobatissa subsulcata was preliminarily explored in this study to provide preliminary data for the molecular genetics research of Cyrenobatissa subsulcata. The PCR method was used to amplify the mitochondrial cytochrome b （Cytb） gene fragment sequence of Cyrenobatissa subsulcata. The sequence length was 624 bp. The Blast comparison analysis was performed on the NCBI by using the NT database to construct a phylogenetic tree and discuss the taxonomic status of Cyrenobatissa subsulcata. The results showed that there was no Cytb gene information of Cyrenobatissa subsulcata in the database. The sequence amplified in this study had 88% similarity with the Cytb gene fragments of other species of the Corbicula， and had 77.02%-78.53% similarity with other clam shellfish， indicating that the fragments amplified by PCR were from the Cytb gene fragment of Cyrenobatissa subsulcata. Based on Kimura′s 2-parameter model， the genetic distance between the three individuals of Cyrenobatissa subsulcata was only 0-0.0016， which was far less than that between the species in Corbicula （0.002-0.114） and with Corbicula was 0.127-0.144， and the genetic distance between the three individuals of Corbicula and the species of Veneridae was 0.282-0.335. The phylogenetic tree showed that the samples of Cyrenobatissa subsulcata were clustered into one branch independently and clustered with Corbicula into a large branch with a support degree of 99， which indicated that Cyrena was closely related to Corbicula， while had a long genetic distance from Veneridae.

Key words： Cyrenobatissa subsulcata;Cytb gene fragment;Phylogenetic tree;Genetic distance

凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata隸屬于軟體動(dòng)物門Mollusca、雙殼綱Bivalvia、異齒亞綱Heterodonta、簾蛤目Veneroida、蜆科Corbiculidae、仙女蜆屬Cyrenobatissa。凹線仙女蜆是中國(guó)的地方性物種，分布具有局限性，主要棲息于底質(zhì)為沙或沙泥的咸淡水交匯處，主要分布于廣東省（汕頭韓江、吳川鑒江）、廣西省（防城）、海南省（排港）和臺(tái)灣省（淡水、蘇澳、安平）[1]。蜆科種類在沿海河口半咸水區(qū)域也有較多分布，硬殼蜆屬的紅樹蜆Polymesoda erosa分布于中國(guó)、菲律賓等地區(qū)，我國(guó)主要分布于廣東省、廣西省、海南省、臺(tái)灣地區(qū)等[2];花蜆屬的花蜆Cyrenodonax formosana分布于河口砂質(zhì)區(qū)，產(chǎn)于我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)（淡水）、福建省（云霄）和廣西?。ǚ莱牵3];蜆屬的河蜆廣泛分布于江河、湖泊、溝渠及咸淡水交匯處等水域，在福建省的閩江、烏龍江地區(qū)有百年的養(yǎng)殖歷史，是河口底棲生物的重要組成部分和重要的經(jīng)濟(jì)貝類[4-5]。

凹線仙女蜆的研究主要在分類學(xué)和生態(tài)學(xué)[6]，對(duì)河蜆Corbicula fluminea等蜆科物種研究較多，包括生態(tài)特性、遺傳差異分析、生長(zhǎng)與繁殖等方面[7-9]。凹線仙女蜆是蜆科中個(gè)體最大的物種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。蜆的軟體部含有較低的脂肪、較高的蛋白質(zhì)，蜆肉酶解產(chǎn)物具有解酒護(hù)肝的功效，可食用也可作為天然調(diào)味品，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10]。由于過度捕撈等一系列對(duì)自然環(huán)境的不合理利用問題，造成河流生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)破壞、生物多樣性驟減和生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力下降，有些地區(qū)的蜆類已處于瀕危狀態(tài)，制約了蜆類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11-13]。因此，對(duì)凹線仙女蜆種質(zhì)資源的保護(hù)、利用研究已顯得十分緊迫。物種的分子鑒定是種質(zhì)資源研究的重要基礎(chǔ)，細(xì)胞色素b基因（Cytb）作為一種線粒體DNA分子標(biāo)記，其結(jié)構(gòu)和功能是線粒體DNA的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中了解最清楚的基因，已廣泛用于魁蚶Scapharca broughtonii、鰱Hypophthalmichthys molitrix、松江鱸Trachidermus fasciatus和河蜆Corbicula fluminea等水生物種的分子鑒定、種間變異程度和親緣關(guān)系、不同地理群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)等研究[14-19]，但目前尚未見凹線仙女蜆線粒體基因研究的相關(guān)報(bào)道。

