微生物酵素的研究進展

高慶超，常應九，馬蓉，鄒瀟瀟，曹效海，2，王樹林，2，*

（1.青海大學農牧學院，青海西寧810016；2.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海西寧810016）

1985 年，由世界酵素之父、美國醫學博士愛德華·豪威爾教授最早提出“酵素營養學理論”，酵素的發現也被公認為是人類生命科學領域的重大里程碑[1]。微生物酵素產品主要盛行于日本、美國、一些歐洲國家及東南亞地區，且形成了品牌產業規模，而近十多年來，在中國也開始盛行起來，越來越多的酵素理念被引入到農業、食品、美容保健等領域[2-3]。

酵素是以乳酸菌、酵母菌等多菌種發酵果蔬、菌菇或中草藥等，形成富含礦物質、氨基酸、多種酶及乳酸、醋酸和少量乙醇等代謝產物的液態和固態食品[4-5]。酵素的舊稱是“酶”，但其不只是酶，還包含了產酶微生物及其相互作用的代謝產物，屬于一個微生態整體[6]，其中包括微生物與微生物、微生物與底物及底物與底物之間的相互作用，不僅保留了發酵原料中原有的營養物質，而且通過微生物發酵代謝產生了新的生物活性成分[7]。這些物質能夠通過影響機體內的酶來調節細胞層面的生命活動，將大分子物質催化分解成小分子物質，比如多糖轉化為葡萄糖、蛋白質分解成氨基酸、脂肪分解成脂肪酸，從而被機體細胞吸收利用來維持機體功能、組織修復、食物消化等生命活動[8]。正因為如此，使得酵素富含多種營養物質，比如總酚、各種酶、低聚糖、有機酸、氨基酸、脂肪酸及礦物質等，還具有多種生物活性功能。

近年來，酵素類產品因其在日本等地的風靡，而受到我國消費者的青睞，酵素食品的多種功能特性使得其在功能性食品開發領域具有一定的應用前景，受到諸多科研學者的關注。本文就微生物酵素的生產工藝、主要微生物、相關代謝物質及生物活性等相關研究展開綜述，期望能對今后功能性微生物酵素食品的開發研究提供參考。

1 微生物酵素的工藝研究

由于酵素產品非常受歡迎，而且我國酵素產品的產業發展剛剛起步，針對不同原料酵素產品的發酵配方及工藝條件優化的相關研究也相繼報道出來。對于酵素發酵工藝條件的優化研究相對較多，比如李世燕等[9]研究發現同時接種酵母菌和乳酸菌發酵的毛酸漿酵素的抗氧化性最好，還原力、DPPH 自由基清除能力和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）分別高達 1.051、30.97%、409.52 U/mL。張旭普[10]通過響應面法對糙米酵素發酵工藝進行了優化，以總抗氧化、還原糖消耗量、SOD 酶和還原型谷胱甘肽為指標，篩選出4 種最佳發酵工藝條件。董潔[11]通過采用酵母菌和乳酸菌發酵金絲小棗制備金絲小棗酵素，得到最佳菌種添加量為酵母菌（0.1%）和乳酸菌（0.5%）。戰偉偉等[12]通過單因素試驗與正交設計篩選出藍靛果椰子復合酵素的最佳發酵工藝為發酵溫度為33 ℃，發酵時間為70 d，酵母菌與雙歧桿菌質量比為2 ∶1，藍靛果果漿與椰子果漿質量比為5 ∶1。郭俊花等[13]對蘋果皮渣酵素發酵工藝進行了優化，得到最佳發酵工藝條件：蘋果皮渣添加量400 g/L、加糖量90 g/L、初始pH 值5.5、發酵時間150 d，在此條件下，各項營養物質含量指標為最佳。李豆[14]利用11 種水果發酵制備水果酵素，通過單因素試驗與正交設計確定最佳菌種比為1.0%雙歧桿菌、1.0%葡萄酒酵母菌和1.5%嗜熱鏈球菌。葛朋燁[15]對沙棘果汁酵素的發酵工藝進行優化，得到最佳工藝條件：先加入0.15%酵母菌（溫度30 ℃、pH=3.5、發酵16 h），后加入0.5%干酪乳巧菌（溫度37 ℃、pH=3.5，發酵 24 h）。

對于酵素配方研究相對較少，楊婧娟等[16]以枸杞、蘆薈、山藥、山楂和薏苡仁為主要原料制備酵素，得到最佳配方為45.29%枸杞、10.00%蘆薈、10.00%山藥、24.71%山楂、10.00%薏苡仁。

