舒正顆粒對2型糖尿病大鼠糖脂代謝異常PI3K/AKT信號通路的影響

陸梓華， 呂雄， 曹明滿， 畢建璐， 黃艷麗

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405；2.廣東省第二中醫院，廣東廣州 510095；3.廣州醫科大學附屬第二醫院番禺院區，廣東廣州 511400；4.珠海市第二中醫院，廣東珠海 519125）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為基礎的一種代謝性疾病，除有血糖的異常外，常伴有脂質代謝的紊亂。研究[1]證實，糖尿病顯著和持續的高血糖所造成的糖毒性以及脂毒性是引起或加重IR和胰島素分泌下降、胰島β細胞功能衰竭的原因。胰島素作用最重要的靶器官是肝臟，其主要通過促進糖原合成、增加葡萄糖攝取、減少葡萄糖輸出和糖異生等作用來調控血糖并維持血糖穩定。胰島素通過與胰島素受體相結合，可激活其下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路，再作用于肝臟等靶器官而發揮調節血糖的作用。PI3K/AKT信號通路異常，是2型糖尿病發生的基本機制[2]。舒正顆粒是第五批全國名老中醫藥學術經驗繼承工作導師呂雄教授創立的調節糖脂代謝紊亂的有效經驗方，前期臨床觀察表明舒正顆粒能有效調節糖尿病糖脂代謝異常狀態，改善微循環的灌注障礙[3-5]，但其機制有待進一步闡明。因此，本研究擬探討舒正顆粒對2型糖尿病大鼠肝臟PI3K/AKT信號通路的作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雌性大鼠70只7～8周齡，體質量200～220 g，為廣東醫學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002。于廣東省第二中醫院中藥藥理（毒理）實驗室分籠喂養，室溫18～25℃，相對濕度40%～70%，明暗交替12 h，自由飲水、采食。

1.2 藥物 舒正顆粒，由生曬參、白術、茯苓、桃仁、布渣葉、麥冬等11味中藥組成，廣東省第二中醫院制劑室生產，批號：粵20071356；鹽酸二甲雙胍片，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產，批準文號：國藥準字H20023370，規格：0.5 g/片。

1.3 主要試劑與儀器 空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（中生北控生物科技有限公司）；HbA1c試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；10%水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠）；β-actin抗體、胰島素受體底物2（IRS2）抗體、PI3K抗體、AKT2抗體（英國Abcam公司）；叉頭框蛋白O1（FoxO1）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；PierceTMBCA蛋白分析試劑盒（500 mL）、ECL發光檢測試劑盒、RNA反轉錄試劑盒、定量DNA PCR試劑盒（美國Thermo公司）。IQTM5型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon 5200 Multi多功能成像系統（上海天能科技有限公司）；PowerPac Basic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；JJ3000動物電子稱（美國G&G公司）；Bio-Rad680酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Milli QPlus超級純水儀（美國Millipore公司）。

1.4 分組與造模方法 大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組（10只）與造模組（60只）。正常組以普通飼料喂養。造模組大鼠以高脂飼料（按質量分數配比：豬油20%、蔗糖5%、果糖5%、膽固醇5%、thyreostat 1%、鹽6%、味精1%、丙二醇30%、吐溫80 20%）喂養2周后，空腹單次腹腔注射STZ（30 mg/kg），檢測大鼠尾靜脈血，以隨機血糖≥16.7 mmol/L判斷2型糖尿病模型復制成功。再繼續高脂喂養6周[6-7]以維持、強化胰島素抵抗狀態，并使血脂進一步紊亂。造模共8周，其中10只大鼠造模失敗。將造模成功的50只大鼠隨機分為5組，即模型組，二甲雙胍組，舒正顆粒高、中、低劑量組，每組10只。