本研究以分布于福州市長(zhǎng)樂區(qū)凹線仙女蜆群體為研究對(duì)象，對(duì)其Cytb基因片段進(jìn)行擴(kuò)增分析，探討Cytb基因片段作為凹線仙女蜆種類鑒定的分子標(biāo)記的可行性，可為凹線仙女蜆的遺傳多樣性、種質(zhì)資源研究提供基礎(chǔ)資料。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?凹線仙女蜆樣本信息?凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata個(gè)體全部取自福州市長(zhǎng)樂區(qū)文武砂鎮(zhèn)規(guī)劃中的濱海新區(qū)濕地公園（圖1）。

1.1.2?試驗(yàn)儀器?PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、Nanodrop分光光度計(jì)、體視熒光顯微鏡、電泳儀、解剖鏡。

1.1.3?試驗(yàn)試劑?蛋白酶K、Quick-DNA Universal Kit 試劑盒（Zymo Research生物科技公司）、瓊脂糖（Sigma-Aldrich）、引物（福州擎科生物技術(shù)有限公司合成）、 DNA marker（Thermo Scientific）、 PCR mixture（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?形態(tài)學(xué)性狀測(cè)定?從采集來的凹線仙女蜆中隨機(jī)挑選30個(gè)，將貝殼表面的水分吸干后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量仙女蜆的殼長(zhǎng)、殼高、殼寬，精確到0.01 mm。用電子天平測(cè)量活體的軟體重、殼重、總重精確到0.01 g。凹線仙女蜆的外部形態(tài)見圖2。

1.2.2?凹線仙女蜆基因組DNA的提取?采用Quick-DNA Universal Kit試劑盒提取基因片段，在所選的30個(gè)凹線仙女蜆中隨機(jī)挑選3個(gè)個(gè)體，分別提取，每個(gè)個(gè)體取0.1 g的肌肉組織放入EP管，剪碎后加入95 μL無菌水、95 μL Solid Tissue Buffer（blue）和10 μL蛋白酶K。將EP管放入55℃的水浴鍋中水浴1.5 h。當(dāng)組織溶解后，12000 r·min-1離心10 min，取上層液150 μL，移入新的EP管，加300 μL的Genomic Binding Buffer溶液混合均勻。混合液轉(zhuǎn)入Zymo-spin IIC-xl小管中，12000 r·min-1離心1 min，棄掉下管的液體。再加 400 μL的DNA pre-wash Buffer到小管，12000 r·min-1離心1 min。然后加700 μL的g-DNA wash Buffer液體到小管，12000 r·min-1速度下離心1 min，棄掉下管的液體。最后加入37 μL雙蒸水。12000 r·min-1離心1 min后得到DNA溶液，之后進(jìn)行電泳，并用Nanodrop測(cè)定DNA完整度和純度。

1.2.3?凹線仙女蜆Cytb基因片段的克隆和序列測(cè)定?Cytb基因引物設(shè)計(jì)參考Yamada等[20]，序列擴(kuò)增通用引物為CBF6（5′GCAAGCTTTTGATTCTGTTGTTCACATTG3′）和CBR6（5′GTAGGAATCCTACGCAAAATGAGAATAAGCG3′ ）。據(jù)梯度PCR確定最適溫度57℃，在此溫度下進(jìn)行PCR產(chǎn)物的大體系擴(kuò)增。PCR 100 μL體系如下：模板DNA 2 μL、上下游引物1 μL、2×PCR mixture 50 μL和無菌水46 μL。分別以3只凹線仙女蜆基因組DNA作模板，放入PCR儀擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 7 min，變性94℃ 1 min，復(fù)性57℃ 45 s，72℃延伸2 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸7 min。預(yù)期擴(kuò)增片段大小640 bp，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的凝膠電泳，選擇亮度完好、有特異性條帶的PCR產(chǎn)物送到尚亞生物公司測(cè)序。