為了縮短發酵時間及提高細胞營養物質溶出，有研究學者采用其他技術進行輔助發酵，如朱德艷等[17]利用超聲波輔助發酵米糠酵素，通過單因素試驗與正交優化設計得到最佳發酵工藝條件為超聲時間90 min，發酵溫度25 ℃，發酵pH 值為6.0，發酵時間為25 d。洪厚勝等[18]通過響應面設計對超聲輔助葡萄果渣酵素發酵進行優化，得到最優工藝條件為初始pH 值5.00，糖添加量8%，乳酸菌接種量12%，超聲時間60 min。

針對以上研究可以看出，近年來各研究學者利用不同的發酵原料發酵制備酵素，并對發酵工藝、配方及輔助發酵工藝進行了優化，說明現今酵素產品的發展已非常之快，諸多科研工作者對于微生物酵素產品的開發產生了極大的興趣，這將為今后酵素企業和產業的發展奠定良好的理論基礎，在一定程度上會推動產學研合作的發展。

2 酵素中微生物研究

由于酵素原料的不同，在發酵過程中微生物類型也不盡相同，但主要微生物為酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和霉菌[19]，對于酵素類產品微生物分離鑒定的研究也成為近年來的研究熱點。而目前國內對微生物酵素的研究處于起步階段，同時由于其發酵菌種多、周期長、組分復雜、條件難控等問題[20]，研究報道相對較少。

對于酵素中微生物的類型分析，Ai Leng Teoh 等[21]從紅茶菌酵素進行分離得到接合酵母。盧夢瑤等[22]通過以10 種酵素樣品為菌源，經分離純化、產酸定性和定量試驗，獲得1 株高產酸量醋酸菌，對其形態學、生理生化指標測定及16S rDNA 鑒定，確定其為芝庇儂醋酸桿菌（Acetobacter cibinongensis）。Okada 等[23]從植物酵素中分離鑒定出來的微生物主要是酵母菌（接合酵母屬 Zygosaccharomyces spp．、畢赤酵母 Pichia spp．）、曲霉（米曲霉Aspergillus oryzae）、乳酸菌（明串珠菌Leuconostoc spp．）。Safak S 等[24]從紅茶菌酵素進行分離得到釀酒酵母。魏東東等[25]對紅樹莓酵素中的優勢菌進行了分離鑒定，篩選出4 種菌株：釀酒酵母、庫德畢赤酵母、盔形畢赤酵母、植物乳桿菌。由此可以看出，在酵素發酵過程中的起主要作用的微生物是酵母菌、醋酸菌、乳酸菌、霉菌，經過相互作用，使得酵素形成一個微生態整體。

目前，高通量測序技術由于具備靈敏度高、讀數長和效率高的特點，能更加真實的反映發酵食品中微生物群落定性及相對定量的遺傳信息[26-27]，已廣泛應用傳統發酵食品微生物體系的研究。凌空等[28]通過16S rRNA、pheS 基因和26S rRNA 測序方法分析了發酵6 月、12 月和18 月的果蔬酵素中的主要微生物類型。齊天翊[29]利用高通量測序技術對自制酵素不同發酵階段的微生物多樣性及群落結構動態變化進行了分析與比較。杜麗平等[30]利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術對木瓜酵素在自然發酵過程中微生物的多樣性及變化規律進行了研究，發現植物乳桿菌為優勢細菌，釀酒酵母和畢赤酵母為優勢酵母菌。Lee等[31]采用16S 和26S rRNA 序列分析法研究了一種植物酵素中的微生物多樣性，結果表明，L.homohiochii是優勢菌種；其它菌種的含量因含糖量不同而不同。隨著高通量測序技術的發展，逐漸彌補了傳統微生物分離鑒定方法的不足，但對于各類酵素中微生物的多樣性、物種豐度及群落結構動態變化規律的研究鮮有報道，因此，利用高通量測序技術觀測酵素發酵過程中的微生物動態變化將是今后研究的一個思路，以便為今后酵素發酵過程中菌群結構的調控提供參考。

3 微生物酵素的相關代謝物質研究

由于微生物作用，酵素在發酵過程中會產生一些新的營養物質和活性成分。近年來對于酵素中的相關代謝產物的變化研究也成為熱點對象，比如各類酶、總酚、總酸、總糖、還原糖、有機酸、pH 值、總蛋白、總黃酮、氨基酸等物質，引起了科研學者極大的興趣，關于酵素中代謝物質的變化研究也是非常之多。

