菟絲子—黃芪治療骨質(zhì)疏松癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機制研究

黃紅， 林燕平， 黃佳純， 黃宏興

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東廣州 510375）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種與年齡相關(guān)的常見病，其特征是骨量降低、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞，易致骨脆性增加及骨折風(fēng)險增加[1]。預(yù)計到2050年，全世界60歲及以上的老年人口數(shù)將會從2000年的6億增加到20億[2]。隨著世界人口老齡化的加速，OP已成為人類社會的“公敵”。OP及其相關(guān)疾病（諸如骨質(zhì)疏松性骨折、肌少癥、糖尿病、高血壓等）不僅嚴重影響老年人群的生存質(zhì)量，而且也給社會帶來沉重的經(jīng)濟和醫(yī)療負擔。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療OP主要應(yīng)用骨健康基本補充劑、骨吸收抑制劑及促進骨形成劑等[3]，但由于西藥不良反應(yīng)多、價格昂貴、患者年齡大、基礎(chǔ)疾病多等因素，患者依從性差，沒有長期用藥，治療作用有限。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找安全、有效、價廉、不良反應(yīng)少的中藥治療OP成為當前研究的熱點[4-6]。

菟絲子—黃芪常見于治療OP的方劑中[7-9]，具有補腎健脾益氣的作用。多項研究表明，菟絲子黃酮可能通過抑制成骨細胞凋亡抗OP[10-12]，黃芪多糖、黃芪甲苷可能通過多種機制抗OP[13-16]。但中藥所含成分復(fù)雜，作用靶點廣泛，這些研究僅側(cè)重于某一成分研究，不能全面評價中藥多成分的作用機制。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論[17]，整合中藥、中藥活性成分、中藥靶標及疾病靶標等信息，構(gòu)建中藥—成分—疾病—靶標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可為全面研究中藥治療OP的作用機制提供理論基礎(chǔ)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論及方法，對菟絲子—黃芪治療OP的作用機制進行探討，以期為進一步的實驗研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菟絲子—黃芪的有效成分及靶標篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP）是一個提供藥物、疾病和靶標之間關(guān)系的數(shù)據(jù)庫[18]，該數(shù)據(jù)庫為中藥有效成分作用機制的研究提供了平臺。首先檢索TCMSP平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲得菟絲子—黃芪的有效成分，其中檢索條件[19]為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%，藥物類藥性（drug likeness，DL）≥ 0.18。然后應(yīng)用Perl軟件（V5.26.3）和UniProt知識庫（https：//www.uniprot.org/）為篩選出的靶標添加基因名。

1.2 OP相關(guān)靶標的獲取 以“osteoporosis”為關(guān)鍵詞，檢索并篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//genealacart.genecards.org/）的疾病相關(guān)靶標，得到OP相關(guān)靶標。

1.3 中藥—疾病靶標的構(gòu)建 利用R語言軟件（V3.5.3）將OP相關(guān)靶標映射到菟絲子—黃芪靶標，得到中藥—疾病共同靶標的韋恩圖，從中得到中藥—疾病靶標。

1.4 中藥—成分—疾病—靶標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將“1.1”項獲得的菟絲子—黃芪靶標和“1.3”項獲得的中藥—疾病靶標利用Perl軟件進行一一映射，然后利用Cytoscape軟件（V3.7.1）進行計算，得到中藥—成分—疾病—靶標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中節(jié)點的類型有中藥、成分、疾病和中藥—疾病靶標。

1.5 中藥—疾病靶標蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建與核心靶標的篩選 應(yīng)用STRING在線軟件（https：//string-db.org/）將中藥—疾病靶標輸入軟件，篩選條件為種屬選擇“Homo sapiens”，最小互作分數(shù)值為0.4，保存相應(yīng)結(jié)果文件。將所得文件輸入R語言計算，得到PPI核心靶標的條圖。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將中藥—疾病靶標利用R語言軟件計算，得到基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菟絲子—黃芪有效成分的篩選和靶標預(yù)測結(jié)果 根據(jù)篩選條件：OB≥30%，DL≥0.18，檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中菟絲子—黃芪所有已報道的有效成分及其相關(guān)靶標，排除在UniProt知識庫中找不到對應(yīng)基因名的靶標，共獲得有效成分21個，有效成分對應(yīng)的靶標196個。見表1。

表1 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對菟絲子—黃芪所有成分根據(jù)OB和DL參數(shù)進行篩選后的結(jié)果Table 1 The results of screening all ingredients of Herba Cuscutae-Radix Astragaliby OB and DL parameters in TCMSP database

2.2 中藥—疾病靶標構(gòu)建的結(jié)果 利用R語言軟件將OP相關(guān)靶標與菟絲子、黃芪靶標取交集，得到中藥—疾病共同靶標的韋恩圖，從中得到中藥—疾病靶標127個。其中OP疾病相關(guān)靶標3 126個，菟絲子靶標102個，黃芪靶標94個。見圖1。

2.3 中藥—成分—疾病—靶標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的結(jié)果 圖中紅色代表OP，藍色代表中藥菟絲子—黃芪，綠色代表菟絲子—黃芪的有效成分，黃色代表中藥—疾病共同靶標。中藥菟絲子—黃芪含有的21種有效成分主要通過127個靶標來影響OP的發(fā)生。其中，作用最明顯的2種成分是槲皮素（quercetin）和山柰酚（kaempferol）。見圖2。

