基于SPME-GC-MS分析熏制材料對熏雞腿揮發性風味物質的影響

劉登勇，趙志南，吳金城，鄒玉峰，王 逍，李明倩

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及發全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.江蘇省肉類生產與加工質量發全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

煙熏肉制品是典型的中華傳統熟肉制品，是指腌制或熟制后的肉，以煙熏、高溫氣體或固體等為介質熱加工制作而成[1]。煙熏肉制品一般采用富含纖維素、半纖維素和木質素的硬木進行熏制[2]。而我國北方，白砂糖熏制較普遍，且產品色澤誘人，風味獨特，其中以溝幫子熏雞、卓資山熏雞最為著名[3-4]。還有部分煙熏肉制品為追求獨特風味而添加一些茶末、稻糠、橘皮等熏材，例如徽州地區傳統的名菜茶熏雞[5]。

近年來，關于煙熏風味的研究主要集中于果木等含纖維素較多的熏制材料以及煙熏液等。周緒霞等[6]研究了栗木、櫸木和桂圓木對煙熏鰹魚揮發性風味物質的影響，發現栗木熏制的鰹魚煙熏味較明顯，桂圓木熏制品風味更豐富，而櫸木熏制品含氮類物質含量相對較高。Kosowska等[7]利用氣相色譜-嗅覺測量法和香氣提取物稀釋分析法對煙熏腰肉（分別采用山毛櫸、榿木熏制）的關鍵揮發性風味物質進行鑒定，發現酚類物質是煙熏過程產生的典型物質，醛類物質是肉本身在加熱過程中產生的物質。Pino等[8]從稻殼煙熏液中分離鑒定出93 種化合物，其中2-甲氧基苯酚、4-甲基-2-甲氧基苯酚、2-糠醛等14 種酚類和呋喃類物質是主要氣味活性化合物。但目前關于多種材料混合熏制的研究較少，特別是糖熏對肉制品風味物質影響的研究鮮有報道。

本實驗以白砂糖、果木屑、紅茶末作為煙熏材料熏制的雞腿為研究對象，通過固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀技術分離鑒定煙熏雞腿肉的風味物質，采用面積歸一化法，結合相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV），確定不同熏制材料的主體風味活性物質，為煙熏材料的選擇和優化、熏雞的生產加工及風味評價提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍雞腿（180～200 g，品種為AA雞）、蘋果木屑、紅茶末 市購；白砂糖 南京甘汁園糖業有限公司；食鹽 大連鹽化集團有限公司。

C7～C30正構烷烴標準品 美國Supelco公司；乙醇（色譜純）、環己酮標準品 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C型GC-MS聯用儀 美國發捷倫公司；SPME裝置、20 mL頂空鉗口樣品瓶、75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司；PL203型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SY-1230型恒溫水浴槽 上海滬粵明科學儀器有限公司；C-MAG HP10電熱板 德國IKA集團。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

以雞腿肉為原料，解凍清洗后，用5%食鹽水煮制30 min，瀝干湯汁后熏制。將不銹鋼桶放到電熱板上加熱，以白砂糖、蘋果木屑、紅茶末作為基礎熏制材料，按照完全隨機組合共分為7 組（木熏組、茶熏組、糖熏組、糖-木熏組、糖-茶熏組、木-茶熏組、糖-木-茶熏組），每組按等質量比各稱取24 g，放入不銹鋼桶底。待熏制材料中心溫度達到270 ℃后，開始熏制樣品，熏制時間5 min。將得到的樣品冷卻后真空包裝，并置于-18 ℃貯藏備用，以未熏制的雞腿作為對照組。

1.3.2 風味物質分離

揮發性物質富集：將冷凍熏雞樣品置于4 ℃條件下緩慢解凍12 h，稱取4 g樣品（雞皮與雞肉質量比1∶3）轉移至20 mL頂空瓶中，快速用聚四氟乙烯隔墊迅速封口。將頂空瓶置于50 ℃水浴條件下預熱10 min，55 ℃水浴條件下用SPME萃取針（已活化）頂空萃取45 min后，將萃取針插入GC進樣口進行解吸，解吸溫度250 ℃、解吸時間4 min。

GC條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；前進樣口溫度250 ℃；載氣（He）流速1.0 mL/min；不分流模式進樣；程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至70 ℃，以5 ℃/min升至180 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃并保持5 min。