酵素的俗稱為“酶”，人體機能的維持與酶密切相關，SOD 酶、脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶是酵素中主要的功效酶，所以酵素中酶活性的測定必然是重中之重。陳爽等[32]對液狀水果酵素中酶活力進行了測定，發現SOD 酶活性最高，蛋白酶次之，淀粉酶和脂肪酶活性較低。邵穎等[33]研究植物酵素發酵過程中SOD 酶、蛋白酶、纖維素酶的動態變化，發現纖維素酶有明顯的提高。張靜雯[34]通過比較添加菌種和未添加菌種的蘋果酵素中酶的活力，發現SOD 酶和脂肪酶活性分別降低了22.39%和69.49%，淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活性分別提高了50%、85.71%和54.19%。

在發酵過程中會產生新的代謝產物，包括糖、有機酸、氨基酸及香氣成分等，有機酸是酵素主要的呈味物質，近年來研究也相對較多，如Okada 等[35-36]從一種植物酵素中分離出多種新型寡糖。Arun 等[37]測定了環保酵素不同發酵階段的有機酸含量，且酵素食品中有機酸來源于果蔬原料及有益菌的代謝產物。蔣增良[38]對發酵一年的樹莓酵素、藍莓酵素和葡萄酵素的有機酸種類和含量及樹莓酵素相關代謝產物的變化規律進行了研究。楊小幸等[39]對蘋果酵素天然發酵過程中pH 值、總酸、有機酸（乳酸、醋酸、蘋果酸）、糖類（蔗糖、葡萄糖、果糖）、乙醇、總酚含量和DPPH 自由基清除率的變化規律進行了研究。Shi 等[40]在天然葡萄酵素中檢測到102 種香氣成分，包括酯、醇、酮、烷烴、酸等芳香物質。張夢梅等[41]對23 份酵素樣品中有機酸的種類及含量進行了分析，發現酵素主要有機酸為草酸、蘋果酸、乳酸和乙酸。Braga 等[42]發現，蘋果汁中主要芳香化合物是乙醛，而蘋果酵素中主要是3-甲基-1-丁醇。郭紅蓮等[43]研究發現枸杞酵素在天然發酵過程中pH 值、可溶性固形物和總糖含量不斷下降，可滴定酸逐漸上升，還原糖先升后降，并鑒定出64 種風味物質，包括酯類、醛類、種酮類、醇類、酸類、芳香雜環類。Marisa 等[44]從諾麗酵素中分離出來了歐文氏菌和葡萄糖桿菌，并檢測到有機酸種類有乙酸，抗壞血酸，脫氫抗壞血酸，半乳糖醛酸，丙二酸，琥珀酸和酒石酸。Ghosh 等[45]研究表明乳酸菌產生的酶類及有機酸使大米中酚類物質溶出并呈游離態，導致發酵過程中總酚含量上升。程勇杰等[46]研究發現柘果酵素在天然發酵過程中蛋白質含量逐漸上升，在發酵過程中共含有16 種氨基酸，且含量差異較大。陳小偉等[47]對草莓酵素發酵過程中氨基酸變化進行了分析，總氨基酸含量有明顯上升，其中含量最高的是天冬氨酸和谷氨酸。

以上研究表明，在酵素中含有的營養物質、活性成分及各種酶類物質確實極為豐富，酵素原料的不同會導致在各類酵素發酵過程中相關代謝產物的變化也不盡相同，發酵過程中代謝產物的變化與微生物的多樣性和豐富度變化及酵素的保健功能性評價息息相關，它們之間肯定存在著某種聯系，如何探索出代謝物質的變化與微生物及保健功能之間的關系或者機理將是今后科學研究中的熱點和難點問題。

4 微生物酵素的生物活性研究

酵素中富含的營養物質和活性成分使得其具有多種功能特性，但是由于酵素的多種功能作用的屬實情況一直受到人們的疑惑，因此國內外諸多學者都對其功能效果有很大的研究興趣。

4.1 抗氧化功能研究

由于酵素中總酚、總黃酮及SOD 酶等物質的存在，能夠清除機體內自由基，對于酵素的抗氧化性能的研究相對較多，Liao 等[48]利用乳酸菌發酵芒果汁，發現芒果汁酵素中的有機酸種類、酚類化合物等都比芒果原汁有所增加，并且清除DPPH 自由基能力也顯著提高。胡肖利[49]采用電化學方法研究了中草藥功能酵素復配前后的抗氧化活性，發現功能酵素復配品對羥基自由基、超氧自由基、脂質過氧自由基、DPPH 自由基的清除能力顯著提高。馮彥君[50]通過體外模擬試驗，發現麥苗酵素粉及其代餐粉在體外胃消化4 h 后，消化液總酚釋放量分別是初始時的2.74 倍和2.75 倍，SOD 活力分別下降了45.54%和38.99%，但總酚釋放量的增加彌補了SOD 的失活，使得消化液抗氧化性明顯提高。周偏等[51]研究發現諾麗酵素的總還原能力、DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥基自由基清除能力分別高達0.593、71.22%、76.21%和58.64%。