1.5 給藥 造模結束后，舒正顆粒高、中、低劑量組給予舒正顆粒灌胃（劑量分別為5.40、2.70、1.35 g·kg-1·d-1）。二甲雙胍組給予二甲雙胍（劑量為1.80 g·kg-1·d-1）灌胃。正常組與模型組給予等容積蒸餾水，并始終以脂肪乳灌胃。藥物干預4周。給藥劑量參考人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表[8]和《實驗動物學》[9]制定。

1.6 檢測指標及方法[10]

1.6.1 生化指標 FPG檢測采用葡萄糖氧化酶法；FINS、HbA1c檢測采用酶聯免疫吸附分析（ELISA）；TC含量檢測采用膽固醇氧化酶—過氧化物酶偶聯（COD-PAP）法；TG含量檢測采用甘油磷酸氧化酶—過氧化物酶（GPO-PAP）法；HDL-C檢測采用過氧化氫酶清除法；LDL-C檢測采用表面活性劑清除法。

1.6.2 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量 操作步驟：稱取每只大鼠肝臟組織10 mg，每組共100 mg作為一個樣品，每個樣品每個目的蛋白重復試驗4次。往各蛋白樣品加入1 mL含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解后提取總蛋白，并按照BCA試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度，根據所測定的蛋白濃度決定上樣量。依次按配膠、電泳、轉膜、封閉的順序，使提取的蛋白與目的蛋白抗體結合并免疫雜交，最后將雜交產物條帶放入Tanon 5200 Multi成像系統中進行顯影成像。計算目標蛋白的相對表達量：分析目的蛋白條帶灰度值，并以β-actin條帶灰度值為參考，計算目標蛋白灰度值/內參灰度值（p）。

1.6.3 實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）法檢測肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA相對表達量 操作步驟：（1）稱取每只大鼠肝臟組織100 mg，加入1 mLTrizol裂解液，冰上充分研磨勻漿，經氯仿、體積分數75%乙醇清除雜質后提取總RNA，測定吸光度（D）（260 nm）/D（280 nm）比值，計算RNA的濃度和純度。（2）逆轉錄成cDNA。按照總RNA 1μg，Olig（odT）15 1μL，隨機引物1μL，ddH2O加至12μL。繼而5×逆轉錄Buffer 4μL，M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL，10 mMdNTPMix 2μL，ddH2O 1μL配制總體積為20μL的反應體系進行逆轉錄。（3）PCR擴增。基因的引物由美國invitrogen公司設計提供（見表1）。按照 Template（cDNA）1 μL、MaximaTMSYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）12.5 μL、Former primer 1μL，Rear primer 1μL，dd H2O 9.5μL，總體積為25μL的擴增體系進行PCR擴增，循環條件：94℃×5 min；94℃×30 s→55℃×30 s→72℃ × 50 s（45個循環）；72℃ × 7 min。（4）采用2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達量，計算公式為：F=2-（[待測組目的基因平均Ct值-待測組內參基因平均Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值-對照組內參基因平均Ct值）]。

表1 PCR基因引物信息Table 1 Data of PCR gene premier

1.7 統計方法 應用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，所有數據以均數±標準差(-x±s)表示。符合正態分布資料，組間比較采用方差分析，總體均值統計先進行Levene's方差齊性檢驗，方差齊時采用SNK法，方差不齊則采用Dunnett T3檢驗法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 舒正顆粒對糖尿病大鼠FPG、HbA1c、FINS水平的影響 見表2。與正常組比較，模型組大鼠FPG、HbA1c、FINS水平均顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較，舒正顆粒各劑量組及二甲雙胍組大鼠FPG、HbA1c、FINS水平均顯著降低（P＜0.05）；與二甲雙胍組比較，舒正顆粒高劑量組大鼠FPG、HbA1c、FINS水平差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 舒正顆粒對糖尿病大鼠血脂水平的影響 見表3。與正常組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-C水平均顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，舒正顆粒各劑量組及二甲雙胍組大鼠TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.01），且舒正顆粒中、高劑量組調節血脂的作用優于二甲雙胍組（P＜0.01）。