1.3?數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel對(duì)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，計(jì)算變異系數(shù)。利用Mega7軟件將本研究得到的基因片段在NCBI上使用NT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)和序列信息分析。運(yùn)用Mega7軟件內(nèi)Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，并輔以人工校對(duì)，計(jì)算出凹線仙女蜆Cytb基因片段序列長(zhǎng)度以及堿基組成;通過Kimura′s 2-Parameter模型計(jì)算出凹線仙女蜆與蜆屬的其他種Cytb基因片段序列的遺傳距離;通過Maximum Likelihood方法對(duì)凹線仙女蜆Cytb基因片段進(jìn)行分子進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2?結(jié)果與分析

2.1?凹線仙女蜆形態(tài)學(xué)性狀分析

30個(gè)樣品各性狀表型統(tǒng)計(jì)量見表1。各性狀的變異系數(shù)差異較大，其中殼長(zhǎng)、殼高、殼寬形態(tài)性狀的相對(duì)較小，而軟體重、殼重和總重性狀的相對(duì)較大，其中軟體重的變異系數(shù)最大，為79.35%。

2.2?凹線仙女蜆Cytb基因片段分析

2.2.1?凹線仙女蜆基因組DNA的提取?電泳結(jié)果（圖3）顯示，獲得的DNA基因片段大小均在2000 bp以上。所提取的DNA大小完整，條帶清晰，說明試劑盒能夠有效地提取凹線仙女蜆DNA。進(jìn)一步對(duì)DNA的純度進(jìn)行檢測(cè)，濃度均在19 ng·μL-1左右，A260/280均在1.80左右。說明提取的DNA純度高，無RNA、蛋白質(zhì)污染，可以進(jìn)行下一步PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

2.2.2?凹線仙女蜆Cytb基因片段擴(kuò)增?用所設(shè)計(jì)的引物在57℃退火溫度下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，所擴(kuò)增的3個(gè)凹線仙女蜆Cytb基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小在640 bp左右，測(cè)定的序列峰圖完整，沒有重疊峰的出現(xiàn)，得到的PCR產(chǎn)物均為單一條帶，說明成功擴(kuò)增出凹線仙女蜆Cytb基因片段。將3個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得序列。

2.2.3?凹線仙女蜆Cytb基因片段比對(duì)分析?經(jīng)查詢，在NCBI數(shù)據(jù)庫尚無凹線仙女蜆Cytb基因序列。將測(cè)序得到的凹線仙女蜆Cytb基因片段序列在NCBI上使用NT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)及相似性檢索，得到100條比對(duì)信息，結(jié)果見表2。擴(kuò)增得到凹線仙女蜆的Cytb基因片段序列與蜆屬的河蜆、日本蜆、環(huán)紋蜆的Cytb基因片段比對(duì)的相似度在86.49%～88.25%;與簾蛤目貝類的相似度77.02%～78.53%;與凡氏費(fèi)氏繭蜂、雙斑蟳、三疣梭子蟹的Cytb基因片段比對(duì)的相似度在74.12%～74.55%，表明凹線仙女蜆Cytb基因片段序列區(qū)分度顯著。

2.2.4?凹線仙女蜆Cytb基因片段序列?經(jīng)測(cè)序獲得的3條Cytb基因序列中，最長(zhǎng)為663 bp，最短為640 bp。運(yùn)用Mega7軟件內(nèi)Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，并輔以人工校對(duì)，凹線仙女蜆Cytb基因片段的核酸序列為624 bp（圖5），該段序列共編碼208個(gè)氨基酸。從圖5可以看出，對(duì)3個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)，序列幾乎一致，只在1個(gè)堿基上存在突變。