4.2 降血脂及減肥功效研究

自從酵素產品問世，酵素的降血脂及減肥功效一直被廣泛關注，為證實效果到底如何，國內外科研學者也一直致力于驗證其降血脂及減肥功效。Wang 等[52]研究表明糙米酵素液能夠降低小鼠血脂水平、肝臟脂肪水平和動脈粥樣硬化指數，抑制輔酶A 還原酶活性，并有效促進總脂質與總膽固醇的排泄。郭爽[53]對敖東酵素的減肥功能進行了研究，發現敖東酵素可以有效抑制大鼠體重增長和脂肪積累。Revilla 等[54]研究表明糙米酵素具有一定的降膽固醇活性。有研究學者[55-56]發現糙米酵素能夠改善與Zucker 大鼠肥胖相關的一些炎癥反應，從而達到減肥效果。

對于酵素降血脂及減肥功效的機理研究相對復雜，相關研究還未見報道，可能是酵素中脂肪酶將攝入脂肪分解成脂肪酸，增強了機體吸收效果，再加上微生物作用，達到降血脂及減肥效果。

4.3 提高免疫力研究

細胞免疫活性與人類各種疾病密切相關，查閱國內外相關文獻，發現酵素產品具有一定的提高免疫力和抗腫瘤活性，為人類健康提供了保障。袁周率[57]的研究發現，糙米酵素能夠抑制缺氧/復氧處理誘導的海馬神經元細胞調亡，對其有保護作用。LU Ming 等[58]的研究表明，一種日本植物酵素能夠誘導細胞凋亡和延長H22 荷瘤小鼠壽命，具有抗腫瘤特性。Revilla 等[59]研究發現糙米酵素能夠誘導MOLT-4 細胞凋亡，并能誘導腫瘤壞死因子（TNF）-α 的表達對N13 膠質細胞施加免疫活化效果。

4.4 解酒與護肝功能研究

微生物酵素中的乙醇脫氫酶可以分解乙醇，降低谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和丙二醛等水平，從而達到解酒護肝的效果。劉加友[60]針對葛根酵素的解酒功能進行了研究，發現葛根酵素可以顯著延長小鼠醉酒潛伏時間，縮短醒酒時間，通過減緩胃腸吸收乙醇速度和加速乙醇降解代謝以降低機體血醇濃度，從而起到解酒防醉的功效。曲佳樂等[61]研究發現植物酵素可以延遲醉酒和縮短醒酒時間，降低血清中谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶水平，具有一定解酒護肝作用。

4.5 抑菌活性研究

微生物酵素產品本身具有抗菌活性，還可以促進白血球殺死致病菌，促進新細胞生成，具有一定的抑菌活性。王輝等[62]研究發現青梅酵素液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用。董銀卯等[63]研究顯示，膏狀及粉狀酵素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌有抑制作用，對痤瘡病原菌有明顯的抑制作用。

4.6 美容美白研究

微生物酵素含有的各種酶和一些物質能消解老化細胞，促進表皮細胞新陳代謝，清潔皮膚及去除油脂，使得皮膚細膩有光澤。Santamaría 等[64]研究發現糙米酵素能夠阻止角質細胞和表皮細胞脂質氧化，稀釋后有很好的皮膚相容性，表現出4.8±0.3 的防曬系數。田中清隆等[65]通過細胞試驗和人體試驗研究發現，李子酵素分解物Clairju 有效抑制了角化細胞的吞噬作用，顯著降低了皮膚黑素指數和色斑。

除此之外，還有許多微生物酵素的功能作用，比如改善腸胃功能[66]、治療腹瀉[67]、抗壓與抗疲勞[68]等。綜上所述，對于酵素的功能作用研究非常多，也證實了酵素的功效，可作為功能性食品供人們食用，從而調節人體的相關代謝，預防各類相關疾病的發生，對人類健康起到積極的作用，且酵素的保健功能研究將一直是我們研究的重點。

5 結語

國家藥監部門審核確認酵素完全遵照了“應用平安、效果確切、質量穩定、運用便當”這四大準繩，而且微生物酵素富含產酶微生物、多種營養物質和活性成分，也因此具有多種生物活性，酵素食品產業快速發展起來。

目前，微生物酵素在我國已開始盛行，各地科研院所根據當地特色食品資源逐步研發酵素產品，以期能將當地食品資源更好地利用起來，開發出多種功能性食品，推動當地食品產業的發展。以青藏高原特色植物資源為原料，研發微生物酵素食品，將豐富青藏高原特色食品資源系列產品，進一步推動青海省食品行業市場經濟的發展。