表2 舒正顆粒對T2DM大鼠FPG、HbA1c、FINS水平的影響Table 2 The effects of Shuzheng Granules on the levels of FPG，HbA1c，FINS in T2DM rats (-x±s)

表3 舒正顆粒對T2DM大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響Table 3 The effects of Shuzheng Granules on the levels of TC，TG，LDL-C，HDL-C in T2DM rats[-x±s，c/（mmol·L-1）]

2.3 舒正顆粒對T2DM大鼠肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA相對表達量的影響 見表4。與正常組比較，模型組肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），FoxO1 mRNA表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，舒正顆粒高劑量組及二甲雙胍組的IRS2、PI3K、AKT2 mRNA表達均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），FoxO1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），舒正顆粒中、低劑量組AKT2 mRNA表達升高，FoxO1 mRNA表達降低（P ＜0.01），IRS2、PI3K mRNA表達亦升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與二甲雙胍組比較，除舒正顆粒中、低劑量組IRS2、PI3K mRNA表達差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）外，舒正顆粒高、中、低劑量組的IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 舒正顆粒對T2DM大鼠肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量的影響 見表5、圖1。與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），FoxO1蛋白含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，舒正顆粒高劑量組及二甲雙胍組的IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量均顯著升高（P＜0.05），FoxO1蛋白含量顯著降低（P＜0.05），舒正顆粒中劑量組IRS2、AKT2蛋白含量升高（P＜0.05），PI3K、FoxO1蛋白含量降低，但差異不顯著（P＞0.05），舒正顆粒低劑量組AKT2蛋白含量升高（P＜0.05），IRS2、PI3K、FoxO1蛋白含量降低，但差異不顯著（P＞0.05）；與二甲雙胍組比較，舒正顆粒高劑量組IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量表達無統計學差異（P＞0.05），舒正顆粒中劑量組IRS2蛋白含量表達無統計學差異（P＞0.05），PI3K、AKT2蛋白含量表達降低（P＜0.05），FoxO1蛋白含量表達升高（P＜0.01），舒正顆粒低劑量組IRS2、PI3K、AKT2蛋白含量表達均顯著降低（P＜0.05），FoxO1蛋白含量升高（P ＜ 0.01）。

表4 舒正顆粒對T2DM大鼠IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1 mRNA表達的影響Table 4 The effects of Shuzheng Granules on the mRNA expression levels of IRS2，PI3K，AKT2，FoxO1 in T2DM rats （-x±s，p）

表5 舒正顆粒對T2DM大鼠IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白含量的影響Table 5 The effects of Shuzheng Granules on the protein contents of IRS2，PI3K，AKT2，FoxO1 in T2DM rats (-x±s)

圖1 β-actin、IRS2、PI3K、AKT2、FoxO1蛋白Western blot條帶圖Figure 1 Western blot strips ofβ-actin，IRS2，PI3K，AKT2，FoxO1 proteins

3 討論

T2DM屬中醫“消渴病”范疇。呂雄教授[11]結合中醫理論及其臨床經驗，認識到對消渴病的認識不應局限于陰虛燥熱、三消辨證，而獨創氣血肝脾理論，提出脾損致消、肝郁致消、濁毒瘀滯等觀點，認為消渴病為本虛標實之證，以脾氣虧虛為本，濁毒瘀滯為標，治療應以扶正祛邪為則，益氣化濁、祛瘀通絡為大法。舒正顆粒由生曬參、茯苓、白術、澤瀉、川芎、桃仁、丹參、麥冬、布渣葉、薤白、決明子等藥物組成。方中君藥生曬參益氣健脾，扶正祛邪，治病以求本，臣以白術、茯苓、澤瀉燥濕健脾，健脾寧心，與君藥合用，實為取四君子湯之益氣補虛之意；丹參、川芎、桃仁行氣活血，化瘀通絡，布渣葉、決明子化濁消滯，清熱利濕，再加薤白通陽散結，麥冬養陰清熱，以制約生曬參、川芎、薤白之燥熱。諸藥用之，共奏益氣化濁、祛瘀通絡之功。