MS條件：電子電離源；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z 30～550。

1.3.3 風味物質鑒定

熏雞風味物質鑒定結果通過計算機譜庫（Nist/Wiley）進行檢索，并配合手動檢索校對信息，正反匹配度均大于800（最大值為1 000）或有一個匹配度大于900的成分作為定性結果。采用與樣品分析相同的色譜條件，以C7～C30正構烷烴作為標準，計算揮發性化合物的保留指數。各化合物峰面積由軟件系統計算。利用面積歸一化法計算各揮發性成分在熏雞揮發性氣味物質中的相對含量。參考劉登勇等[9]的方法計算各成分的ROAV，并據此確定主體風味成分。

1.4 數據處理

采用Excel軟件和SPSS 19軟件中的單因素方差分析（ANOVA）法和Duncan多重比較法對數據進行處理與分析，結果以表示，P＜0.05，差異顯著。并采用SPSS 19.0軟件進行GC-MS數據的主成分分析。每個實驗獨立重復3 次。

2 結果與分析

2.1 SPME-GC-MS檢測結果及ROAV鑒定關鍵性風味物質

采用SPME結合GC-MS提取熏雞腿肉中的揮發性風味物質。如表1可知，熏雞腿中共鑒定出92 種化合物，包括烴類22 種、醇類7 種、醛類13 種、酮類6 種、酚類8 種、呋喃類15 種、含氮/硫化合物13 種、醚類4 種、酯類3 種、酸類1 種。不同煙熏組中檢測到的揮發性化合物存在顯著差異（P＜0.05），對照組中相對含量最高的為烴類化合物（43.44%）；茶熏組中相對含量較高的為含氮/硫類化合物（13.36%），是其他煙熏組相對含量的4.9～111 倍；木熏組中相對含量較高的物質有愈創木酚（12.75%）、2-呋喃甲醛（40.45%）、5-甲基-2-呋喃甲醛（11.43%），其中，愈創木酚的相對含量是其他煙熏組的2.6～45.6 倍；糖熏組中相對含量較高的物質為2-呋喃甲醛（75.30%）、5-甲基-2-呋喃甲醛（11.01%）?；衔锵鄬康母叩筒⒉荒苷f明其對風味的貢獻度大小[10]，還需結合各揮發性成分香味閾值，進行ROAV分析。通過查詢，共找到47 種揮發性風味物質的香味閾值[11-13]（表2），因此，本實驗只對查到閾值的化合物進行分析。其中，飽和烷烴類物質由于感覺閾值很高，幾乎不產生明顯嗅感；16 個碳原子以上的醇類、醛類、羧酸類和酯類等物質在食品中正常的濃度范圍內也幾乎沒有氣味[14]。這些化合物雖然相對含量很高，但本研究目的是確定關鍵風味化合物，故此處不作詳細分析。

烴類（除萜烯類化合物）主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂。如表2所示，ROAV大于1的烴類化合物只有1 種，Shahidi等[15]認為無論飽和烴還是不飽和烴在食品風味形成過程中發揮的作用均較小。D-檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣[16]，是茶熏組和木-茶熏組烴類物質中的主要風味成分（ROAV≥1），對其他煙熏組和對照組的風味也有一定的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。

表1 熏雞腿中揮發性物質相對含量及種類Table 1 Relative contents and types of volatile compounds in smoked chicken thighs

續表1

飽和脂肪醇的閾值較高，對整體風味貢獻相對較小，而不飽和醇的閾值相對較低，對風味貢獻較大[17]。由表2可知，ROAV不小于1的醇類只有1-辛烯-3-醇，且ROAV在8.24～57.72范圍內，是對照組和煙熏組主要的風味成分，對樣品整體風味具有較大貢獻。1-辛烯-3-醇是由亞油酸或其他多不飽和脂肪酸自動氧化形成[18]，主要呈現蘑菇味、泥土味和柑橘、玫瑰氣味[19-20]，還可增強肉中的脂肪香味。