圖1 中藥—疾病靶標Figure 1 TCM-disease targets

圖2 中藥—成分—疾病—靶標調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The regulatory network of TCM-ingredientdisease-target

2.4 中藥—疾病靶標PPI構(gòu)建與核心靶標篩選的結(jié)果 據(jù)圖4可知，中藥—疾病核心基因按鄰接節(jié)點數(shù)目由多到少依次為IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、AR、FOS、ERBB2、 PPARG、 RELA、 PGR、 CAV1、 AHR、HIF1A、CD44、ICAM1、VCAM1、CASP9、PLAU、RB1、CCNB1、CYP3A4、ESR2、IGFBP3、IGF2、NFKBIA、NQO1。鄰接節(jié)點數(shù)目越多，成為核心基因的概率越大。見圖3、4。

2.5 GO功能富集分析 菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標的GO功能富集分析結(jié)果見圖5。菟絲子—黃芪治療OP的核心基因的GO功能主要涉及轉(zhuǎn)錄激活活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、輔因子結(jié)合活性、核受體活性、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、類固醇結(jié)合等。

圖3 中藥—疾病靶標蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 3 TCM-disease target protein protein interaction（PPI）network

圖4 中藥—疾病核心靶標的條圖Figure 4 Barplot of TCM-disease core target

2.6 KEGG通路富集分析 菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標的KEGG通路富集分析結(jié)果見圖6。菟絲子—黃芪治療OP的核心基因的KEGG通路主要涉及：前列腺癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥的晚期糖基化終末產(chǎn)物—晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號通路、結(jié)直腸癌信號通路、乙肝信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、小細胞肺癌信號通路、EB病毒感染信號通路、內(nèi)分泌失調(diào)信號通路、催乳素信號通路、細胞凋亡信號通路、麻疹信號通路、胰腺癌信號通路、乳腺癌信號通路等。

圖5 GO功能富集分析氣泡圖Figure 5 Dotplot for GO functional enrichment analysis

綜合有關(guān)OP信號通路的文獻研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌信號通路[20-22]、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路[23]、動脈粥樣硬化信號通路[24-28]、結(jié)直腸癌信號通路[29-30]、乙肝信號通路[31-32]、TNF信號通路[33-35]、小細胞肺癌信號通路[36]、內(nèi)分泌失調(diào)信號通路、細胞凋亡信號通路[37-39]、乳腺癌信號通路[40-41]等均參與OP的發(fā)病。

圖6 KEGG通路富集分析柱狀圖Figure 6 Barplot for KEGG pathway enrichment analysis

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論，通過構(gòu)建“中藥—成分—疾病—靶標”網(wǎng)絡(luò)圖，并對中藥—疾病靶標進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，表明中藥菟絲子—黃芪含有的21種有效成分主要通過127個靶標來影響OP的發(fā)生。中藥菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標主要有IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、MYC、ESR1、CCND1、 AR、 FOS、 ERBB2、 PPARG、 RELA、PGR、 CAV1、 AHR、 HIF1A、 CD44、 ICAM1、VCAM1等，這些靶標可能通過影響轉(zhuǎn)錄激活活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、輔因子結(jié)合活性、核受體活性、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、類固醇結(jié)合等參與OP的發(fā)生。

中藥菟絲子—黃芪治療OP的核心靶標涉及的通路包括前列腺癌信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、動脈粥樣硬化信號通路、結(jié)直腸癌信號通路、乙肝信號通路、TNF信號通路、小細胞肺癌信號通路、內(nèi)分泌失調(diào)信號通路、細胞凋亡信號通路、乳腺癌信號通路等。劉流等[42]對前列腺癌患者行去勢術(shù)，觀察前列腺癌去勢術(shù)與OP的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)前列腺癌去勢術(shù)后血清睪酮的急劇下降與OP的發(fā)病明顯相關(guān)，表明前列腺癌與OP的發(fā)生有關(guān)。大量流行病學(xué)研究[25]表明，OP與動脈粥樣硬化性疾病具有密切的聯(lián)系，二者可能存在共同的發(fā)病機制，例如存在于脈管中的骨代謝標志物（骨鈣素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、骨橋蛋白和骨保護素）可能引起動脈粥樣硬化，而引起動脈粥樣硬化的炎性因子（NF-κB和一氧化氮）具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用。左輝[29]對結(jié)直腸癌合并幽門螺桿菌感染患者檢測血中1型膠原氨基端前肽（PINP）、1型膠原羧基端肽β特殊序列（β-CTX）的水平，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者血中PINP和β-CTX低表達，OP發(fā)病風(fēng)險增加。以上研究從不同的發(fā)病機制說明OP與多種疾病的發(fā)病相關(guān)，多種疾病可以通過多種信號通路影響OP的發(fā)病。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法全面系統(tǒng)分析了中藥菟絲子—黃芪治療OP的作用機制，中藥菟絲子—黃芪通過調(diào)控OP相關(guān)的基因，OP相關(guān)的基因在機體內(nèi)外環(huán)境的綜合影響下表現(xiàn)出相應(yīng)的表型，即發(fā)病或不發(fā)病。本研究為中藥菟絲子—黃芪治療OP的有效成分及靶標的篩選提供了理論依據(jù)，但仍需結(jié)合體內(nèi)外實驗進一步驗證有效成分及靶標的作用機制，以期提高中藥藥效，促進中藥現(xiàn)代化發(fā)展。