PI3K/AKT信號通路是胰島素的主要下游分子通路，與細胞生長、分化、增殖、凋亡及葡萄糖轉運密切相關，該通路異常是胰島素抵抗和2型糖尿病發生的基本機制[2]。IRS2是維持胰島β細胞功能的重要信號蛋白，胰島素與胰島素受體結合后，會導致其自身的磷酸化并使IRS2酪氨酸位點磷酸化。磷酸化的IRS2酪氨酸殘基與PI3K的調節亞基p85結合，進而激活下游的PI3K。活化的PI3K將磷脂酰肌醇一磷酸轉化為磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，并作為其第二信使激活AKT。活化的AKT同時可以使FoxO1磷酸化并繼而失活，降低糖異生基因G6P及PEPCK水平，從而減少糖異生，最終使血糖降低[12-13]。

本研究結果顯示，舒正顆粒能顯著降低2型糖尿病大鼠FPG、HbA1c、FINS、TC、TG、LDL-C，并使HDL-C明顯上升，說明舒正顆粒可以改善糖尿病糖脂代謝異常狀態。與模型組比較，二甲雙胍組、舒正顆粒高劑量組IRS2的蛋白含量及mRNA的表達均升高，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能上調糖尿病大鼠IRS2的表達，從而發揮改善胰島素分泌及胰島素抵抗的作用，與黃琦等[14]得出的二甲雙胍能上調糖尿病大鼠肝臟IRS2結果相符。與二甲雙胍組比較，舒正顆粒高劑量組上調糖尿病大鼠IRS2表達無差異，考慮舒正顆粒對IRS2的影響與二甲雙胍效果相似；且舒正顆粒中、低劑量組IRS2表達與二甲雙胍組有差異，考慮舒正顆粒對IRS2影響呈一定的劑量依賴性。與模型組比較，二甲雙胍組、舒正顆粒高劑量組PI3K表達均升高，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能上調糖尿病大鼠PI3K的表達，與程靜等[15]提出的二甲雙胍能夠增加肝臟組織PI3K表達的結論相符，且二甲雙胍組與舒正顆粒高劑量組調節PI3K表達效果無統計學差異，考慮舒正顆粒對PI3K的作用與二甲雙胍效果相似。與模型組比較，二甲雙胍組，舒正顆粒高、中、低劑量組AKT2表達均升高，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能上調糖尿病大鼠AKT2的表達，與李建中[16]研究顯示的二甲雙胍能上調大鼠AKT2蛋白含量的結果相符，且舒正顆粒高劑量組與二甲雙胍組結果無統計學差異，考慮舒正顆粒對糖尿病大鼠肝臟AKT2的作用與二甲雙胍相似；舒正顆粒中、低劑量組與二甲雙胍組比較具有統計學差異，說明舒正顆粒作用于大鼠肝臟AKT2需要達到一定劑量濃度效果才更佳。與模型組比較，二甲雙胍組，舒正顆粒高、中、低劑量組大鼠肝臟FoxO1 mRNA表達顯著降低，二甲雙胍組、舒正顆粒高劑量組FoxO1蛋白表達降低，說明二甲雙胍和舒正顆粒均能下調糖尿病大鼠FoxO1的表達，與劉桐言[17]提出的二甲雙胍能抑制FoxO1表達的結論相符；且舒正顆粒高劑量組與二甲雙胍組無統計學差異，考慮舒正顆粒對FoxO1的抑制作用與二甲雙胍相似。

綜上所述，舒正顆粒能提高2型糖尿病大鼠肝臟PI3K/AKT信號通路相關蛋白的活性，有效改善糖尿病大鼠糖脂代謝異常狀態，其效果呈一定的劑量依賴性。