醛類物質具有較強的揮發性，濃度高且閾值較低，是熟肉中重要的風味化合物。有研究報道己醛、辛醛、壬醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等醛類物質是煮雞肉中主要的氣味化合物[21]。由表2可知，ROAV不小于1的醛類有己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛等低碳原子直鏈飽和脂肪醛以及(E)-2-辛烯醛等烯醛，表明它們在對照組和煙熏組雞腿肉香氣中起重要作用。前期研究表明，醛類主要來源于脂質氧化[22]。例如，己醛和庚醛主要由亞油酸和花生四烯酸的氧化產生[23]，而辛醛和壬醛則由油酸氧化產生[24]。己醛對木-茶-糖熏組的風味貢獻最大，具有草本風味[25]，癸醛的嗅覺閾值較低，僅為0.1 ng/g，在樣品風味中起重要作用（ROAV在14.12～100范圍內）。辛醛和壬醛在茶-糖熏組中ROAV分別達到63.66和100，說明對該組的風味具有重要貢獻。庚醛具有強烈而不愉快、粗糙刺鼻的氣味，在茶熏組中ROAV為12.97，貢獻較大。與對照組相比，茶熏組、木-茶-糖熏組中醛類風味物質（ROAV≥1）中的戊醛貢獻較大，具有果香和面包香[26]。除直鏈飽和脂肪醛，烯醛也是雞肉脂肪受熱時的特征香氣呈味物。(E)-2-辛烯醛對7 組樣品風味均有貢獻。木-茶組和木-茶-糖組的醛類風味物質（ROAV≥1）中的(E)-2-壬烯醛貢獻較大，其屬于不飽和烯醛，賦予雞腿肉脂肪香氣。

酮類物質可通過脂肪氧化降解生成，也可能來自美拉德反應[27]。如表2所示，2-壬酮在對照組風味中具有重要的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。2,5-辛二酮的ROAV較高，在3.36～43.03范圍內，對煙熏雞腿的風味有一定貢獻。酮類物質主要是在雞腿肉高溫煮制過程中產生，而在煙熏階段，酮類物質可作為中間產物通過氧化降解形成其他物質[28]。由于酮類在熏雞腿中種類較少、相對含量低且閾值比部分醛類高，因此，對熏雞腿風味貢獻不突出。

酚類物質被描述為煙熏香、焦香味，是煙熏肉制品特殊的揮發性風味物質，主要由煙熏材料中的木質素分解生成[29]。煙熏過程中，木質素首先分解為4-乙烯基愈創木酚，近而形成愈創木酚的同系物，如4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚等，這些化合物是肉制品傳統煙熏風味的主要來源[30-31]。由表2可知，含有蘋果木或紅茶末的煙熏組中均檢測到愈創木酚，愈創木酚是木熏組中貢獻最大的風味物質（ROAV=100），這也可在木-茶、木-糖、木-茶-糖熏組中得到驗證（ROAV分別為74.55、11.67、5.47），說明愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚是木熏最主要的風味物質，這與Kosowska等[7]研究的酚類物質是木熏過程產生的典型風味物質結果一致。愈創木酚也是茶熏組中貢獻較大的風味物質（ROAV＝11.02），這可在木-茶、茶-糖、木-茶-糖熏組中得到驗證（ROAV在5.47～74.55范圍內），說明愈創木酚也是茶熏主要的風味物質，同時4-甲基愈創木酚對茶熏組風味有一定的修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。而對照組和糖熏組中未檢測到酚類物質，進一步說明酚類物質是木熏和茶熏產生的主要風味物質，與煙熏材料中是否存在木質素有關。

呋喃類物質是糖裂解反應和美拉德反應的產物，是熏雞風味中重要的雜環化合物。如表2所示，2-戊基呋喃對8 組樣品風味均有較大貢獻（ROAV≥1），2-戊基呋喃是一種衍生自亞油酸和其他n-6脂肪酸的非羧基化合物，具有相對較低的閾值，呈植物芳香味[32]，是雞肉加熱過程中產生的主要風味物質[33]。所有含木屑或白砂糖的煙熏組中均檢測到2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛（ROAV≥1），對照組和茶熏組中未檢測到。2-呋喃甲醛是糖熏組中貢獻最大的風味物質（ROAV=100），在含有白砂糖的煙熏組中，如木-糖熏組、茶-糖熏組、木-茶-糖熏組中貢獻較大（ROAV分別為61.56、98.2、100），5-甲基-2-呋喃甲醛對熏雞腿整體風味貢獻趨勢與2-呋喃甲醛相似，說明2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛是糖熏產生的最主要風味物質。2-呋喃甲醛可能是由熏制過程中蔗糖熱解產生[34]，通過煙氣吸附滲透到熏雞中，賦予雞肉焦糖香氣，與劉君等[35]利用糖熏工藝熏制雞肉的結果一致。2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛在木熏組中貢獻也較大（ROAV分別為23.79、5.38），可在木-茶熏組中得到驗證（ROAV為53.11、8.17），說明2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛也是木熏產生的主要風味物質。同時，2-乙?；秽尸F甜香以及青香味，在熏雞腿風味中起著一定的協調、平衡的作用。綜上2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛等糠醛類是糖熏風味的主要貢獻者，對木熏風味構成也有一定貢獻。