2.2.5?凹線仙女蜆Cytb基因片段序列特征分析?運(yùn)用Mega7軟件內(nèi)Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，分析其中624 bp的序列，計(jì)算其堿基組成，結(jié)果（表3）表明：T（U）、C、A、G的平均堿基組成為45.3%、12.4%、21.5%、20.8%。保守位點(diǎn)623個(gè)（99.84%），變異位點(diǎn)1個(gè)（0.16%），顛換數(shù)為0。其中胸腺嘧啶的比例較高，胞嘧啶的比例偏低;堿基含量T>A>G>C，其中，A+T的含量（66.8%）大于C+G的含量（33.2%），符合線粒體DNA的特征。

2.2.6?凹線仙女蜆種群內(nèi)遺傳距離?通過Mega7軟件中的Kimura′s 2-Parameter模型計(jì)算試驗(yàn)樣品的Cytb基因片段序列的遺傳距離。結(jié)果如表4所示：凹線仙女蜆種群內(nèi)的遺傳距離在0～0.00160，平均遺傳距離為0.00053，說明種群內(nèi)差異小。

2.2.7?凹線仙女蜆與參比種的屬間遺傳距離?通過Kimura′s 2-Parameter模型計(jì)算出凹線仙女蜆與蜆屬的其他種Cytb基因片段序列的遺傳距離（表5）。3個(gè)樣品個(gè)體的平均遺傳距離為0.00053，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于蜆屬內(nèi)種間遺傳距離（0.002～0.114）、與蜆屬的遺傳距離為0.127～0.144、與簾蛤目的簾蛤科種類遺傳距離為0.282～0.335，表明仙女蜆屬與蜆屬能明確區(qū)分開，也表明采集的樣品為同一物種。

2.2.8?凹線仙女蜆的系統(tǒng)進(jìn)化樹?基于Maximum Likelihood 方法對(duì)Cytb基因片段序列進(jìn)行對(duì)比和分析，構(gòu)建了包括凹線仙女蜆在內(nèi)的8個(gè)雙殼類物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。結(jié)果顯示，凹線仙女蜆樣品獨(dú)立聚為一支，蜆屬的河蜆與環(huán)紋蜆聚集再與仙臺(tái)蜆聚類，最后與日本蜆聚集為一支。仙女蜆屬與蜆屬又聚為一大支，支持度為99，表明仙女蜆屬和蜆屬的親緣關(guān)系較近，與簾蛤科的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3?討論

環(huán)境因素是造成雙殼類動(dòng)物個(gè)體差異的主要因素之一。蜆科軟體動(dòng)物有因棲息地環(huán)境因素形成高度形態(tài)變異的特性，僅利用殼體形態(tài)特征劃分河蜆種類比較困難[21-27]?；贒NA分子標(biāo)記技術(shù)的物種分子鑒定可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)分類上存在的樣本量多、易形成誤差、不能分析基因?qū)哟蔚奈⒂^變化情況等缺點(diǎn)，有利于群體遺傳育種工作的研究，提高可靠性[28]。而線粒體DNA中Cytb基因分子標(biāo)記更被大量運(yùn)用在物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳學(xué)研究[29-31]。

凹線仙女蜆的殼長(zhǎng)、殼寬、殼高的變異系數(shù)差異較小，軟體重的變異系數(shù)最大。這與張俊杰等[32]報(bào)道紅樹蜆、王慶恒等[33]報(bào)道波紋巴非蛤的研究結(jié)果基本一致。

凹線仙女蜆Cytb基因片段A+T的含量為66.8%，明顯大于C+G的含量（33.2%），這一結(jié)果與李瑤瑤等[16]在雙殼貝類Cytb基因中觀察到的結(jié)果一致。凹線仙女蜆Cytb基因片段序列與蜆屬的河蜆、日本蜆、環(huán)紋蜆Cytb基因片段Blast比對(duì)結(jié)果，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明仙女蜆屬與蜆屬能明確區(qū)分開，也從分子水平上支持凹線仙女蜆為蜆科仙女蜆屬而異于蜆屬[34]。

保護(hù)優(yōu)質(zhì)的貝類種質(zhì)資源成為亟待解決的問題，本研究獲得的Cytb基因片段序列可用于凹線仙女蜆的分子鑒定，可為凹線仙女蜆的種質(zhì)資源研究、蜆科物種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的研究、凹線仙女蜆的生物資源保護(hù)和開發(fā)利用提供基礎(chǔ)資料。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）