含氮化合物一般有烤香香氣特征，主要來源于美拉德反應，含硫化合物對肉的基礎香味有重要貢獻[36]。由表2可知，二甲基二硫醚只在對照組風味中有較大貢獻（ROAV≥1），對肉香味形成具有重要作用，而實驗組中未檢測到二甲基二硫醚，可能是被煙熏產生的酚類、呋喃類等化合物的濃烈煙熏味所湮沒。與其他樣品組相比，茶熏組中新增了含氮化合物2,6-二乙基吡嗪，占茶熏組總揮發性物質含量的13.36%。2,6-二乙基吡嗪的香味特征主要為堅果、泥土和類似土豆風味[37]，且只對茶熏組的風味有貢獻（ROAV≥1），說明2,6-二乙基吡嗪是茶熏的主體風味物質。

此外本實驗還檢出一定含量的醚類、酸類、酯類化合物，對熏雞腿風味的形成具有一定的影響。1-甲氧基-4-甲基-苯對木熏組雞腿風味有一定貢獻（0.1≤ROAV＜1）。乙酸感覺閾值高達22 000 ng/g，還可與醇類物質反應生成酯類，因此對整體風味貢獻不大。乙酸乙酯和乙酸己酯在對照組中主要起到輔助修飾作用（0.1≤ROAV＜1），呈現甜香、清香香氣[38]。以上這些物質主要對熏雞腿風味起到協調、平衡的作用。

2.2 關鍵揮發性化合物主成分分析

為進一步研究不同熏制材料對熏雞腿特征風味的影響，選取對熏雞腿揮發性風味貢獻較大的物質進行主成分分析。醛類、醇類和酮類等化合物對熏雞風味有重要貢獻，它們主要是由肉本身在加熱過程中發生脂肪氧化降解等反應形成[39]，故此處不做分析。由表2可知，愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚在含有木屑、紅茶末的煙熏組中ROAV均較高，對風味貢獻較大，故選取這4 種酚類物質。呋喃類物質中，2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛、2-戊基呋喃在含有白砂糖、木屑的煙熏組中ROAV較大，故選取這3 種呋喃類物質，而2,6-二乙基吡嗪只在茶熏組中ROAV較大，對茶熏組風味貢獻最大。這些揮發性化合物以不同的比例分別形成了熏雞腿獨特風味，因此，選取以上8 種揮發性風味物質進行主成分分析。

圖1 主要揮發性風味物質和樣品主成分分析圖Fig. 1 Principal component analysis plot for selected volatile fl avor compounds of smoked chicken thighs

如圖1所示，根據特征值大于1的原則，共提取到2 個主成分，反映了原始數據提供信息總量的80.7%。木熏組、木-茶熏組等熏材中含有木屑的煙熏組中，愈創木酚、4-乙基愈創木酚等酚類化合物貢獻較大，5-甲基-2-呋喃甲醛等呋喃類物質也有貢獻；糖熏組、木-糖熏組等熏材中含有白砂糖的煙熏組，主要貢獻物質為2-呋喃甲醛和5-甲基-2-呋喃甲醛等呋喃類化合物；2-戊基呋喃是對照組雞肉產生的揮發性化合物，2,6-二乙基吡嗪在茶熏組中貢獻較大。

3 結 論

本實驗采用SPME結合GC-MS聯用儀，并通過計算“ROAV”的方法，對果木屑、紅茶末、白砂糖熏制的雞腿進行測定。結果表明，從熏雞腿中共鑒定出92 種揮發性物質。根據ROAV結果并借助主成分分析法發現，2-呋喃甲醛和5-甲基-2-呋喃甲醛等糠醛類化合物是糖熏最主要的風味物質；愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚等愈創木酚類物質是木熏最主要的風味物質，2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛等糠醛類物質也有較大貢獻；2,6-二乙基吡嗪等含氮化合物和愈創木酚類化合物是茶熏主要的風味物質。研究結果為后續深入研究煙熏肉制品風味形成機理、指導風味品質精準調控等提供依據。